wszystkie metody w badaniach na ludziach i zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi.

izolacja i hodowla plastikowych adherentnych MSCs i cd271 immunopozytywnych MSCS z tkanki tłuszczowej

Po etycznym zatwierdzeniu przez National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC numer 12/ee/0136) i świadomej zgodzie wszystkich dawców, PA MSCs i CD271+ MSCs zostały wyizolowane z tego, co zostało zebrane jako chirurgiczne produkty odpadowe. AT zostało mielone i traktowane z 0.3 U/ml kolagenazy (Sigma, Dorset UK) przez dwie godziny w temperaturze 37 °C, po czym dodano zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco ’ s Eagle (Dmem) uzupełnioną 20% (obj./obj.) płodową surowicą cielęcą (FCS) oraz 1% (obj./obj.) penicyliną i streptomycyną (wszystkie z PAA, Yeovil, Somerset, UK) i odwirowano trawiony preparat w 600 g przez 10 minut. Otrzymany osad ponownie zawieszono w DMEM uzupełnionym 10% (v/v) FCS i 1% (v/v) penicyliną i streptomycyną, tj. standardowym pożywce hodowlanej i przepuszczono przez sitko komórkowe 100 µm (BD Biosciences, Berkshire, UK). Przesącz ponownie odwirowywano w temperaturze 600 g przez 10 minut, a granulowane komórki ponownie zawieszono w 5 ml standardowego podłoża hodowlanego i przepuszczono przez sitko komórkowe o średnicy 40 µm. Otrzymaną zawiesinę komórek poddano następnie działaniu buforu do lizy erytrocytów (Miltenyi Biotech, Surrey, Wielka Brytania) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dla każdego produktu w czasie przygotowywania, MSCs wyizolowano z komórek mononukleinowych obecnych po lizie erytrocytów poprzez ich zwiększoną adhezję do plastików hodowli tkankowej8 lub przez sortowanie komórek metodą magnetyczną (MAC) dla IMMUNOPOZYCYJNOŚCI CD27114. Komórki te hodowano w standardowej pożywce hodowlanej w nawilżonej atmosferze w temperaturze 37 °C z rutynowym przechodzeniem przez trypsynizację przy 80% zbiegu. PA MSCs i CD271+ MSCs na przejściach II-III były używane do wszystkich późniejszych eksperymentów. Do oceny wzbogacenia komórek CD271+ wykorzystano cytometrię przepływową (przy użyciu technologii MACS), w której świeżo wyizolowane komórki przechowywano w temperaturze -80 °C przez noc po izolacji, a następnie rozmrażano i natychmiast poddano je immunostacji dla CD271; dla wszystkich próbek >90% komórek było w tym momencie immunopozytywnych CD271 (dane nie pokazano).

protokoły różnicowania in vitro

zdolność różnicowania PA i CD271+ msc do tworzenia osteocytów, chondrocytów i adipocytów oceniano w sposób opisany poprzednio 8,45. Krótko, w celu osteogenezy, monowarstwowe Kultury MSCs traktowano 10 nM deksametazonem, 50 ng/ml kwasem askorbinowym i 1 mM glicerofosforanem beta (w porównaniu z kontrolami nośników) co 2-3 dni przez okres 4 tygodni, po czym Kultury zbierano przez utrwalenie i barwiono na aktywność fosfatazy zasadowej w następujący sposób: komórki utrwalano 10% obojętnym buforem formaliny przez 10 minut. W międzyczasie roztwór barwienia przygotowano przez umieszczenie 25 mg fosforanu naftolu (fosforan naftolu AS-MX: Sigma) w 0,5 ml dimetyloformamidu. Roztwór ten zmieszano z 50 ml 0,2 m buforu Tris-HCl zawierającego 50 mg szybkiego czerwonego TR (Sigma). Po dobrze wymieszanym roztworze końcowym filtrowano za pomocą bibuły filtracyjnej Whatman No.1 (Whatman). Następnie usunięto roztwór utrwalający i komórki przemyto PBS, a następnie dodano 1 ml roztworu barwiącego do każdej studzienki przez 1 godzinę. na koniec usunięto plamę i zarejestrowano cyfrowe obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu. Różnicowanie wzdłuż linii osteogennej oceniano dalej przez zwiększenie aktywności fosfatazy alkalicznej w zróżnicowanych komórkach w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (Biovision, USA) i zgodnie z protokołem producenta; krótko mówiąc, komórki homogenizowano w buforze testowym. Następnie homogenizowane komórki odwirowano w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału w ilości 13 000 g przez 3 minuty. Następnie 80 µl każdej z próbek załadowano do oddzielnych studzienek płytki 96-studzienkowej. Następnie do każdej studzienki próbki dodano 50 µl 5 mM roztworu pNPP. Po etapie mieszania przez pipetowanie w górę i w dół studzienki inkubowano w temperaturze 25 °C przez 60 minut. Krzywą wzorcową uzyskano przez rozcieńczenie 40 µl 5 mM pNPP do 160 µl buforu testowego w celu wytworzenia 1 mM normy pNPP. Następnie 0, 4, 6, 12, 16 i 20 µl tego standardowego roztworu załadowano do płytki 96-studzienkowej w celu wytworzenia norm pNPP 0-20 nmol/ml, które można zmierzyć spektrofotometrią. W przypadku chondrogenezy, granulki komórkowe przygotowano w DMEM / High glucose (Sigma) uzupełnionym 100 nM deksametazonem (DEX), 37.5 µg/ml askorbinianu-2-fosforanu, 1% (obj./obj.) insuliny, transferyny i selenu (ITS-X100; Sigma) i 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londyn, Wielka Brytania) oraz penicyliny i streptomycyny. Kultury kontrolne traktowano dmem/pożywką o wysokiej zawartości glukozy z samymi nośnikami, tj. metanolem, jałową wodą i BSA w odpowiednich rozcieńczalnikach. W dniu 28 zbadano różnicowanie chondrogenne histologicznie przez ustalenie granulek w 10% neutralnej buforowanej formalinie, a następnie osadzenie w parafinie i cięcie tkanek, które zabarwiono błękitem Toluidynowym (Sigma) jako markerem syntezy proteoglikanów8. Ponadto poziom glikozaminoglikanu wydzielanego do podłoża różnicującego w ciągu ostatnich 24 godzin hodowli przed zbiorem w dniu 28 mierzono za pomocą testu DMMB. Protokół testu DMMB został zaadaptowany z metody Farndale et al., 1986 r. 46: (i) roztwór barwnika DMMB otrzymano przez dodanie 3.04 g glicyny, 2,37 G NaCl i 16 mg od 1,9 DMMB do 1 litra dejonizowanej wody; (ii) pH dostosowano do 3,0 kwasem solnym i roztwór barwnika przechowywano w brązowej butelce; (iii) 50 µl porcji pożywki hodowlanej zebranej z rusztowań nasadzonych komórkami w dniu 28 Dodano w trzech egzemplarzach do płytki 96 studzienek; (iv) 200 µl roztworu barwnika DMMB dodano do pożywki hodowlanej i absorbancja oceniony przy 540 nm natychmiast. Siarczan chondroityny (CS) z chrząstki rekina (Sigma) wykorzystano do uzyskania standardowej krzywej absorbancji (0-40 µg/ml, CS), na podstawie której obliczono zawartość GAG w próbkach pożywki hodowlanej. Poziomy absorbancji dla zawartości GAG w próbkach pożywki hodowlanej znormalizowano w celu uwzględnienia absorbancji tła wynikającej z obecności Czerwieni fenolowej w pożywce poprzez rozpuszczenie wzorców w pożywce DMEM. Dla adipogenezy Kultury MSC utrzymywano w pożywkach zawierających 1 µM DEX, 0.5 mM 3-izobutylo-metyloksantyny (Sigma), 1% insuliny, transferryny i selenu (jego-x 100 pre-mix; PAA) i 100 µM indometacyny (Sigma), przez 28 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2, jak opisano poprzednio47. Komórki kontrolne utrzymywano w kompletnych nośnikach z nośnikami. Różnicowanie zbadano za pomocą barwienia kropel lipidowych na Czerwono O. Komórki utrwalano w 10% neutralnym buforze formaliny przez 1 godzinę, po czym dodano roztwór barwiący. Względną kumulację Czerwieni olejowej o mierzono po obróbce 100% izopropanolem przez 15 minut i odczytaniu absorbancji supernatantu przy 540 nm za pomocą spektrofotometru.

przeszczep MSC do modelu defektu osteochondralnego kości udowej

Po instytucjonalnym przeglądzie etycznym i zatwierdzeniu (instytucjonalne Komitety opieki i użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Fukui, Wydział Ortopedii i rehabilitacji medycyny: Numer zatwierdzenia 25-053), żeńskie nagie szczury athymiczne (F344/N Jcl rnu/RNU, CLEA Japan, Inc. Tokio, Japonia) W wieku 6-10 tygodni i masie ciała 150-170 gramów losowo przydzielono do następujących grup: (i) PA MSCs (n = 6 zwierząt); (ii) CD271+ MSCS (N = 6 zwierząt); (iii) grupa kontrolna samego rusztowania tarczowego Alfa Chondro (bez komórek, n = 3 Zwierzęta). Te liczby zwierząt na Grupę były wcześniej wykorzystywane w tym samym instytucie w celu wykazania znaczących różnic między grupami leczonymi na poziomie 5% 48. Szczury były znieczulane przez ekspozycję na 3% izofluran w gazie O2 i utrzymywały się na poziomie 1,5% izofluranu w Gazie O2 podczas operacji. Po sterylizacji kolan przy użyciu 70% etanolu wykonano nacięcie przyśrodkowe skóry parapatellarnej, a następnie rozcięto mięsień, a następnie odsłonięto staw kolanowy przez boczne zwichnięcie rzepki. Obustronne wady osteochondralne o średnicy 2 mm i głębokości 1 mm powstały w rowku rzepkowym kości udowej każdego zwierzęcia przy użyciu wiertła chirurgicznego o średnicy 2 mm. Alpha Chondro Shield był używany jako nośnik/rusztowanie komórkowe do dostarczania 5 × 104 PA MSCs lub CD271 + MSCS w porównaniu z komórkami no (jako kontrolnymi). Przed przeszczepieniem komórki zbierano przez trypsynizację i wysiewano w objętości 10 µl standardowego pożywki hodowlanej na dyski Alfa Chondro Shield o średnicy 2 mm, a następnie inkubowano w nawilżonej atmosferze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut w celu promowania przylegania komórek i włączania ich do rusztowania. Rusztowania komórkowe i kontrolne przeszczepiono do wad i zamocowano na miejscu za pomocą kleju fibrynowego, który pozostawiono na około 10-20 sekund (rys. 6). Rzepkę przeniesiono, a tkankę łączną i skórę zszyto szwami nylonowymi. Zwierzęta mogły swobodnie poruszać się po wyzdrowieniu i karmiły się standardową dietą podtrzymującą i wodą ad libinum. W 3 tygodniach po transplantacji zwierzęta uśmiercano przez przedawkowanie 3% izofluranu w celu zbadania stopnia naprawy rany makroskopowo i histologicznie.