Todos os métodos em humanos e estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e regulamentos.isolamento e cultura de MSCs de plástico aderente e MSCs imunopositivos CD271 a partir de tecido adiposo após aprovação ética da Autoridade Nacional de investigação Sanitária (NHS) (LREC número 12/EE/0136) e consentimento informado de todos os dadores, PA MSCs e CD271+ MSCs foram isolados de AT que tinham sido colhidos como resíduos cirúrgicos. O AT foi picado e tratado com 0.3 U/ml de colagenase (Sigma, Dorset UK) durante duas horas a 37 °C, após a qual foi adicionado o meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado com 20% (v/v) de soro de vitelo fetal (FCS) e 1% (v/v) de penicilina e estreptomicina (todos provenientes de PAA, Yeovil, Somerset, UK) e a preparação digerida centrifugada a 600 g durante 10 minutos. O sedimento resultante foi re-suspenso em DMEM complementado com 10% (v/v) FCS e 1% (v/v) penicilina e estreptomicina, ou seja, meio de cultura padrão e passou por um filtro de células de 100 µm (BD Biosciences, Berkshire, Reino Unido). O filtrado foi re-centrifugado a 600 g durante 10 minutos e as células granuladas foram re-suspensas em meio de cultura padrão de 5 ml e passaram por um filtro de células de 40 µm. A suspensão celular resultante foi então tratada com tampão de Lise Eritrocito (Miltenyi Biotech, Surrey, Reino Unido) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Para cada preparação AT, os MSCs foram isolados a partir das células mononucleadas presentes após a lise eritrocitária através do aumento da adesão ao plastic8 da cultura tecidular ou por triagem celular associada magnética (MACS) para a imunopositividade14. Estas células foram expandidas em meio de cultura padrão em uma atmosfera humidificada a 37 ° C com passagem de rotina por tripsinização a 80% de confluência. Os MSCS de PA e os MSCS CD271+ nas passagens II-III foram utilizados para toda a experimentação subsequente. A citometria de fluxo foi utilizado para avaliar o enriquecimento para CD271+ células (usando MACS tecnologia), onde o recém células isoladas foram armazenadas a -80 °C durante a noite após o isolamento, e depois descongeladas e imediatamente immunostained para CD271; para todas as amostras, >90% das células foram CD271 immunopositive neste momento (dados não mostrados).

protocolos de diferenciação in vitro

a capacidade de diferenciação de PA e CD271+ MSCs para formar osteócitos, condrócitos e adipócitos foi avaliada como descrito anteriormente 8,45. Para a osteogénese, as culturas monolamadas de MSCs foram tratadas com dexametasona de 10 nM, ácido ascórbico de 50 ng/ml e glicerofosfato beta de 1 mM (Versus controlos do transportador) de 2 a 3 dias, durante um período de 4 semanas, após o que as culturas foram colhidas por fixação e manchadas por actividade da fosfatase alcalina do seguinte modo: as células foram fixadas com formalina tampão neutro de 10% durante 10 minutos. Entretanto, a solução de coloração foi preparada colocando 25 mg de naftol-fosfato (fosfato de naftol AS-MX: Sigma) em 0, 5 ml de dimetilformamida. Esta solução foi misturada com 50 ml de tampão Tris-HCl 0, 2 M contendo 50 mg de TR vermelho rápido (Sigma). Depois de misturar bem, a solução final foi filtrada usando o Whatman No. 1 filtro paper (Whatman). O fixador solução foi, então, removido e as células foram lavadas com PBS, em seguida, 1 ml da solução de coloração foi adicionado a cada poço para 1 hr. Finalmente, a mancha foi removida e digitalizadas as imagens foram capturadas com um microscópio invertido. A diferenciação ao longo da linhagem osteogénica foi ainda avaliada pelo aumento da actividade da fosfatase alcalina em células diferenciadas em comparação com células indiferenciadas utilizando um kit comercialmente disponível (Biovision, EUA) e seguindo o protocolo do fabricante; em suma, as células foram homogeneizadas no tampão do doseamento. As células homogeneizadas foram então centrifugadas para remover material insolúvel a 13.000 g durante 3 minutos. Em seguida, foram carregados 80 µl de cada uma das amostras em alvéolos separados de uma placa de 96 alvéolos. Em seguida, adicionaram-se a cada alvéolo de amostra 50 µl de solução pNPP de 5 mM. Após um passo de mistura, pipetando para cima e para baixo, os poços foram incubados a 25 °C durante 60 minutos. Foi gerada uma curva padrão diluindo 40 µl de 5 mM de pNPP em 160 µl de tampão de ensaio para gerar um padrão pNPP de 1 mM. Então 0, 4, 6, 12, 16 e 20 µl desta solução padrão foi carregado em uma placa de 96 poços para gerar padrões pNPP 0-20 nmol/ml que poderiam ser medidos por espectrofotometria. Para a condrogénese, os pellets celulares foram preparados em DMEM / glucose elevada (Sigma) complementada com 100 nM de dexametasona (DEX), 37.5 µg/ml de ascorbato-2-Fosfato, 1% (vol/vol) de insulina, transferrina e selénio (ITS-X100; Sigma) e 10 ng/ml de Factor de crescimento transformador-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londres, Reino Unido), e penicilina e estreptomicina. As culturas de controlo foram tratadas com DMEM/meio de glucose elevado, com apenas portadores, ou seja, metanol, água estéril e ASC a diluições adequadas. No dia 28, a diferenciação condrogénica foi examinada histologicamente através da fixação dos pellets em formalina tamponada neutra a 10%, incorporando-os então em secções parafínicas e de tecidos cortantes, que estavam manchadas com azul de toluidina (Sigma) como marcador do sintetizador proteoglicano 8. Além disso, o nível de glicosaminoglicano secretado no meio diferenciador nas últimas 24 horas de cultura antes da colheita no dia 28 foi medido utilizando o doseamento de DMMB. O protocolo de ensaio DMMB foi adaptado do método de Farndale et al., 1986 as followes46: (i) the DMMB dye solution was prepared by adding 3.04 g de glicina, de 2,37 g de NaCl e 16 mg de 1,9 DMMB para 1 litro de água desionizada; (ii) o pH foi ajustado para 3,0 com ácido clorídrico e o corante solução foi armazenada em uma garrafa marrom; (iii) 50 µl de alíquotas do meio de cultura colhida a partir da célula-semeado andaimes no dia 28, foram adicionados, em triplicado, para uma placa de 96 poços; (iv) 200 µl do DMMB corante solução foi adicionada ao meio de cultura e a absorvância foi avaliado em 540 nm imediatamente. O sulfato de condroitina (CS) da cartilagem de tubarão (Sigma) foi utilizado para fornecer uma curva padrão de absorvância (0-40 µg/ml, CS) a partir da qual foi calculado o teor de GAG nas amostras de meio de cultura. Os níveis de absorvância para o teor de GAG nas amostras de meio de cultura foram normalizados para explicar a absorvância de fundo resultante da presença de vermelho de fenol no meio, dissolvendo os padrões no meio DMEM. Para a adipogénese, as culturas MSC foram mantidas em meios de cultura contendo 1 µM Dex, 0.5 mM 3-isobutil-metilxantina (Sigma), 1% de insulina, transferrina e selénio (ITS-X 100 pré-mistura; PAA) e 100 µM de indometacina (Sigma), durante 28 dias a 37 °C e 5% de CO2, como descrito anteriormente 47. As células de controle foram mantidas em meios completos com portadores. A diferenciação foi examinada utilizando coloração vermelha de óleo das gotículas lipídicas. As células foram fixadas em formalina tampão neutro de 10% durante 1 hora após a qual a solução de coloração foi adicionada. A acumulação relativa de vermelho de óleo foi medida após tratamento com 100% de isopropanol durante 15 minutos e a leitura da absorvância do sobrenadante a 540 nm, utilizando um espectrofotómetro.

transplante de MSC em um femoral osteochondral defeito do modelo

a Seguir institucional, análise e aprovação ética (Institucional de Cuidados de Animais e o Uso de Comitês de Fukui Universidade, Departamento de Ortopedia e Medicina de Reabilitação: Número de Aprovação 25-053), feminino athymic nude ratos (ratos de f344/N Jcl rnu/rnu, CLEA Japão, Inc. Tóquio, Japão), com idades compreendidas entre 6 e 10 semanas e pesando 150-170 gramas foram alocados aleatoriamente nos seguintes grupos: (i) PA MSCs (n = 6 animais); (ii) CD271+ MSCs (n = 6 animais); (iii) um grupo controle de Alfa Chondro Escudo do andaime sozinho (sem células, n = 3 animais). Estes números de animais por grupo foram utilizados anteriormente no mesmo instituto para demonstrar diferenças significativas entre grupos de tratamento ao nível de 5% 48. Os ratos foram anestesiados por exposição a 3% de isoflurano no gás O2 e mantidos a 1, 5% de isoflurano no gás O2 durante a cirurgia. Depois de esterilizar os joelhos usando etanol a 70%, uma incisão na pele parapatelar medial foi feita seguida de dissecação através do músculo e, em seguida, expondo a articulação do joelho por deslocamento lateral da patela. Defeitos osteocondrais bilaterais de 2 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade foram criados no sulco patelar do fémur de cada animal usando uma broca cirúrgica de 2 mm de diâmetro. O escudo de Condro alfa foi usado como porta-células/cadafalso para entregar 5 × 104 PA MSCS ou CD271+ MSCs versus sem células (como controles). Antes do transplante, as células foram colhidas por tripsinização e semeadas num volume de 10 µl de meio de cultura padrão em discos de 2 mm de diâmetro do Escudo de Condro Alfa, em seguida incubadas numa atmosfera humidificada a 37 °C e 5% de CO2 durante 30 minutos, a fim de promover a adesão das células e a sua incorporação no suporte. Os andaimes de semeadura celular e de controlo foram transplantados para os defeitos e fixados no local com cola de fibrina, que foi permitido ajustar por cerca de 10-20 segundos (Fig. 6). O tecido conjuntivo e a pele foram suturados com suturas de nylon. Os animais foram autorizados a circular livremente após a recuperação e alimentados com uma dieta padrão de manutenção e água ad libinum. Às 3 semanas após o transplante, os animais foram sacrificados por sobredosagem de 3% de isoflurano para examinar macroscópica e histologicamente a extensão da reparação da ferida.

Macroscópica de pontuação da cartilagem cicatrização de feridas

Depois de expor a articulação do joelho no sacrifício de animais, o defeito foi marcado macroscopicamente por dois cirurgiões que estavam cegos para o braço de tratamento utilizando um sistema estabelecido para a avaliação da cartilagem cicatrização de feridas em pequenos animais models49. O grau de reparação de tecidos foi marcado de 0 Pontos (melhor resultado) para 4 pontos (pior resultado) cada um para: (1) A cor do tecido de reparação; (2) a extensão dos vasos sanguíneos observados no tecido de reparação; 3) a suavidade da superfície do tecido de reparação; 4) a extensão em que o defeito da ferida foi preenchido com tecido de reparação; 5) a extensão da degeneração da cartilagem articular adjacente. Os pontos marcados para cada critério foram adicionados e o grau de melhor reparação foi representado com a pontuação mais baixa a partir de uma pontuação total de 20.após a excisão cirúrgica, os joelhos dos animais foram fixados em formalina neutra com 10% de tampão (Sigma) durante 48 horas e colocados em solução K-CX descalcificante (FALMA, Tóquio, Japão) durante 24-48 horas a 4 °C. Depois disso, os joelhos do rato foram lavados durante a noite em água corrente da torneira, processados e incorporados em blocos de cera de parafina prontos para seccionamento. As secções dos tecidos foram cortadas a 5 mícrons de espessura num microtoma rotativo padrão e estas foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&e) e azul de toluidina antes da montagem em DPX e exame histológico. A extensão e a qualidade da reparação da cartilagem foram avaliadas histologicamente e independentemente por dois examinadores usando o sistema de pontuação Wakitani 36, modificado para incluir dois parâmetros adicionais, i.e. examinar a presença de vasos sanguíneos e células gigantes do corpo estranho (FBGCs). Assim, o sistema de pontuação compreendia sete parâmetros diferentes: (1) morfologia celular; (2) coloração matricial; (3) regularidade da superfície; (4) espessura da cartilagem; (5) integração do tecido de reparação com cartilagem Hospedeira; (6) extensão da vascularização dentro do defeito; (7) extensão da reacção FBGC. Para cada um destes parâmetros, a pontuação mais baixa (0) representou o “melhor” reparo e uma pontuação mais alta (4) representou o “pior” reparo. As pontuações globais foram adicionadas e, em seguida, comparadas entre os grupos de uma pontuação total de 21.

imunohistoquímica para o antigénio mitocondrial humano

as secções dos tecidos foram manchadas com um anticorpo anti-humano do antigénio mitocondrial (HMA) (Clone 113-1: Abcam, Cambridge, UK) para avaliar a presença de MSCs humanos. Após a recuperação do antigénio, as secções foram imersas em três alterações de PBS e bloqueadas durante 20 minutos com 2,5% de soro do cavalo (Vector Labs Ltd) à temperatura ambiente para evitar a ligação não específica. As secções foram então incubadas com o anticorpo anti-HMA do Rato (1:400 diluição em PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Em seguida, qualquer anticorpo não ligado foi lavado suavemente em três alterações da PBS e as secções foram incubadas com IgG anti-rato biotinilado durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram lavadas três vezes em PBS e a actividade endógena de peroxidase foi bloqueada utilizando 0,3% de peróxido de hidrogénio em metanol durante 30 minutos à temperatura ambiente. Durante esta fase de incubação, o VECTA ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, Reino Unido) foi preparado e foi autorizado a permanecer durante 30 minutos antes de ser utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Após o bloqueio da actividade endógena de peroxidação, as secções foram lavadas em três vezes PBS e incubadas com o reagente ABC durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, um cromogênio DAB (laboratórios vetoriais) foi adicionado por 6-8 minutos, dependendo da intensidade de cor desejada. As secções foram então lavadas e desidratadas através de uma série de etanol (70-100%), depuradas com xileno e montadas em Pertex. O sedimento condrogênico de MSCs humanos foi usado como um controle positivo. O controlo negativo incluiu sedimento condrogénico onde o anticorpo primário foi omitido.

de microscopia eletrônica de Varredura

A adesão de MSCs propagada para o Alpha Chondro Escudo do andaime antes da implantação foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (SEM) da seguinte maneira: após a célula-semeado andaimes tinha sido incubados em um ambiente umidificado a 37 °C e 5% de CO2 por 30 minutos, eles foram lavados em PBS e, em seguida, fixo em 2% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão fosfato (pH 7.4) por 2 horas, em seguida, lavados em 0.1 M tampão fosfato antes do tratamento com 1% de tetraóxido de ósmio durante 1 hora. As amostras foram, então, desidratados através de uma série graduada de etanol em solução, tratados com transição de solvente, t-butil álcool por 30 minutos, liofilizados, revestido com ouro, paládio e, finalmente, criar a imagem usando um JSM-6390 (JEOL, Tóquio, Japão) ou Zeiss EVO10 microscópio eletrônico de varredura (Carl Zeiss, Cambridge, reino UNIDO).a coloração viva/morta para determinar a viabilidade celular dos andaimes com sem células foi corada com uma solução de coloração viva/morta, de acordo com o protocolo do fabricante, tal como descrito anteriormente 8. Brevemente, a célula-semeado andaimes foram imersos na LIVE/DEAD coloração da solução por 30 minutos no escuro, a 37 °C. Os andaimes foram, em seguida, removidos da solução de coloração, lavadas em PBS e imediatamente visualizados utilizando um microscópio confocal Leica (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).ensaios de angiogénese in vitroa linha de células endoteliais hy926 foi utilizada como modelo para examinar qualquer actividade angiogénica de meio condicionado de cultura a partir de PA MSC e CD271+ MSC CM. EA.hy926 proliferação/migração de células endoteliais e formação de túbulos endoteliais foram examinadas da seguinte forma: (I) EA.as células hy926 foram cultivadas em meio de cultura padrão (DMEM/ F-12 complementado com 10% de FBS, 1% de penicilina e estreptomicina) em 24 placas de poços durante 2 dias até que se formaram monocamadas 100% de confluentes. Uma pipeta esterilizada foi usada para fazer um arranhão no monolayer. Posteriormente, os poços foram lavados com PBS esterilizados e, em seguida, 1 ml de meios acondicionados de culturas PA MSC ou culturas CD271+ MSC foi adicionado em cada um dos poços triplicados por condição testada. O meio de cultura DMEM livre de soro foi usado como um controle. A placa foi incubada na plataforma de QI celular para imagens digitalizadas de células vivas durante um período de 2 dias, após o que o fechamento da ferida de arranhão, números de células viáveis e a extensão da migração de células individuais foram quantitativamente usando o software de análise de imagens de QI celular. The proliferative response of EA.as células endoteliais de hy926 à PA MSC e CD271+ MSC condicionados (versus meio de controlo sem soro) também foram examinadas utilizando o ensaio MTT; (ii) EA.a formação de tubulos endoteliais de hy926 foi testada utilizando Matrigel com factor de crescimento reduzido (Biociência BD), que foi aliquotado em placas de 96 alvéolos (50 µl Matrigel/alvéolo) e incubado durante 30 minutos a 37 °C. EA.as células endoteliais de hy926 foram semeadas no Matrigel a 2 × 104 células / alvéolo em 200 µl de PA MSC e CD271+ MSC, meios condicionados ou meios de cultura de controlo sem soro. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 1 dia, após o que foram fotografadas usando Plataforma de imagem Qi celular (3 imagens por Poço). O comprimento/imagem total do túbulo endotelial e o número total de pontos/imagem de ramificação do túbulo endotelial foram medidos utilizando o software do analisador de imagens IQ da célula.

A análise estatística

a análise estatística foi realizada usando o software GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, USA). Para experiências in vivo, foi testado um mínimo de n = 3 animais por condição. Para os experimentos in vitro, n = 3-4 experimentos independentes foram realizadas para todas as análises, onde os dados foram analisados com ANOVA one-way, quando houve um fator variável, e two-way ANOVA, quando havia dois fatores variáveis. Para as pontuações macroscópicas e histológicas da reparação da cartilagem, as diferenças entre os grupos foram examinadas usando os múltiplos testes de comparação de Dunn. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado significativo. Todos os dados foram apresentados como médias ± SEMs ou médias ± SDs (conforme indicado nas legendas das figuras).