Serial passaging de metástases pulmonares no vivo enriquece de potencial metastático
O PDX linha de WU-BC3 foi gerado pelo engrafting de mama, tumor de células de um paciente com metástases TNBC em humanizado mamária de bolsas de gordura (MFPs) de NOD/SCID ratos ratos.26,27 nós projetamos essas células tumorais para expressar estavelmente a Luciferase vermelha do besouro (CBR-Luc), mCherry, e um shRNA específico para p53 (shA2) para criar a linha PDX BC3_A2 (anteriormente conhecida como BC3-p53KD28) (Fig. suplementar. 1a). Demonstrámos que as células tumorais metastizavam-se do MFPs para locais fisiologicamente relevantes, incluindo pulmões, fígado, osso, cérebro e gânglios linfáticos.28 as metástases pulmonares (P0) foram isoladas a partir de ratos replicados, agrupadas e gravadas nos MFPs de ratinhos receptores. As metástases pulmonares resultantes (P1) foram isoladas, agrupadas e gravadas em MFPs de ratinhos adicionais. As metástases pulmonares destes ratinhos (P2) foram também recolhidas e agrupadas (Fig. suplementar. 1b). Realizamos imagens de bioluminescência (BLI) de pulmões, ossos e fígados na necropsia para quantificar a magnitude relativa da metástase em cada passagem (Fig. suplementar. 1c). Serial passaging enriched for tumoral cells with increased capacity to metastasize to all sites(Supplementary Fig. 1d-f, h) e exigia que os ratos fossem eutanasiados mais cedo (Figo suplementar. 1i). Em contraste, tumores de passagem em série entre MFPs não resultaram em metástases pulmonares aumentadas (Fig. adicional. 1g), indicando que a aquisição de maior capacidade metastática não foi simplesmente uma consequência de tumores de passagem serial in vivo. Além disso, as células tumorais com capacidade metastática aumentada não exibiram um aumento significativo nas propriedades de crescimento quando isoladas a partir de MFPs e colocadas de volta no MFPs de ratos receptores (Figo suplementar. 1j). Em conjunto, estes resultados demonstram que a transmissão em série de células tumorais dos pulmões para o MFPs neste modelo enriquece para o potencial metastático, mas não para a localização de órgãos específicos.
a expressão do gene mesenquimal é reduzida em metástases pulmonares em relação aos tumores MFP
para identificar alterações nos padrões de expressão genética que acompanham a metástase, realizámos sequenciação do ARN (RNAseq) em metástases pulmonares (P0 e P2) e tumores MFP (P0 e P2) (Fig. Quadro 1). Depois de subtrair RNAseq lê mapeamento para a transcriptoma do mouse, apenas as leituras de transcrição humana foram usadas para análises a jusante. A Principal Análise de componentes (PCA) revelou uma menor discórdia entre replicados biológicos com a repetição de passaging in vivo, como replicados biológicos de amostras de tumores P2 agrupados mais estreitamente uns com os outros do que com outras subpopulações analisadas (Fig. 1b). A análise do enriquecimento com Gene Set (GSEA) revelou que a EMT foi a via mais significativamente desregulada tanto nas metástases pulmonares P0 como P2 em relação aos tumores do NMF (Fig. 1c). A sinalização TGF-β, que regula o EMT, também foi significativamente regulada para baixo em ambas as metástases pulmonares P0 e P2(Fig. 1c).
PDX as assinaturas de metástases pulmonares identificam genes des-regulamentados em metástases. uma representação esquemática de tumores MPF e metástases pulmonares isolados para RNAseq. b principal component analyses (PCAs) from RNAseq data generated from MFP tumors and lung metastases used in this study. Cada ponto de dados representa uma amostra de um rato individual. c análise da via GSEA na assinatura de metástase pulmonar enriquecida (P2); os processos regulados top 5 down (azul)- e up (vermelho)são mostrados. NES, pontuação de enriquecimento normalizada. As casas indicam FDR 0.1 para efeitos estatísticos. As parcelas de enriquecimento para a transição mesenquimal epitelial (EMT) e a sinalização TGF-β Para P0 e P2 são apresentadas no painel da direita. p 0, 001 para EMT e TGF-β sinalização em P0 e P2. d qRT-PCR analysis of vimentin expression in BC3_A2 MFP tumors and metastatic subpopulations isolated from lung. Testes T emparelhados, p = 0, 02 para P0 lung, p 0, 001 para P2 lung. Cada ponto de dados representa um rato. As barras de erro representam SEM de réplicas biológicas. Ver também a figura complementar. 2. a coloração IHC foi realizada nas secções tecidulares indicadas utilizando um anticorpo que reconhece a forma humana específica de vimentina. Barras de escala indicam 100 µm. f parcela de queda de água que mostra a expressão de genes EMT em metástases pulmonares P0 e P2 em comparação com tumores MFP correspondentes. os valores de p são apresentados no quadro Complementar 1. Amostras de, pelo menos, três independente ratos foram incluídos para RNAseq análises
Quantitativa em tempo real (anual-PCR) foi realizada para monitorar a expressão de vimentin, um mesenquimais marcador, na MFP tumores e metástases pulmonares toda a série passaging. A expressão da vimentina exibiu um padrão dinâmico com maior expressão nos tumores do MFP em relação às metástases pulmonares correspondentes em cada passagem(Fig. 1d) e metástases hepáticas em P0 (Fig. suplementar. 2a). Os níveis de proteínas da vimentina recapitularam este padrão dinâmico(Fig. 1e). Genes EMT adicionais também foram desregulados em metástases pulmonares em relação aos tumores MFP correspondentes(Fig. 1f). A expressão do marcador mesenquimal CDH2 (o gene que codifica N-cadherin) seguiu o mesmo padrão que a vimentina (Figo suplementar. 2b), enquanto que a expressão do marcador epitelial CDH1 (o gene que codifica E-cadherin) exibia uma tendência inversa (Figo suplementar. 2c). Os fibroblastos estromais humanos Co-gravados foram limpos na altura da colheita do tumor (Figo suplementar. 3a-f), descartando a possibilidade de que eles contribuíram para a expressão de marcadores mesenquimais em tumores MFP. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que os tumores degradam a expressão dos genes mesenquimais uma vez estabelecidos em locais metastáticos.
Determination of library complexity for high throughput gain of function screen
a high throughput gain-of-function (GOF) screen was designed to identify functional drivers of metastasis from our P2 lung metastases signature. HOXA1,um conhecido motorista de metástases, 29 serviu como um controle positivo para a otimização de tela, e GFP foi usado como um controle negativo. As células BC3_A2 foram transduzidas com lentivírus codificando HOXA1 ou GFP, e as células tumorais infectadas foram misturadas em diferentes proporções (Figo suplementar. 4a). Populações mistas de células tumorais foram então gravadas no MFPs de ratos receptores, e o BLI foi usado para marcar metástases pulmonares no momento da necropsia (Figo suplementar. 4b). Em um segundo conjunto de experimentos, o condutor metastático ID19 foi usado em combinação com GFP, mas neste caso populações mistas de células tumorais foram injetadas na veia da cauda de ratos receptores para modelar os estágios finais de metástase (Figo suplementar. 4c). Um aumento significativo no fluxo de fótons foi observado a partir de tumores com uma razão HOXA1: GFP ou ID1: GFP de 1:10. Estes testes de complexidade demonstraram que um condutor de metástase de boa-fé poderia ser detectado na nossa tela se combinado com 9 quadros de leitura abertos não-driver (ORFs), mas um conjunto de um motorista com 19 Não-drivers mascarou a nossa capacidade de detectar o motorista. Com base nestes resultados, limitámos o tamanho da nossa piscina a 12 ORFs.
de Alta taxa de transferência de ganho-de-função de triagem in vivo identifica candidato funcional drivers de TNBC metástase
Para determinar qual dos upregulated genes a partir de P2 metástase pulmonar assinatura foram capazes de conduzir a metástase pulmonar, nós projetamos personalizado com código de barras de lentivirus de bibliotecas de codificação as ORFs de 230 genes que foram mais altamente upregulated metástases no pulmão. Os ORFs foram expressos individualmente em células BC3_A2, de modo que cada linha celular expressa uma única ORF, as células foram então agrupadas em grupos de 12, e os grupos foram implantados nos NMF de ratinhos receptores (n = 10 ratinhos por pool, Fig. 2a). Um plasmídeo de controle expressando GFP foi incluído em cada conjunto para medir metástases intrínsecas neste modelo TNBC. Cada ORF foi associado com um código de barras de DNA único. Um sedimento de referência de células agrupadas foi congelado para confirmar a representação igual de cada ORF no momento da implantação do tumor. Treze semanas foi escolhido como o endpoint do estudo porque HOXA1, mas não tumores expressando GFP, metastizado para o pulmão por este momento (Fig. suplementar. 5a). Treze semanas após o enxerto, os pulmões foram submetidos a BLI ex vivo (Fig. suplementar. 5a), lesões metastáticas foram isoladas, e DNA genômico (gDNA) foi extraído e usado como um modelo para qPCR para amplificar regiões únicas de código de barras associadas a cada ORF (Fig suplementar. 5b). Tumores MFP também foram isolados e submetidos a estas análises(Fig. 2a). A representação de cada ORF codificado no MFP em relação à amostra de referência foi determinada para cada pool(Fig. 2b; figos suplementares. 5c, d). A representação no pulmão foi então normalizada para o enriquecimento em MFPs vs. A referência (Fig. 2b, c). Os condutores de metástases segregaram-se em três grupos, incluindo os enriquecidos em pulmões e em MFPs (Fig. 2b, quadrante superior direito e Figo suplementar. 5c), enriquecidos exclusivamente em PFF (Fig. 2b, quadrante inferior direito) e enriquecidos exclusivamente em pulmões (Fig. 2b, quadrante superior esquerdo e Fig. 2c). As células que expressam GFP foram enriquecidas em metástases pulmonares em algumas das piscinas e a pontuação média de enriquecimento para GFP no pulmão foi de aproximadamente 5 (Figo suplementar. 5e). Portanto, nós usamos isso como um corte de pontuação de enriquecimento para definir um verdadeiro sucesso em nossa tela e identificamos 44 genes que foram seletivamente enriquecidos em metástases pulmonares em relação aos tumores primários. Estes sucessos foram classificados por enrichment score (Fig. 2C E quadro complementar 2). Entre os cinco maiores sucessos, CEACAM5 foi o único cuja expressão em tumores primários foi encontrada para prever a baixa sobrevivência em pacientes com câncer de mama (Figo suplementar. 6a). Portanto, investigamos ainda mais o papel funcional do CEACAM5 na metástase do câncer de mama.
high throughput-of-function screening in vivo identifies functional drivers of metastasis. um formato esquemático que representa o formato usado para a tela de ganho de função (GOF). Ver também a figura complementar. 5. ORF, Abre o quadro de leitura. Dez ratos foram implantados em cada grupo. B parcela de dispersão que mostra a representação relativa de cada ORF em tumores NMF após normalização para o eixo x e nos pulmões em relação aos tumores NMF (eixo y). O método ΔΔCT foi utilizado para quantificação dos dados qPCR. O CEACAM5 é mostrado a vermelho. Genes c enriquecidos em metástases pulmonares, mas não tumores MFP foram classificados em ordem decrescente de enriquecimento no pulmão. A linha pontilhada indica corte da pontuação de enriquecimento. Ver também a figura complementar. 5 e Quadro Suplementar 2
a Confirmação do avançado CEACAM5 expressão adicionais metastático PDX modelos
descobrimos que CEACAM5 expressão foi dinamicamente regulamentado como metastático subpopulações foram em série passaged entre os pulmões e MFPs in vivo (Fig. 3-a), confirmando os resultados da RNAseq(quadro suplementar 1 e Figo suplementar. 6b). Da mesma forma, a expressão CEACAM5 era maior no fígado (Fig. suplementar. 7a) e cérebro (Fig. suplementar. 7B) metástases em relação aos tumores MFP correspondentes. Os níveis de proteína CEACAM5 também foram mais elevados nas metástases pulmonares em relação aos tumores do MFP(Fig. 3b). O aumento CEACAM5 expressão em lesões metastáticas não era dependente de p53 silenciar neste PDX linha, como pulmão metástases do isogenic PDX linha de expressar tipo selvagem p5326,30 também apresentado maiores níveis de expressão de CEACAM5 (Complementar Fig. 7c).
CEACAM5 é upregulated em metástases, e sua expressão é inversamente correlacionada com a de vimentin em PDX modelos de TNBC. uma expressão do CEACAM5 em tumores MFP e lesões metastáticas de ratinhos gravados com tumores BC3_A2 foi determinada pelo qRT-PCR. Testes T emparelhados, p 0, 001 para P0 lung, P2 MFP tumor, e P2 lung. Cada ponto representa um rato individual. As barras de erro representam SEM de réplicas biológicas. Ver também a figura complementar. 7. os tumores B MFP e metástases correspondentes de ratinhos gravados com tumores BC3_A2 foram analisados pela IHC utilizando um anticorpo CEACAM5. Barras de escala indicam 100 µm. a expressão C do CEACAM5 em tumores MFP e lesões metastáticas de ratinhos gravados com tumores PIM001-P foi determinada pelo qRT-PCR. Os dados são apresentados numa escala de log. Teste t emparelhado, p 0,001. Cada ponto representa um rato individual. As barras de erro representam SEM de réplicas biológicas. d tumores MFP e metástases pulmonares correspondentes de ratinhos gravados com tumores PIM001-P foram analisados pela IHC utilizando um anticorpo CEACAM5. Barras de escala indicam 100 µm. E, f IHC de secções seriais de tecidos tumorais de ratinhos gravadas com BC3_A2 (e) ou PIM001-P (f) manchadas com anticorpos específicos para o CEACAM5 (Painel superior) ou a vimentina. Barras de escala indicam 100 µm. g A expressão do CEACAM5 (Painel superior) ou da vimentina (Painel inferior) foi determinada num painel de linhagens celulares de cancro da mama. As barras de erro representam SEM de triplicados técnicos. h IHC foi realizado para monitorizar p38 fosforilado em tumores MFP e metástases pulmonares de ratinhos BC3_A2. Barras da escala de indicar 100 µm
Um segundo conjunto de PDX modelos de TNBC (PIM001) foram avaliados para determinar se o aumento na CEACAM5 em lesões metastáticas era uma propriedade geral de metástase. O PIM001-P foi estabelecido a partir do tumor primário sem tratamento prévio de um doente com TNBC metastático, enquanto que o PIM001-M foi estabelecido a partir da metástase dérmica do mesmo doente. As células tumorais PIM001-P foram projetadas para expressar tanto CBR-Luc quanto mCherry e, em seguida, gravadas no MFPs de ratos receptores. No momento da necropsia, tumores MFP e metástases pulmonares foram isolados. A expressão CEACAM5 foi aumentada em ambos os níveis de ARNm(Fig. 3c) e níveis de proteínas (Fig. 3d) em metástases pulmonares PIM001-P em comparação com tumores MFP correspondentes. Curiosamente, os níveis de proteína CEACAM5 foram mais elevados em tumores PDX MFP estabelecidos a partir da metástase dérmica do paciente (PIM001-M) em comparação com os tumores PDX MFP estabelecidos a partir de seu tumor mamário primário (PIM001-P) (Fig. complementar. 7d). Coletivamente, estes resultados demonstram que a elevação do CEACAM5 é uma propriedade comum das metástases em modelos PDX do TNBC.
CEACAM5 expression is inversamente correlated with vimentin expression and phosphorylation of p38
Because expression of CEACAM5 in PDX models was inversely correlated with expression of vimentin (Figs. 1d, 3a; figos suplementares. 2a e 7a, b), A imunohistoquímica (IHC) foi utilizada para monitorizar metástases pulmonares e tumores NMF para níveis relativos de vimentina e CEACAM5. Os níveis de proteínas estão correlacionados com os níveis de ARNm em ambos os modelos PDX (Fig. 3e, f). A expressão da vimentina também foi inversamente correlacionada com a expressão CEACAM5 em um painel de linhas celulares de câncer de mama (Fig. 3g). A proteína específica da serina/treonina, cinase p38alpha (também conhecida como MAPK14, a seguir denominada p38), é fosforilada durante a EMT.Curiosamente, o P38 fosforilado (activo) correlacionou-se com elevados níveis de expressão da vimentina nos tumores do NMF, e a fosforilação p38 diminuiu nas metástases pulmonares onde os níveis de vimentina eram baixos (Fig. 3h). Coletivamente, estes dados demonstram que a expressão CEACAM5 está inversamente correlacionada com a expressão de marcadores EMT em metástases pulmonares.
superprodução ectópica do CEACAM5 inibe a sinalização e a expressão TGF-β dos marcadores EMT
dado que a expressão CEACAM5 está inversamente correlacionada com o estado mesenquimal, avaliamos se o CEACAM5 teve um papel direto na regulação da expressão dos marcadores mesenquimais. Células BC3_A2 projetadas para produzir em excesso o CEACAM5 humano ou GFP como um controle negativo (Fig suplementar. 8a, b) foram examinados para a expressão de vimentina e CDH2/N-cadherina (marcadores mesenquimais) e CDH1/e-cadherina (marcador epitelial). A sobreexpressão do CEACAM5 levou ao aumento da expressão do CDH1 (Fig. suplementar. 8c) e diminuição da expressão do CDH2 (Figo suplementar. 8d) e vimentina(Fig. complementar. 8e). Além disso, a superprodução do CEACAM5 reduziu e atrasou a fosforilação mediada por TGF-β De SAPS em células BC3_A2 (Fig. 4a, c, Figo suplementar. 9A) e fosforilação p38 em ambas as células BC3_A2 (Fig. 4a, b, Figo suplementar. 9A) e células MDA-MB-231 (Fig. suplementar. 8F, Suplemento Fig. 9b). Por último, a sobreprodução da CEACAM5 atrasou a EMT induzida pela TGF-β, avaliada pela expressão e-cadherina e vimentina (Fig. 4D, Suplemento Fig. 9c). Estes resultados sugerem que o CEACAM5 regula negativamente a EMT e identifica uma função para o CEACAM5 na metástase do cancro da mama.
CEACAM5 superprodução downregulates expressão de mesenquimais marcadores e prejudica o TGF-β sinalização e prejudica o TGF-β sinalização. as células BC3_A2 concebidas para produzir em excesso a CEACAM5 ou a GFP foram cultivadas na presença ou ausência de 1 ng/ml TGF-β durante os períodos de tempo indicados. Os lisatos celulares foram submetidos a coagulação Ocidental para as proteínas indicadas. histograma b, C mostra a mudança de dobra (escala log) no estado de fosforilação de p38 (b) ou Smad2/3 (C) em comparação com o ponto no tempo 0 para as células que expressam GFP. Barras de erro representam SEM de pelo menos três experimentos independentes. d as células BC3_A2 que expressam GFP ou CEACAM5 foram cultivadas na presença ou ausência de 1 ng/ml TGF-β Para os períodos de tempo indicados. Os lisatos celulares foram submetidos a coagulação Ocidental para as proteínas indicadas. Todos os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. Ver também figos suplementares. 8 e 9
a Superprodução de CEACAM5 promove metastático conseqüência e reduz a EMT in vivo
EMT está associada com a redução da proliferação celular.Assim, a capacidade do CEACAM5 para inibir o EMT sugeriu que ele pode funcionar para promover o crescimento do tumor em locais metastáticos. Para testar esta hipótese, células BC3_A2 projetadas para superprodução CEACAM5 ou GFP (controle) foram injetadas nas veias da cauda dos ratos receptores para monitorar os efeitos da superprodução CEACAM5 no crescimento do tumor no pulmão. A sobreexpressão do CEACAM5 levou ao aumento do crescimento tumoral nos pulmões(Fig. 5a e Figo suplementar. 10a), diminuição da expressão da vimentina ao nível proteico (Figo suplementar. 10b), e diminuição da fosforilação de p38 (Fig. 5d, e). Reduzindo os níveis de CEACAM5 em BC3_A2 com dois shRNAs diferentes (Fig. 5. B) teve o efeito oposto na medida em que as células transdutoras cresceram mais lentamente nos pulmões do que as células de controlo após a injecção da veia da cauda (Fig. 5c e Figo suplementar. 10c). Além disso, a knockdown do CEACAM5 resultou em aumento do número de lesões, mas diminuiu o tamanho da lesão (Fig. suplementar. 10d, e). Estes resultados sugerem que o silenciamento do CEACAM5 promove EMT e extravasamento de células tumorais, enquanto ao mesmo tempo inibem o crescimento metastático.
Expression of CEACAM5 promotes growth of lung metastases. a BC3_A2 cells overproducing CEACAM5 or GFP were injected into the tail veins of mice. O BLI foi utilizado para quantificar o fluxo de fótons nos pulmões dos ratos nos pontos temporais indicados. Teste t emparelhado, p = 0.03. As barras de erro representam SEM de replicados biológicos (n = 5 ratos por grupo). células BC3_A2 que expressam shRNA de controle (shLuc) ou dois shRNAs diferentes (#3 e #5) específicos para CEACAM5 foram submetidos a qRT-PCR para monitorar a expressão CEACAM5. As barras de erro representam SEM de triplicados técnicos. Ver também a figura complementar. 10. c células BC3_A2 que expressam shLuc ou dois shRNAs CEACAM5 diferentes foram injectados nas veias da cauda dos ratinhos. O BLI foi utilizado para quantificar o fluxo de fótons nos pulmões dos ratos nos pontos temporais indicados. Testes T emparelhados, p = 0,01 para sh # 3 e p 0,001 para sh#5. Os dados foram normalizados para o ponto de tempo inicial e são apresentados numa escala logarítmica. As barras de erro representam SEM de replicados biológicos (n = 5 ratos por grupo). d as células BC3_A2 que produzem em excesso o CEACAM5 foram injectadas nas veias da cauda dos ratinhos, e os pulmões foram isolados e submetidos ao IHC com os anticorpos indicados. Barras de escala indicam 100 µm. a coloração das células e positivas para o CEACAM5, a vimentina ou o p-p38 nas secções tecidulares representadas no painel d foi quantitativa utilizando o sistema de imagiologia automatizado Vectra 3.0. Os testes T emparelhados, p = 0, 0008 para o CEACAM5, p = 0, 03 para a vimentina e p = 0, 03 para o p-p38. As barras de erro representam SEM de pelo menos três replicados biológicos independentes. F RNA isolado de células BC3_A2 que produzem em excesso o CEACAM5 ou o GFP e cultivado in vitro ou isolado do pulmão após injecção da veia da cauda (in vivo, A, d) foi submetido a análise da via GSEA (duas colunas à esquerda). Os processos top 5 down-regulated (azul) e top 5 up-regulated (vermelho) são mostrados. As casas indicam FDR 0.1 para efeitos estatísticos. NES (pontuação normalizada do enriquecimento). Significado destas vias nos tumores de P0 e P2 MFP vs. as metástases pulmonares correspondentes são apresentadas para comparação (duas colunas à direita). Os dados são representados por triplicados biológicos. Ver também a figura complementar. 11
para monitorizar o impacto da produção excessiva da expressão do gene CEACAM5, as células BC3_A2 concebidas para produzir em excesso o CEACAM5 ou o GFP foram cultivadas in vitro ou isoladas do pulmão após injecção da veia da cauda (in vivo). O RNA foi isolado e submetido a RNAseq. A análise da expressão diferencial do gene foi realizada, e a GSEA identificou a EMT como a única via de marcação do cancro que foi significativamente reduzida tanto in vitro como in vivo pela superprodução CEACAM5(Fig. 5F, Supplementary Fig. 11). Este resultado é semelhante ao observado nas metástases pulmonares P0 e P2 (figos. 1c, 5f). Coletivamente, estes dados indicaram que a regulação da expressão CEACAM5 em lesões metastáticas induz o crescimento das células tumorais metastáticas em locais secundários.
CEACAM5 a expressão é aumentada em lesões metastáticas em doentes com cancro da mama
a seguir, a expressão do CEACAM5 foi avaliada em lesões metastáticas e no tecido tumoral da mama obtido em doentes com cancro da mama. A coloração do IHC num conjunto de tecidos compatível constituído por um tumor primário e uma metástase pulmonar de um doente com cancro da mama (tabela complementar 3) revelou níveis mais elevados de CEACAM5 na metástase pulmonar relativamente ao tumor primário da mama (Fig. 6a e Figo suplementar. 12a). Para expandir estas análises, um microarray tecidular (TMA) constituído por metástases pulmonares de 25 doentes com cancro da mama (figos suplementares. 12b, c e o quadro complementar 3) foi manchado para CEACAM5 (Figo suplementar. 12b), e a intensidade de coloração foi atribuída uma pontuação (Fig. 6b). Este método de pontuação foi também aplicado a um AMT do Atlas proteico humano constituído por tumores mamários humanos manchados para o CEACAM5.32 a maioria das metástases pulmonares expressaram níveis elevados de CEACAM5 (Fig. 6C) em comparação com tumores mamários(Fig. 6D), demonstrando que o CEACAM5 foi superior em lesões metastáticas em comparação com tumores mamários primários.
CEACAM5 níveis proteicos estão elevados em lesões metastáticas de doentes com cancro da mama e estão inversamente correlacionados com a expressão da vimentina. a o tumor primário e metástase pulmonar correspondente de um paciente com câncer de mama foram submetidos a IHC para monitorar os níveis CEACAM5. Barras de escala indicam 100 µm. b um microarray tumoral tecidular (TMA) constituído por metástases pulmonares de 25 doentes com cancro da mama foi submetido ao IHC com um anticorpo específico do CEACAM5, e a intensidade da coloração foi marcada. São mostradas imagens representativas. Barras de escala indicam 100 µm. c o sistema de pontuação em b foi aplicado à TMA constituída por metástases pulmonares de 25 doentes com cancro da mama para avaliar os níveis relativos de CEACAM5. d o sistema de pontuação em b foi aplicado a um TMA do Atlas proteico humano constituído por 25 tumores mamários primários para avaliar os níveis relativos de CEACAM5. e o tumor primário e metástase pulmonar correspondente de um paciente com câncer de mama (de A) foram co-manchados para CEACAM5 e vimentina e analisados por microscopia de imunofluorescência. Barras de escala indicam 100 µm. as células f com coloração positiva para a CEACAM5, a vimentina ou ambas as secções dos tecidos representadas em e foram quantitativamente obtidas utilizando o sistema de imagiologia automatizado Vectra 3.0. g a AMT constituída por metástases pulmonares de 25 doentes com cancro da mama foi co-manchada para a CEACAM5 e a vimentina e analisada por microscopia de imunofluorescência. São mostradas imagens representativas. Barras de escala indicam 100 µm. as células h que apresentam coloração positiva para a CEACAM5, a vimentina ou ambas as secções dos tecidos mostradas em g foram quantitadas utilizando o sistema de imagem automatizado Vectra 3.0. Ver também a figura complementar. 12
We next assessed the matched tissue set for co-expression of CEACAM5 and vimentin. A co-coloração para a CEACAM5 e a vimentina revelou níveis mais elevados de CEACAM5 nas metástases pulmonares relativamente ao tumor da mama correspondente, tendo sido observado o padrão de coloração reversa para a vimentina (Fig. 6e, f). Além disso, uma pequena população de células tumorais exibiu Co-coloração tanto para o CEACAM5 quanto para a vimentina (Fig. 6f). Estas células que apresentam coloração positiva para ambas as proteínas podem representar células num estado híbrido EMT/MET.A AMT constituída por metástases pulmonares de 25 doentes com cancro da mama também demonstrou uma correlação inversa entre a CEACAM5 e a coloração da vimentina (Fig. 6g, h; figos suplementares. 12a-e). Estes resultados confirmaram as conclusões feitas com os nossos modelos PDX de TNBC e demonstraram que a expressão CEACAM5 está inversamente correlacionada com a expressão da vimentina em tumores mamários primários e lesões metastáticas. Em conjunto, estes resultados sugerem que o CEACAM5 promove o MET para facilitar o crescimento do tumor em locais metastáticos (figura suplementar 12a, b).
