Serieel passaging van de longen uitzaaiingen in vivo een verrijking voor gemetastaseerde potentiële

De PDX lijn WU-BC3 werd gegenereerd door engrafting borst tumor cellen van een patiënt met uitgezaaide TNBC in de vermenselijkte uiervet pads (Mfp ‘ s) NOD/SCID muizen muizen.26,27 we hebben deze tumorcellen ontworpen om stabiel Klikbeet rode Luciferase (CBR-Luc), MCHERRY, en een shRNA specifiek voor p53 (shA2) te maken van de PDX lijn BC3_A2 (voorheen bekend als BC3-p53KD28) (aanvullende Fig. 1 bis). We toonden aan dat tumorcellen metastaseerden van MFP ‘ s naar fysiologisch relevante locaties, waaronder longen, lever, bot, hersenen en lymfeklieren.28 longmetastasen (P0) werden geïsoleerd uit replicaatmuizen, samengevoegd en geënt in de MFP ‘ s van recipiente muizen. De resulterende longmetastasen (P1) werden geïsoleerd, samengevoegd en geënt in de MFP ‘ s van extra muizen. De longmetastasen van deze muizen (P2) werden ook verzameld en samengevoegd (aanvullende Fig. 1 ter). We voerden bioluminescentie beeldvorming (BLI) van longen, botten en levers bij necropsie om de relatieve omvang van metastase bij elke passage te kwantificeren (aanvullende Fig. 1c). Seriële passaging verrijkt voor tumorcellen met verhoogde capaciteit om metastaseren naar alle plaatsen (aanvullende Fig. 1d-f, h) en vereist dat muizen eerder worden geëuthanaseerd (aanvullende Fig. 1). In tegenstelling, seriële passaging tumoren tussen MFP ‘ s niet resulteerde in verhoogde longmetastase (aanvullende Fig. 1g), die erop wijst dat de verwerving van verbeterde metastatische capaciteit niet eenvoudig een gevolg was van het in vivo overgaan van tumors in serie. Bovendien, tumorcellen met verhoogde metastatische capaciteit vertoonden geen significante toename van de groeieigenschappen wanneer geà soleerd uit MFP ’s en terug geplaatst in de MFP’ s van ontvangende muizen (aanvullende Fig. 1j). Samen tonen deze resultaten aan dat het serieel overgaan van tumorcellen van longen naar MFP ‘ s in dit model verrijkt voor metastatisch potentieel maar niet orgaan-specifieke homing.

mesenchymale genexpressie is verminderd in longmetastasen ten opzichte van MFP tumoren

om veranderingen in genexpressiepatronen te identificeren die metastasen begeleiden, hebben we RNA-sequencing (RNAseq) uitgevoerd op longmetastasen (P0 en P2) en MFP (P0 en P2) tumoren (Fig. 1a en aanvullende tabel 1). Na het aftrekken rnaseq leest mapping aan de muis transcriptome, slechts menselijke transcript leest werden gebruikt voor stroomafwaartse analyses. De belangrijkste componentanalyse (PCA) onthulde verminderde discordantie onder biologische replicaten met herhaalde passaging in vivo, aangezien biologische replicaten van P2 tumormonsters nauwer met elkaar dan met andere geanalyseerde subpopulaties (Fig. 1 ter). Gen Set Enrichment Analysis (GSEA) bleek dat EMT was de meest significant downregulated route in zowel P0 en P2 longmetastasen ten opzichte van MFP tumoren (Fig. 1c). TGF-β-signalering, die EMT reguleert, was ook significant down-gereguleerd in zowel P0 als P2 longmetastasen (Fig. 1c).

werd Quantitative real time (qRT-PCR) uitgevoerd om de expressie van vimentin, een mesenchymale marker, in MFP-tumoren en longmetastasen gedurende seriële passaging te controleren. Vimentin expressie vertoonde een dynamisch patroon met hogere expressie in MFP tumoren ten opzichte van overeenkomstige longmetastasen bij elke passage (Fig. 1d) en levermetastasen bij P0 (aanvullende Fig. 2 bis). Vimentin eiwit niveaus samengevat dit dynamische patroon (Fig. 1e). Extra EMT genen werden ook downregulated in longmetastasen ten opzichte van overeenkomstige MFP tumoren (Fig. 1f). De expressie van de mesenchymale marker CDH2 (het gen dat n-cadherin codeert) volgde hetzelfde patroon als vimentin (aanvullende Fig. 2b), terwijl de uitdrukking van de epitheliale marker CDH1 (het gen dat e-cadherin codeert) een omgekeerde tendens vertoonde (aanvullende Fig. 2c). Co-geënt menselijke stromale fibroblasten werden verwijderd door de tijd van tumoroogst (aanvullende Fig. 3a-f), uitsluiten van de mogelijkheid dat zij hebben bijgedragen aan de expressie van mesenchymale markers in MFP tumoren. Samen genomen, tonen deze resultaten aan dat de tumors neerregulate uitdrukking van mesenchymal genen eens gevestigd in metastatische plaatsen.

bepaling van de bibliotheekcomplexiteit voor high throughput gain of function screen

een high throughput gain-of-function (GOF) scherm werd ontworpen om functionele drivers van metastase te identificeren uit onze P2 longmetastasen handtekening. HOXA1,een bekende bestuurder van metastase, diende 29 als positieve controle voor schermoptimalisatie, en GFP werd gebruikt als negatieve controle. Bc3_a2 cellen werden getransduced met lentivirus coderen of hoxa1 of GFP, en besmette tumorcellen werden gemengd in verschillende verhoudingen (aanvullende Fig. 4a). De gemengde populaties van tumorcellen werden toen geënt in de MFPs van ontvangende muizen, en BLI werd gebruikt om longmetastasen op het moment van necropsie (aanvullende Fig. 4b). In een tweede reeks experimenten, werd metastatische bestuurder ID19 gebruikt in combinatie met GFP, maar in dit geval werden de gemengde populaties van tumorcellen ingespoten in de staartader van ontvangermuizen om de definitieve stadia van metastase (aanvullend Fig. 4c). Een significante verhoging van fotonflux werd waargenomen van tumors met een hoxa1: GFP of ID1: GFP Verhouding van 1:10. Deze complexiteitstests toonden aan dat een bonafide metastase driver in ons scherm kan worden gedetecteerd als het wordt samengevoegd met 9 open leesframes (ORFs) zonder bestuurder, maar een pool van één bestuurder met 19 niet-bestuurders maskeerde ons vermogen om de bestuurder te detecteren. Op basis van deze resultaten hebben we onze poolgrootte beperkt tot 12 ORF ‘ s.

high throughput gain-of-function screening in vivo identificeert kandidaat functionele drivers van TNBC metastase

om te bepalen welke van de upregulated genen van de P2 long metastase signatuur in staat waren om longmetastase aan te drijven, ontwierpen we aangepaste barcoded lentivirale bibliotheken die coderen voor de ORF ‘ s van de 230 genen die het meest upregulated waren in longmetastasen. ORF ’s werden individueel uitgedrukt in bc3_a2 cellen zodat elke cellijn een enkele ORF uitdrukte, cellen werden vervolgens samengevoegd in groepen van 12, en pools werden geïmplanteerd in de MFP’ s van recipiente muizen (n = 10 muizen per pool, Fig. 2 bis). Een controle plasmide die GFP uitdrukt werd opgenomen in elke pool om intrinsieke metastase in dit TNBC-model te meten. Elke ORF werd geassocieerd met een unieke DNA-barcode. Een referentiepellet van gepoolde cellen werd plotseling bevroren om gelijke vertegenwoordiging van elke ORF op het moment van tumorimplantatie te bevestigen. Dertien weken werd gekozen als studie eindpunt omdat hoxa1, maar niet GFP-expressie tumoren, gemetastaseerd aan Long tegen dit tijdstip (aanvullende Fig. 5a). Dertien weken na de engraftment werden de longen onderworpen aan BLI ex vivo (aanvullende Fig. 5a), werden metastatische letsels geà soleerd, en genomic DNA (gDNA) werd gehaald en als malplaatje voor qPCR gebruikt om unieke barcodegebieden te versterken verbonden aan elke ORF (aanvullende Fig. 5b). MFP tumoren werden ook geïsoleerd en onderworpen aan deze analyses (Fig. 2 bis). De representatie van elke barcoded ORF in het MFP ten opzichte van het referentiemonster werd bepaald voor elke pool (Fig. 2b; aanvullende vijgen. 5c, d). Representatie in de long werd vervolgens genormaliseerd tot verrijking in MFP ‘ s VS.de referentie (Fig. 2b, c). Metastase drivers gescheiden in drie groepen, met inbegrip van die verrijkt in zowel longen en MFP ‘ s (Fig. 2b, kwadrant rechtsboven en aanvullende Fig. 5c), die uitsluitend verrijkt in MFP ‘ s (Fig. 2b, rechtsonder kwadrant) en die uitsluitend verrijkt in longen (Fig. 2b, kwadrant linksboven en Fig. 2c). Cellen die GFP uitdrukken werden verrijkt in longmetastasen in sommige pools en de gemiddelde verrijkingsscore voor GFP in de Long was ongeveer 5 (aanvullende Fig. 5e). Daarom gebruikten we dit als een verrijking score cutoff om een echte hit in ons scherm te definiëren en identificeerden we 44 genen die selectief werden verrijkt in longmetastasen ten opzichte van primaire tumoren. Deze hits werden gerangschikt op verrijkingsscore (Fig. 2c en aanvullende tabel 2). Onder de top vijf hits, CEACAM5 was de enige wiens expressie in primaire tumoren werd gevonden om slechte overleving te voorspellen bij borstkankerpatiënten (aanvullende Fig. 6 bis). Daarom hebben we de functionele rol van CEACAM5 bij borstkanker metastase verder onderzocht.

bevestiging van verbeterde CEACAM5-expressie in additionele metastatische PDX-modellen

We vonden dat CEACAM5-expressie dynamisch gereguleerd was omdat metastatische subpopulaties in vivo serieel tussen longen en MFP ‘ s werden gepasseerd (Fig. 3a), ter bevestiging van de bevindingen van RNAseq (aanvullende tabel 1 en aanvullende Fig. 6b). Ook CEACAM5 expressie was hoger in de lever (aanvullende Fig. 7a) en hersenen (aanvullende Fig. 7b) metastasen ten opzichte van overeenkomstige MFP tumoren. CEACAM5 eiwit niveaus waren ook hoger in longmetastasen ten opzichte van MFP tumoren (Fig. 3b). De toename van de expressie van CEACAM5 in gemetastaseerde laesies was niet afhankelijk van het tot zwijgen brengen van p53 in deze PDX-lijn, aangezien longmetastasen van de isogene PDX-lijn die het wild type p5326 uitdrukt,30 ook hogere expressieniveaus van CEACAM5 vertoonden (aanvullende Fig. 7c).

een tweede reeks PDX-modellen van TNBC (PIM001) werd geëvalueerd om te bepalen of de toename van CEACAM5 in gemetastaseerde laesies een algemene eigenschap van metastase was. PIM001-P werd vastgesteld op basis van de niet eerder behandelde primaire tumor van een patiënt met gemetastaseerde TNBC, terwijl PIM001-M werd vastgesteld op basis van de dermale metastase van dezelfde patiënt. Pim001-p tumorcellen werden ontworpen om zowel CBR-Luc als MCHERRY tot expressie te brengen en vervolgens geënt in de MFP ‘ s van de ontvangende muizen. Op het moment van necropsie werden MFP-tumoren en longmetastasen geïsoleerd. De expressie van CEACAM5 werd verhoogd bij beide mRNA-niveaus (Fig. 3c) en eiwit-niveaus (Fig. 3d) in pim001-P longmetastasen vergeleken met overeenkomstige MFP tumoren. Interessant, CEACAM5 eiwit niveaus waren hoger in PDX MFP tumoren vastgesteld van de patiënt dermale metastase (PIM001-M) vergeleken met de PDX MFP tumoren vastgesteld van haar primaire Borst tumor (PIM001-P) (aanvullende Fig. 7d). Collectief, tonen deze resultaten aan dat verhoging van CEACAM5 een gemeenschappelijke eigenschap van metastasen in PDX modellen van TNBC is.

CEACAM5-expressie is omgekeerd gecorreleerd met vimentine-expressie en fosforylering van p38

omdat de expressie van CEACAM5 in PDX-modellen omgekeerd gecorreleerd was met de expressie van vimentine (Fig. 1d, 3a; aanvullende Fig. 2a en 7a, b), immunohistochemie (IHC) werd gebruikt om longmetastasen en MFP tumoren voor relatieve niveaus van vimentin en CEACAM5 controleren. Eiwitniveaus correleerden met mRNA-niveaus in beide PDX-modellen (Fig. 3e, f). Vimentin expressie werd ook omgekeerd gecorreleerd met CEACAM5 expressie in een panel van borstkankercellijnen (Fig. 3g). Het serine / threonine-specifieke eiwitkinase p38alpha (ook bekend als MAPK14, hierna aangeduid als p38) wordt gefosforyleerd tijdens EMT.Interessant is dat gefosforyleerd (actief) p38 correleerde met hoge expressie niveaus van vimentine in MFP tumoren, en P38 fosforylering verminderde in longmetastase waar vimentine niveaus laag waren (Fig. 3h). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat de expressie van CEACAM5 omgekeerd gecorreleerd is met de expressie van EMT-markers in longmetastasen.

ectopische overproductie van CEACAM5 remt TGF-β-signalering en expressie van EMT-markers

aangezien CEACAM5-expressie omgekeerd gecorreleerd is met de mesenchymale status, hebben we onderzocht of CEACAM5 een directe rol had in het reguleren van expressie van mesenchymale markers. Bc3_a2 cellen die worden ontworpen om menselijke CEACAM5 of GFP als negatieve controle te overproduceren (aanvullende Fig. 8a, b) werden onderzocht op expressie van vimentin en CDH2/N-cadherin (mesenchymale markers) en CDH1/E-cadherin (epitheliale marker). Overexpressie van CEACAM5 leidde tot verhoogde expressie van CDH1 (aanvullende Fig. 8c) en verminderde expressie van CDH2 (aanvullende Fig. 8d) en vimentin (aanvullende Fig. 8e). Bovendien verminderde en vertraagde de overproductie van CEACAM5 TGF-β gemedieerde fosforylatie van Smads in bc3_a2 cellen (Fig. 4a, c, aanvullende Fig. 9a) en P38 fosforylering in beide bc3_a2 cellen (Fig. 4a, B, aanvullende Fig. 9a) en MDA-MB-231 cellen (aanvullende Fig. 8f, aanvullende Fig. 9b). Ten slotte vertraagde de overproductie van CEACAM5 TGF-β-geïnduceerde EMT zoals beoordeeld door e-cadherin en vimentin expressie (Fig. 4d, aanvullende Fig. 9c). Deze resultaten suggereren dat CEACAM5 negatief EMT reguleert en een functie voor CEACAM5 in borstkanker metastase identificeert.

overproductie van CEACAM5 bevordert gemetastaseerde uitgroei en vermindert EMT in vivo

EMT wordt geassocieerd met verminderde cellulaire proliferatie.19 aldus, stelde de capaciteit van CEACAM5 om EMT te remmen voor dat het kan functioneren om tumoruitgroei bij metastatische plaatsen te bevorderen. Om deze hypothese te testen, werden de bc3_a2 cellen die aan overproduce CEACAM5 of GFP (controle) worden gebouwd ingespoten in de staartaders van ontvangende muizen om de gevolgen van CEACAM5 overproductie op tumorgroei in de long te controleren. Overexpressie van CEACAM5 leidde tot verhoogde tumorgroei in de longen (Fig. 5a en aanvullende Fig. 10a), verminderde expressie van vimentin op het eiwitniveau (aanvullende Fig. 10b), en verminderde phosphorylation van p38 (Fig. 5d, e). Verlaging van CEACAM5-niveaus in BC3_A2 met twee verschillende shRNA ‘ s (Fig. 5b) had het tegenovergestelde effect in die zin dat getransduceerde cellen langzamer groeiden in de longen dan controlecellen na injectie van de staartader (Fig. 5c en aanvullende Fig. 10c). Bovendien resulteerde het neerslaan van CEACAM5 in een verhoogd laesieaantal, maar verminderde de laesiegrootte (aanvullende Fig. 10d, e). Deze resultaten suggereren dat het tot zwijgen brengen van CEACAM5 EMT en tumorcelextravasatie bevordert terwijl tegelijkertijd metastatische uitgroei wordt geremd.

om te controleren hoe overproductie van CEACAM5 de genexpressie beïnvloedde, werden bc3_a2-cellen die ontworpen zijn om CEACAM5 of GFP over te produceren in vitro gekweekt of geïsoleerd uit de long na injectie van de staartader (in vivo). RNA werd geïsoleerd en onderworpen aan RNAseq. De differentižle genuitdrukkingsanalyse werd uitgevoerd, en gsea identificeerde EMT als de enige weg van het kankerkeurmerk die zowel in vitro als in vivo significant door CEACAM5-overproductie werd verminderd (Fig. 5f, aanvullende Fig. 11). Dit resultaat is vergelijkbaar met dat waargenomen bij P0 en P2 longmetastasen (Fig. 1c, 5f). Collectief, gaven deze gegevens aan dat upregulation van ceacam5 uitdrukking in metastatische laesies ontmoet veroorzaakt en de uitgroei van metastatische tumorcellen in secundaire plaatsen verbetert.

CEACAM5 expressie is upregulated in gemetastaseerde laesies van borstkanker patiënten

vervolgens werd CEACAM5 expressie beoordeeld in gemetastaseerde laesies en borsttumorweefsel verkregen van patiënten met borstkanker. IHC kleuring op een matched Weefsel set bestaande uit een primaire tumor en een long metastase van een patiënt met borstkanker (aanvullende tabel 3) bleek hogere CEACAM5 niveaus in de long metastase ten opzichte van de primaire Borst tumor (Fig. 6a en aanvullende Fig. 12 bis). Om deze analyses uit te breiden, een weefsel microarray (TMA) bestaande uit longmetastasen van 25 borstkankerpatiënten (aanvullende vijgen. 12b, c en aanvullende tabel 3) is gekleurd voor CEACAM5 (aanvullende Fig. 12b), en kleuring intensiteit werd toegewezen een score (Fig. 6b). Deze scoringsmethode werd ook toegepast op een TMA van de menselijke Eiwitatlas bestaande uit menselijke borsttumoren gekleurd voor CEACAM5.32 de meerderheid van longmetastasen uitgedrukt hoge niveaus van CEACAM5 (Fig. 6c) vergeleken met borsttumoren (Fig. 6d), waaruit blijkt dat CEACAM5 hoger was in gemetastaseerde laesies in vergelijking met primaire borsttumoren.

vervolgens beoordeelden we de overeenkomende weefselset voor co-expressie van CEACAM5 en vimentin. Co-kleuring voor CEACAM5 en vimentin onthulde hogere niveaus van CEACAM5 in de longmetastase ten opzichte van overeenkomende borsttumor, en het omgekeerde kleuringspatroon werd waargenomen voor vimentin (Fig. 6e, f). Bovendien vertoonde een minder belangrijke populatie tumorcellen co-kleuring voor zowel CEACAM5 als vimentin (Fig. 6f). Die cellen die positief voor beide proteã nen bevlekken kunnen cellen in een hybride EMT/MET staat vertegenwoordigen.De TMA bestaande uit longmetastasen van 25 borstkankerpatiënten toonde ook een omgekeerde correlatie aan tussen CEACAM5 en vimentin kleuring (Fig. 6g, h; aanvullende vijgen. 12a-e). Deze resultaten bevestigden conclusies gemaakt met onze PDX modellen van TNBC en toonden aan dat CEACAM5 expressie omgekeerd gecorreleerd is met vimentin expressie in primaire borsttumoren en gemetastaseerde laesies. Samen genomen, stellen deze resultaten voor dat CEACAM5 MET bevordert om tumoruitgroei op metastatische plaatsen te vergemakkelijken (aanvullend figuur 12a, b).