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o Tratamento para Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) foi complicadas, aumentando a taxas de resistência aos antibióticos. As estirpes MRSA exprimem a proteína 2a de ligação à penicilina (PBP2a), codificada por mecA, que fornece resistência às β-lactamas, protegendo a serina reactiva numa fenda estreita e inacessível, permitindo que a síntese da parede celular continue na presença de antibióticos (1, 2). Ceftobiprol e ceftarolina são anti-MRSA cefalosporinas que inibem a PBP2a em concentrações terapeuticamente úteis. O grupo R2 de ceftobiprol estende-se até à fenda estreita do PBP2a para aceder ao local activo, enquanto que a ligação à ceftarolina provoca uma alteração alostérica no PBP2a, revelando o local activo para a ligação por uma segunda molécula (3, 4). Ceftobiprol foi avaliado em ensaios clínicos, e a ceftarolina é aprovada pela FDA para o tratamento de infecções da pele e estrutura cutânea, incluindo as causadas pelo MRSA (5-10).estudos anteriores do nosso grupo demonstraram que a passagem da estirpe do COL no ceftobiprol selecciona mutantes resistentes com mutações em PBP2a (11). Este estudo examina se a passagem de ceftarolina também seleciona mutações semelhantes. Experiências de passagem foram conduzidas com dois fundos diferentes de MRSA: COL, um isolado arcaico com resistência homogénea de 1961, e SF8300, uma estirpe contemporânea de USA300 MRSA com resistência heterogénea. COLnex e SF8300ex, estirpes derivadas mecA-negativas de COLn e SF8300, foram obtidas por (12) excisar o cromossoma meccemcal estafilocócico cromossómico em cassete (SCCmec) (13). MecA de tipo selvagem foi reintroduzido no plasmídeo pYK20 (derivado do plasmídeo pAW8 e contendo mecA de tipo selvagem clonada a partir do COL ) em COLnex e SF8300ex para estudos de passagem. Se mecA mediava resistência, então curar um mutante resistente do plasmídeo ou introduzi-lo num fundo sensível deve resultar em perda ou ganho de fenótipo, respectivamente, permitindo determinar a contribuição de mecA para a resistência. As estirpes e plasmídeos utilizados neste estudo estão listadas nos quadros 1 e 2. O COLnex (pYK20) e o SF8300ex(pYK20) foram submetidos a uma passagem serial em caldo de soja tríptico contendo concentrações crescentes de ceftarolina (laboratórios florestais), como descrito anteriormente (11).

Depois de 28 dias, COLnex(pYK20) e SF8300ex(pYK20) passaged em ceftaroline rendeu dois mutantes, COLnexpT(pYK20COLT*) e SF8300expT(pYK208300T*) (um asterisco indica um plasmídeo gerado durante ceftobiprole ou ceftaroline seleção em uma COLUNA ou SF8300 de fundo) (Tabela 1). Os MICs para a ceftarolina, ceftobiprol e outras β-lactamas (Sigma-Aldrich) foram determinados pelo método de diluição do caldo de acordo com os padrões CLSI (Quadro 3) (15). O COLnexpT (pYK20COLT*) expressou resistência de alto nível tanto à ceftarolina como ao ceftobiprol, com microfones de 64 µg/ml e 32 µg/ml, respectivamente. SF8300expT (pYK208300T*) expressou resistência de baixo nível no dia 4 de passagem, com uma MIC de 4 µg/ml, que permaneceu inalterada apesar de mais 24 passagens (Tabela 3 e Fig. 1). O mutante de COLnex(pYK20) (11), COLnexpB(pYK20COLB*), previamente descrito, mostrou resistência de alto nível tanto à ceftobiprol como à ceftarolina, com uma MIC de 64 µg/ml para cada um.

plasmídeo mecA foi sequenciado para mutações em estirpes passagadas. Como as PBPs são alvo de β-lactamas, pbp1, -2, -3 e -4 também foram sequenciadas. Por último, o gdpP e o acrB foram sequenciados, uma vez que as mutações nestes genes tinham sido identificadas num mutante resistente ao ceftobiprol negativo de mecA (16). O plasmídeo pYK208300T* (pYK20 do SF8300ex, administrado na ceftarolina), teve uma mutação pontual (G para uma posição de sequência de codificação 1339) em mecA, resultando numa alteração não sinónima de aminoácidos, E447K. não estavam presentes mutações noutros genes PBP, acrB ou gdpP (Tabela 4).

Plasmídeo pYK20COLT* (pYK20 de COLnex passaged em ceftaroline) não tinham mutações em mecA. Um ponto de mutação (C a T em CDS posição 1327) introdução o H443Y mutação em GdpP, um ponto de mutação (G ao CDS posição 466) introdução o D156N mutação em PBP2, e duas mutações de ponto (a: G em CDS posição 601 e C a G em CDS posição 723) a introdução de T201A e F241L mutações em PBP4 foram encontrados (Tabela 4). Note-se que a passagem de ceftarolina do COL contendo mecA na sua localização cromossómica natural também resultou num mutante com resistência de alto nível mas sem mutações em mecA (dados não apresentados). A análise da sequência desse mutante passagado revelou uma mutação pontual em pbp2 (G A a na posição de CDS 1891), resultando na Alteração do aminoácido G631S, e uma em pbp4 (T A A na posição de CDS 414), introduzindo uma mutação N138K. Estes dados indicam que, mesmo na presença de mecA, a ceftarolina pode seleccionar mutações noutros genes, resultando em resistência.

cura da COLnexpB (pYK20COLB*) e SF8300expT(pYK208300T*) dos seus plasmídeos, cada um dos quais com mutações de mecA, diminuiu os MICs para todas as β-lactamas testadas (tabelas 5 e 6). A cura do COLnexpT (pYK20COLT*) do seu plasmídeo, que não apresentava mutações de mecA, não teve qualquer efeito nos MICs (Tabela 5). A transformação do pYK20COLB*, que contém 6 mutações de substituição em mecA, no colnex precursor susceptível, produzindo o colnex transformador (pYK20COLB*), resultou em elevada resistência à ceftarolina e ao ceftobiprol. Transformando pYK208300T*, que contém a única mutação E447K em mecA, em COLnex, produzindo o transformant COLnex(pYK208300T*), resultou em um alto nível de resistência à ceftobiprole (CIM de 64 µg/ml), mas com baixo nível de resistência à ceftaroline (MIC de 4 µg/ml) (Tabela 5). A transformação de pYK20COLB* em SF8300ex, produzindo o transformador SF8300ex (pYK20COLB*), resultou em resistência de alto nível à ceftarolina e ceftobiprol (MIC de 32 µg/ml para cada um) (Tabela 6). Múltiplas tentativas de transformar SF8300ex com pYK208300T* não tiveram sucesso.