sygnatury przerzutów do płuc PDX identyfikują geny de-regulowane w przerzutach. schematyczna reprezentacja guzów MPF i przerzutów do płuc wyizolowanych dla RNAseq. B Główne analizy składowe (PCA) z danych rnaseq wygenerowanych z guzów MFP i przerzutów do płuc stosowanych w tym badaniu. Każdy punkt danych reprezentuje jedną próbkę z pojedynczej myszy. C analiza szlaku GSEA na enriched lung metastasis signature (P2); pokazano 5 procesów regulowanych w dół (niebieski) i w górę (czerwony). NES, znormalizowany wynik wzbogacania. Pola wskazują FDR <0.1 dla istotności statystycznej. W prawym panelu pokazano wykresy wzbogacania nabłonkowego przejścia mezenchymalnego (EMT) i sygnalizacji TGF-β Dla P0 i P2. p < 0,001 dla sygnalizacji EMT i TGF-β przy P0 i P2. d QRT-analiza PCR ekspresji wimetyny w guzach BC3_A2 MFP i subpopulacjach przerzutowych wyizolowanych z płuc. Sparowane testy t, P = 0,02 dla płuc P0, p < 0,001 dla płuc P2. Każdy punkt danych reprezentuje jedną mysz. Paski błędów reprezentują sem replik biologicznych. Zob.również dodatkowe rys. 2. e barwienie IHC przeprowadzono na wskazanych odcinkach tkanek przy użyciu przeciwciała rozpoznającego specyficzną dla człowieka postać wimentiny. Paski skali wskazują 100 µm. Wykres F1 pokazujący ekspresję genów EMT w przerzutach P0 i P2 do płuc w porównaniu z odpowiadającymi im guzami MFP. wartości p podano w dodatkowej Tabeli 1. Próbki od co najmniej trzech niezależnych myszy zostały włączone do analiz RNAseq

przeprowadzono ilościowe badanie w czasie rzeczywistym (QRT-PCR) w celu monitorowania ekspresji wimentiny, markera mezenchymalnego, w guzach MFP i przerzutach do płuc podczas seryjnego przechodzenia. Ekspresja wimetyny wykazywała dynamiczny wzór z wyższą ekspresją w guzach MFP w stosunku do odpowiednich przerzutów do płuc w każdym przejściu (Fig. 1D) i do przerzutów do wątroby przy P0 (dodatkowe rys. 2A). Poziom białka wimetyny podsumował ten dynamiczny wzór (rys. 1e). Dodatkowe geny EMT zostały również obniżone w przerzutach do płuc w stosunku do odpowiednich guzów MFP (Fig. 1f). Ekspresja markera mezenchymalnego CDH2 (gen kodujący N-kadherynę) przebiegała w ten sam sposób, co wimentin (Fig. 2B), podczas gdy ekspresja markera nabłonkowego CDH1 (gen kodujący e-cadherin) wykazywała odwrotny trend (dodatkowe rys. 2c). Współ-wszczepione ludzkie fibroblasty zrębowe były usuwane do czasu zebrania guza (Fig. 3a-f), wykluczając możliwość, że przyczyniły się do ekspresji markerów mezenchymalnych w guzach MFP. Zebrane razem Wyniki pokazują, że guzy obniżają ekspresję genów mezenchymalnych po ustaleniu ich w miejscach przerzutowych.

wyznaczanie złożoności biblioteki dla wysokiej przepustowości funkcji screen

ekran o wysokiej przepustowości funkcji (GOF) został zaprojektowany w celu identyfikacji czynników czynnościowych przerzutów z naszej sygnatury przerzutów do płuc P2. HOXA1, Znany sterownik przerzutów, 29 służył jako kontrola pozytywna dla optymalizacji ekranu, a GFP był używany jako kontrola negatywna. Komórki BC3_A2 transdukowano z lentywirusem kodującym HOXA1 lub GFP, a zainfekowane komórki nowotworowe mieszano w różnych proporcjach (Fig. 4a). Mieszane populacje komórek nowotworowych były następnie wszczepiane do MFP myszy biorcy, a BLI wykorzystano do oceny przerzutów do płuc w czasie sekcji (dodatkowa Fig. 4B). W drugim zestawie eksperymentów, przerzutowy sterownik ID19 został użyty w połączeniu z GFP, ale w tym przypadku mieszane populacje komórek nowotworowych wstrzyknięto do żyły ogonowej myszy biorcy w celu modelowania końcowych stadiów przerzutów (Fig. 4c). Zaobserwowano znaczny wzrost strumienia fotonów w guzach o stosunku HOXA1: GFP lub ID1: GFP 1: 10. Te testy złożoności wykazały, że prawdziwy sterownik przerzutów może zostać wykryty na naszym ekranie, jeśli zostanie połączony z 9 otwartymi ramkami odczytu bez sterownika (ORFs), ale Pula jednego sterownika z 19 nie-sterownikami zamaskowała naszą zdolność do wykrycia sterownika. Na podstawie tych wyników ograniczyliśmy wielkość naszej puli do 12 ORFs.

badania przesiewowe o wysokiej przepustowości in vivo identyfikują kandydujące czynniki czynnościowe przerzutów TNBC

w celu określenia, które z wyregulowanych genów z sygnatury przerzutów do płuc P2 były zdolne do kierowania przerzutami do płuc, zaprojektowaliśmy niestandardowe biblioteki lentiwirusowe z kodami kreskowymi kodujące ORFs 230 genów, które były najbardziej wyregulowane w przerzutach do płuc. ORF wyrażano indywidualnie w komórkach BC3_A2 tak, że każda linia komórkowa wyrażała pojedynczy ORF, komórki następnie połączono w grupy po 12, a pule wszczepiono do MFP myszy biorcy (N = 10 myszy na pulę, Fig. 2A). Do każdej puli włączono plazmid kontrolny wyrażający GFP w celu oceny przerzutów wewnętrznych w tym modelu TNBC. Każdy ORF był powiązany z unikalnym kodem kreskowym DNA. W celu potwierdzenia jednakowej reprezentacji każdego ORF w czasie implantacji nowotworu zamrożono wzorcowy granulat połączonych komórek. Jako punkt końcowy badania wybrano trzynaście tygodni, ponieważ HOXA1, ale nie guzy z ekspresją GFP, przerzuty do płuc w tym punkcie czasowym(dodatkowe rys. 5A). Trzynaście tygodni po wszczepieniu płuca poddano BLI ex vivo (dodatkowe rys. 5a), wyizolowano zmiany przerzutowe i wyekstrahowano genomowy DNA (gDNA) i wykorzystano jako szablon dla qPCR w celu wzmocnienia unikalnych regionów kodów kreskowych związanych z każdym ORF (Fig. 5b). Guzy MFP również wyizolowano i poddano tym analizom (Fig. 2A). Reprezentację każdego kodu kreskowego ORF w urządzeniu wielofunkcyjnym w stosunku do próbki referencyjnej określono dla każdej puli (rys. 2b; Fig. uzupełniające 5c, d). Reprezentacja w płucach została następnie znormalizowana do wzbogacenia w MFPs vs. odniesienia (Fig. 2b, c). Sterowniki przerzutów podzielono na trzy grupy, w tym te wzbogacone zarówno w płucach, jak i w płucach (rys. 2B, prawy górny kwadrant i dodatkowe rys. 5c), te wzbogacone wyłącznie W Urządzenia wielofunkcyjne (rys. 2B, dolny prawy kwadrant) oraz te wzbogacone wyłącznie w płuca (rys. 2B, lewy górny kwadrant i Rys. 2c). Komórki wyrażające GFP wzbogacono w przerzuty do płuc w niektórych zbiornikach, a średni wynik wzbogacenia dla GFP w płucach wynosił około 5 (Fig. 5e). Dlatego użyliśmy tego jako odcięcia wzbogacenia, aby zdefiniować prawdziwe trafienie w naszym ekranie i zidentyfikowaliśmy 44 geny, które zostały selektywnie wzbogacone w przerzuty do płuc w stosunku do guzów pierwotnych. Trafienia te zostały uszeregowane według wyniku wzbogacenia (rys. 2c I Tabela uzupełniająca 2). Wśród pięciu największych trafień, CEACAM5 był jedynym, którego ekspresja w guzach pierwotnych okazała się przewidywać słabe przeżycie u pacjentów z rakiem piersi (dodatkowe rys. 6a). W związku z tym zbadaliśmy rolę funkcjonalną CEACAM5 w przerzutach raka piersi.

badanie przesiewowe o wysokiej przepustowości in vivo identyfikuje czynniki czynnościowe przerzutów. Schemat przedstawiający format używany do gain-of-function (GOF) ekranu. Zob.również dodatkowe rys. 5. ORF, otwórz ramkę do czytania. W każdej kohorcie wszczepiono dziesięć myszy. B wykres punktowy pokazujący względną reprezentację każdego ORF w guzach MFP po normalizacji do punktu odniesienia (oś x) i w płucach względem guzów MFP (oś y). Do kwantyfikacji danych qPCR zastosowano metodę ΔΔCT. CEACAM5 jest pokazany na Czerwono. geny C wzbogacone w przerzuty do płuc, ale nie w guzy MFP, zostały uszeregowane w kolejności malejącej wzbogacenia w płucach. Kropkowana linia oznacza odcięcie wyniku wzbogacenia. Zob.również dodatkowe rys. 5 i dodatkowa Tabela 2

potwierdzenie zwiększonej ekspresji CEACAM5 w dodatkowych modelach PDX z przerzutami

stwierdzono, że ekspresja CEACAM5 była dynamicznie regulowana, ponieważ subpopulacje przerzutowe były seryjnie przechodzone między płucami a urządzeniami wielofunkcyjnymi in vivo (Fig. 3a), potwierdzając ustalenia z RNAseq (dodatkowa Tabela 1 i dodatkowa Fig. 6b). Podobnie ekspresja CEACAM5 była wyższa w wątrobie (Fig. 7A) i mózgu (dodatkowe rys. 7B) przerzuty w stosunku do odpowiednich guzów MFP. Stężenie białka CEACAM5 było również wyższe w przerzutach do płuc w porównaniu z nowotworami MFP (Fig. 3b). Wzrost ekspresji CEACAM5 w zmianach przerzutowych nie był zależny od wyciszenia p53 w tej linii PDX, ponieważ przerzuty do płuc z izogenicznej linii PDX wyrażające dziki Typ p5326, 30 wykazywały również wyższe poziomy ekspresji CEACAM5(dodatkowe rys. 7c).

CEACAM5 jest regulowany w przerzutach, a jego ekspresja jest odwrotnie skorelowana z ekspresją wimentiny w modelach PDX TNBC. ekspresję CEACAM5 w guzach MFP i przerzutowych zmianach myszy wszczepionych guzami BC3_A2 oznaczono za pomocą qRT-PCR. Sparowane testy t, p < 0,001 dla płuc P0, guza P2 MFP i płuc P2. Każda kropka reprezentuje indywidualną mysz. Paski błędów reprezentują sem replik biologicznych. Zob.również dodatkowe rys. 7. B guzy MFP i odpowiadające im przerzuty myszy wszczepione guzami BC3_A2 analizowano przez IHC przy użyciu przeciwciała CEACAM5. Paski skali wskazują 100 µm. C ekspresję CEACAM5 w guzach MFP i przerzutowych zmianach myszy wszczepionych guzami PIM001-P oznaczono za pomocą qRT-PCR. Dane prezentowane są w skali logarytmicznej. Sparowany test t, p < 0.001. Każda kropka reprezentuje indywidualną mysz. Paski błędów reprezentują sem replik biologicznych. d guzy MFP i odpowiadające im przerzuty do płuc od myszy wszczepionych guzami PIM001-P analizowano przez IHC przy użyciu przeciwciała CEACAM5. Paski skali wskazują 100 µm. E, f IHC seryjnych sekcji tkanki nowotworowej myszy wszczepionych BC3_A2 (e) lub PIM001-P (f) barwionych przeciwciałami specyficznymi dla CEACAM5 (Panel górny) lub wimentin. Paski skali wskazują 100 µm. g ekspresję CEACAM5 (Panel górny) lub vimentin (panel dolny) oznaczano w panelu linii komórkowych raka piersi. Paski błędów reprezentują sem trójplikatów technicznych. H IHC przeprowadzono w celu monitorowania fosforylowanego p38 w guzach MFP i przerzutach do płuc myszy BC3_A2. Paski skali wskazują 100 µm

oceniono drugi zestaw modeli PDX TNBC (PIM001) w celu określenia, czy wzrost CEACAM5 w zmianach przerzutowych był ogólną właściwością przerzutów. PIM001-P ustalono na podstawie dotychczas nieleczonego guza pierwotnego u pacjenta z przerzutowym TNBC, natomiast PIM001-M ustalono na podstawie przerzutów skórnych u tego samego pacjenta. Komórki nowotworowe PIM001-P zaprojektowano tak, aby wyrażały zarówno CBR-Luc, jak i mCherry, a następnie wszczepiono W Urządzenia wielofunkcyjne myszy biorcy. W czasie sekcji wyodrębniono guzy MFP i przerzuty do płuc. Ekspresja CEACAM5 była zwiększona przy obu poziomach mRNA (Fig. 3c) i poziom białka (rys. 3d) w przerzutach do płuc PIM001-P w porównaniu z odpowiednimi nowotworami MFP. Co ciekawe, poziomy białka CEACAM5 były wyższe w guzach PDX MFP ustalonych z przerzutów skórnych pacjenta (PIM001-M) w porównaniu z guzami PDX MFP ustalonymi z pierwotnego guza piersi (PIM001-P) (dodatkowe rys. 7d). Łącznie wyniki te pokazują, że podwyższenie CEACAM5 jest wspólną właściwością przerzutów w modelach PDX TNBC.

ekspresja CEACAM5 jest odwrotnie skorelowana z ekspresją wimentiny i fosforylacją p38

, ponieważ ekspresja CEACAM5 w modelach PDX była odwrotnie skorelowana z ekspresją wimentiny (Fig. 1D, 3A; Fig.uzupełniające 2a i 7a, b), immunohistochemia (IHC)zastosowano do monitorowania przerzutów do płuc i guzów MFP pod kątem względnego poziomu wimentiny i CEACAM5. Poziomy białka skorelowane z poziomami mRNA w obu modelach PDX (Fig. 3e, f). Ekspresja wimentiny była również odwrotnie skorelowana z ekspresją CEACAM5 w panelu linii komórek raka piersi (Fig. 3g). Kinaza białkowa p38alpha specyficzna dla seryny / treoniny (znana również jako MAPK14, zwana dalej p38) jest fosforylowana podczas EMT.Co ciekawe, fosforylowany (aktywny) p38 korelował z wysokim poziomem ekspresji wimentiny w guzach MFP, a fosforylacja p38 zmniejszyła się w przerzutach do płuc, gdzie poziom wimentiny był niski (Fig. 3h). Łącznie dane te pokazują, że ekspresja CEACAM5 jest odwrotnie skorelowana z ekspresją markerów EMT w przerzutach do płuc.

ektopowa nadprodukcja CEACAM5 hamuje sygnalizację TGF-β i ekspresję markerów EMT

biorąc pod uwagę, że ekspresja CEACAM5 jest odwrotnie skorelowana ze statusem mezenchymalnym, oceniliśmy, czy CEACAM5 ma bezpośrednią rolę w regulacji ekspresji markerów mezenchymalnych. Komórki bc3_a2 zaprojektowane w celu nadmiernej produkcji ludzkiego CEACAM5 lub GFP jako kontroli negatywnej (dodatkowe rys. 8a, b) badano pod kątem ekspresji wimentiny i CDH2 / N-cadheriny (markery mezenchymalne) oraz CDH1/E-cadheriny (marker nabłonkowy). Nadekspresja CEACAM5 doprowadziła do zwiększenia ekspresji CDH1 (dodatkowe rys. 8c) i zmniejszona ekspresja CDH2 (dodatkowe rys. 8d) i wimentin (dodatkowe rys. 8e). Ponadto nadprodukcja CEACAM5 zmniejszona i opóźniona fosforylacja smads z udziałem TGF-β w komórkach BC3_A2 (Fig. 4a, C, dodatkowe rys. 9a) i fosforylacji p38 w obu komórkach BC3_A2 (Fig. 4a, B, dodatkowe rys. 9a) i komórki MDA-MB-231 (dodatkowe rys. 8F, dodatkowe rys. 9b). Wreszcie, nadprodukcja CEACAM5 opóźnionego indukowanego TGF-β EMT ocenianego za pomocą ekspresji e-cadherin i wimentin (Fig. 4D, dodatkowe rys. 9c). Wyniki te sugerują, że CEACAM5 negatywnie reguluje EMT i identyfikuje funkcję CEACAM5 w przerzutach raka piersi.

nadprodukcja CEACAM5 obniża ekspresję markerów mezenchymalnych i upośledza sygnalizację TGF-β oraz upośledza sygnalizację TGF-β. komórki bc3_a2 zaprojektowane do wytwarzania nadprodukcji CEACAM5 lub GFP hodowano w obecności lub braku 1 ng / ml TGF-β przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe poddano Western blotting dla wskazanych białek. Histogram b, C pokazuje zmianę fałdową (skala logarytmiczna) w stanie fosforylacji p38 (b) lub Smad2/3 (c) w porównaniu z tą w punkcie czasowym 0 dla komórek wyrażających GFP. Paski błędów reprezentują SEM co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. d bc3_a2 komórki wyrażające GFP lub CEACAM5 hodowano w obecności lub braku 1 ng / ml TGF-β przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe poddano Western blotting dla wskazanych białek. Wszystkie wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Patrz także: figi uzupełniające. 8 i 9

nadprodukcja CEACAM5 sprzyja przerostowi przerzutów i zmniejsza EMT in vivo

EMT wiąże się ze zmniejszoną proliferacją komórkową.Tak więc, zdolność CEACAM5 do hamowania EMT sugeruje, że może on działać w celu promowania wzrostu guza w miejscach przerzutów. Aby przetestować tę hipotezę, komórki bc3_a2 zaprojektowane do nadprodukcji CEACAM5 lub GFP (control) wstrzyknięto do żył ogonowych myszy biorcy w celu monitorowania wpływu nadprodukcji CEACAM5 na wzrost guza w płucach. Nadekspresja CEACAM5 doprowadziła do zwiększonego wzrostu guza w płucach (rys. 5A i dodatkowe rys. 10A), zmniejszona ekspresja wimentiny na poziomie białka (dodatkowe rys. 10b) i zmniejszonej fosforylacji p38 (Fig. 5d, e). Zmniejszenie poziomów CEACAM5 w BC3_A2 za pomocą dwóch różnych shrna (rys. 5B) miał odwrotny skutek, ponieważ komórki transdukowane rosły wolniej w płucach niż komórki kontrolne po wstrzyknięciu żyły ogonowej (Fig. 5c i dodatkowe rys. 10c). Ponadto, knockdown CEACAM5 spowodował zwiększenie liczby zmian, ale zmniejszył rozmiar zmian (dodatkowe rys. 10d, e). Wyniki te sugerują, że wyciszanie CEACAM5 Promuje EMT i wynaczynienie komórek nowotworowych, jednocześnie hamując przerzuty.

ekspresja CEACAM5 sprzyja wzrostowi przerzutów do płuc. komórki bc3_a2 nadprodukujące CEACAM5 lub GFP wstrzyknięto do żył ogonowych myszy. BLI był używany do ilościowego oznaczania strumienia fotonów w płucach myszy we wskazanych punktach czasowych. Sparowany test t, p = 0,03. Paski błędów reprezentują SEM replikatów biologicznych (n = 5 myszy na Grupę). b komórki bc3_a2 wyrażające kontrolny shRNA (shLuc) lub dwa różne shrna (#3 i #5) specyficzne dla CEACAM5 poddano qRT-PCR w celu monitorowania ekspresji CEACAM5. Paski błędów reprezentują sem trójplikatów technicznych. Zob.również dodatkowe rys. 10. c bc3_a2 komórki wyrażające shLuc lub dwa różne skurcze CEACAM5 wstrzyknięto do żył ogonowych myszy. BLI był używany do ilościowego oznaczania strumienia fotonów w płucach myszy we wskazanych punktach czasowych. Sparowane testy t, p = 0,01 dla SH#3 i p < 0,001 dla SH#5. Dane zostały znormalizowane do początkowego punktu czasowego i są prezentowane w skali logarytmicznej. Paski błędów reprezentują SEM replikatów biologicznych (n = 5 myszy na Grupę). d komórki bc3_a2 nadprodukujące CEACAM5 wstrzyknięto do żył ogonowych myszy, a płuca wyizolowano i poddano IHC ze wskazanymi przeciwciałami. Paski skali wskazują 100 µm. komórki e z dodatnim zabarwieniem na CEACAM5, wimentin lub p-p38 w sekcjach tkanek przedstawionych w panelu d oznaczono ilościowo za pomocą automatycznego systemu obrazowania Vectra 3.0. Sparowane testy t, p = 0,0008 dla CEACAM5, P = 0,03 dla wimentiny i P = 0,03 dla p-p38. Paski błędów reprezentują SEM co najmniej trzech niezależnych replik biologicznych. f RNA wyizolowane z komórek BC3_A2 nadprodukujących CEACAM5 lub GFP i hodowane in vitro lub wyizolowane z płuc po wstrzyknięciu żyły ogonowej (in vivo, A, d) poddano analizie szlaku GSEA (dwie lewe kolumny). Pokazano procesy top 5 down-regulowane (niebieski) i top 5 up-regulowane (czerwony). Pola wskazują FDR <0.1 dla istotności statystycznej. Nes (znormalizowany wynik wzbogacania). Znaczenie tych szlaków w guzach P0 i P2 MFP vs. odpowiednie przerzuty do płuc pokazano dla porównania (prawe dwie kolumny). Dane są reprezentowane triplikatów biologicznych. Zob.również dodatkowe rys. 11

w celu monitorowania wpływu nadprodukcji CEACAM5 na ekspresję genu, komórki bc3_a2 zaprojektowane w celu nadmiernej produkcji CEACAM5 lub GFP hodowano in vitro lub wyizolowano z płuc po wstrzyknięciu żyły ogonowej (in vivo). RNA wyizolowano i poddano RNAseq. Przeprowadzono różnicową analizę ekspresji genów, a GSEA zidentyfikowało EMT jako jedyny szlak cech charakterystycznych raka, który został znacząco obniżony zarówno in vitro, jak i In vivo przez nadprodukcję CEACAM5 (Fig. 5F, dodatkowe rys. 11). Wynik ten jest podobny do obserwowanego w przerzutach P0 i P2 do płuc (Fig. 1c, 5f). Łącznie dane te wskazywały, że zwiększenie ekspresji CEACAM5 w zmianach przerzutowych indukuje MET i zwiększa wzrost przerzutowych komórek nowotworowych w miejscach drugorzędowych.

ekspresja CEACAM5 jest podwyższona w przypadku zmian przerzutowych u pacjentów z rakiem piersi

następnie oceniano ekspresję CEACAM5 w zmianach przerzutowych i tkance guza piersi uzyskanej od pacjentów z rakiem piersi. Barwienie IHC na dopasowanym zestawie tkanek składającym się z guza pierwotnego i przerzutów do płuc od pacjenta z rakiem piersi (dodatkowa Tabela 3) ujawniło wyższe poziomy CEACAM5 w przerzutach do płuc w stosunku do pierwotnego guza piersi (Fig. 6a i dodatkowe rys. 12A). Aby rozszerzyć te analizy, mikromacierz tkankowy (TMA) składający się z przerzutów do płuc od 25 pacjentów z rakiem piersi (dodatkowe Fig. 12B, c i tabela uzupełniająca 3) zostały zabrudzone dla CEACAM5 (rys. uzupełniająca. 12B), a intensywność barwienia przypisano wynik (rys. 6b). Ta metoda punktacji została również zastosowana do TMA z Atlasu białka ludzkiego składającego się z ludzkich guzów piersi zabarwionych na CEACAM5. 32 większość przerzutów do płuc wyrażała wysoki poziom CEACAM5 (Fig . 6c) w porównaniu z guzami piersi (rys. 6d), wykazując, że CEACAM5 był wyższy w przypadku zmian przerzutowych w porównaniu z pierwotnymi guzami piersi.

poziom białka CEACAM5 jest podwyższony w przerzutowych zmianach u pacjentów z rakiem piersi i jest odwrotnie skorelowany z ekspresją wimentiny. a pierwotny guz i odpowiadające mu przerzuty do płuc u pacjentki z rakiem piersi poddano IHC w celu monitorowania poziomu CEACAM5. Paski skali wskazują 100 µm. b mikromacierz tkanki nowotworowej (TMA) składający się z przerzutów do płuc u 25 pacjentów z rakiem piersi poddano IHC z przeciwciałem specyficznym dla CEACAM5 i oceniono intensywność barwienia. Pokazano reprezentacyjne obrazy. Paski skali wskazują 100 µm. c system punktacji w B został zastosowany do TMA składającego się z przerzutów do płuc u 25 pacjentek z rakiem piersi w celu oceny względnego poziomu CEACAM5. d system punktacji w B został zastosowany do TMA z Atlasu białka ludzkiego składającego się z 25 pierwotnych guzów piersi w celu oceny względnego poziomu CEACAM5. e pierwotny guz i odpowiadające mu przerzuty do płuc u pacjentki z rakiem piersi (od a) były jednocześnie barwione dla CEACAM5 i vimentin i analizowane za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego. Paski skali wskazują 100 µm. komórki f wykazujące dodatnie zabarwienie na CEACAM5, vimentin lub oba w sekcjach tkanek reprezentowanych w e oznaczono ilościowo za pomocą automatycznego systemu obrazowania Vectra 3.0. g TMA składający się z przerzutów do płuc u 25 pacjentek z rakiem piersi został przebazowany dla CEACAM5 i vimentin i przeanalizowany za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego. Pokazano reprezentacyjne obrazy. Paski skali wskazują 100 µm. komórki h, wykazujące dodatnie zabarwienie na CEACAM5, wimentin lub oba w sekcjach tkanek pokazanych w G, oznaczono ilościowo za pomocą automatycznego systemu obrazowania VECTRA 3.0. Zob.również dodatkowe rys. 12

następnie oceniliśmy dopasowany zestaw tkanek pod kątem koekspresji CEACAM5 i wimentiny. Jednoczesne barwienie dla CEACAM5 i vimentin ujawniło wyższe poziomy CEACAM5 w przerzutach do płuc w stosunku do dopasowanego guza piersi, i zaobserwowano Odwrotny wzór barwienia dla vimentin (Fig. 6e, f). Ponadto niewielka populacja komórek nowotworowych wykazywała współistniejące zabarwienie zarówno dla CEACAM5, jak i wimentiny (Fig. 6f). Komórki te, wykazujące dodatnie zabarwienie obu białek, mogą reprezentować komórki w hybrydowym stanie EMT / MET.TMA składający się z przerzutów do płuc u 25 pacjentek z rakiem piersi wykazywał również odwrotną korelację pomiędzy barwieniem CEACAM5 i wimentiną (Fig. 6g, h; Fig.uzupełniające 12a-e). Wyniki te potwierdziły wnioski z naszych modeli PDX TNBC i wykazały, że ekspresja CEACAM5 jest odwrotnie skorelowana z ekspresją wimentiny w pierwotnych guzach piersi i zmianach przerzutowych. Łącznie wyniki te sugerują, że CEACAM5 Promuje MET w celu ułatwienia wzrostu guza w miejscach przerzutów(dodatkowa Fig. 12A, b).