alle methoden in humane en dierlijke studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante institutionele richtlijnen en voorschriften.

isolatie en kweek van plastic adherente MSC ’s en CD271 immunopositieve MSC’ s uit vetweefsel

na ethische goedkeuring van de National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC nummer 12/EE / 0136) en geïnformeerde toestemming van alle donoren, PA MSC ’s en CD271+ MSC’ s werden geïsoleerd uit AT die als chirurgisch afvalproducten waren geoogst. DE AT werd gehakt en behandeld met 0.3 U / ml collagenase (Sigma, Dorset UK) gedurende twee uur bij 37 °C, waarna Dulbecco ‘ s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 20% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS) en 1% (v/v) penicilline en streptomycine (alle uit PAA, Yeovil, Somerset, UK) werd toegevoegd en het verteerde preparaat werd gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 10 minuten. De resulterende pellet werd opnieuw gesuspendeerd in DMEM aangevuld met 10% (v/v) FCS en 1% (v/v) penicilline en streptomycine, d.w.z. standaardkweekmedium, en ging door een 100 µm celzeef (BD Biosciences, Berkshire, UK). Het filtraat werd opnieuw gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 10 minuten en de gepelleteerde cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een standaardkweekmedium van 5 ml en door een celzeef van 40 µm geleid. De resulterende celsuspensie werd vervolgens behandeld met erytrocyt Lysis Buffer (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voor elk bij voorbereiding, werden MSCS geà soleerd uit de mononucleated cellen huidig na erytrocyt lysis door hun verhoogde adhesie aan weefselkweek plastic8 of door magnetisch geassocieerd celsorteer (Macs) voor CD271 immunopositivity14. Deze cellen werden gekweekt in standaardkweekmedium in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C met routinepassage door trypsinisatie bij 80% confluentie. PA MSCs en CD271+ MSCS op passages II-III werden gebruikt voor alle latere experimenten. Cytometry stroom werd gebruikt om de verrijking voor CD271+ cellen (gebruikend MACS-technologie) te beoordelen, waar de vers geïsoleerde cellen bij -80 °C ‘ s nachts na isolatie werden opgeslagen, en toen ontdooid en onmiddellijk immunostained voor CD271; voor alle steekproeven, >90% van cellen CD271 immunopositief op dit tijdstip waren (gegevens niet getoond).

in vitro differentiatieprotocollen

De differentiatiecapaciteit van PA en CD271+ MSC ‘ s om osteocyten, chondrocyten en adipocyten te vormen werd beoordeeld zoals eerder beschreven 8.45. Voor de osteogenese werden monolaagculturen van MSC ‘ s gedurende een periode van 4 weken om de 2-3 dagen behandeld met 10 nM dexamethason, 50 ng/ml ascorbinezuur en 1 mM bèta-glycerofosfaat (versus dragercontrollers), waarna de culturen werden geoogst door fixatie en gekleurd voor alkalische fosfatase-activiteit als volgt: cellen werden gefixeerd met 10% neutrale bufferformaline gedurende 10 minuten. Ondertussen werd de kleuringsoplossing bereid door 25 mg naftolfosfaat (naftol as-MX fosfaat: Sigma) in 0,5 ml dimethylformamide te plaatsen. Deze oplossing werd gemengd met 50 ml van 0,2 M Tris-HCl-buffer met 50 mg fast red TR (Sigma). Na het goed mengen werd de uiteindelijke oplossing gefilterd met Whatman No.1 filterpapier (Whatman). De fixatieve oplossing werd vervolgens verwijderd en de cellen werden gewassen met PBS, vervolgens werd 1 ml van de kleuringsoplossing toegevoegd aan elk putje gedurende 1 uur. tenslotte werd de vlek verwijderd en gedigitaliseerde beelden werden vastgelegd met een omgekeerde microscoop. Differentiatie langs de osteogene lijn werd verder geëvalueerd door verhoogde hoeveelheid alkalische fosfatase activiteit in gedifferentieerde cellen in vergelijking met ongedifferentieerde cellen met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (Biovision, USA) en door het volgen van het Protocol van de fabrikant; kortom, cellen werden gehomogeniseerd in de assay buffer. De gehomogeniseerde cellen werden vervolgens gecentrifugeerd om onoplosbaar materiaal bij 13.000 g gedurende 3 minuten te verwijderen. Vervolgens werd 80 µl van elk van de monsters in afzonderlijke putjes van een 96-putplaat geladen. Vervolgens werd 50 µl van 5 mM pnpp-oplossing aan elk monsterputje toegevoegd. Na een mengstap door pipetteren op en neer, werden de putten geïncubeerd bij 25 °C gedurende 60 minuten. Een standaardcurve werd gegenereerd door 40 µl van 5 mM pNPP te verdunnen tot 160 µl assaybuffer om 1 mM pnpp-standaard te genereren. Vervolgens werd 0, 4, 6, 12, 16 en 20 µl van deze standaardoplossing in een 96-wells-plaat geladen om 0-20 nmol/ml pNPP-normen te genereren die met spectrofotometrie konden worden gemeten. Voor chondrogenese werden celkorrels bereid in DMEM / hoge glucose (Sigma) aangevuld met 100 nM dexamethason (DEX), 37.5 µg / ml ascorbaat-2-fosfaat, 1% (vol/vol) insuline, transferrine en selenium (ITS-X100; Sigma) en 10 ng/ml transformerende groeifactor-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londen, VK), en penicilline en streptomycine. Controleculturen werden behandeld met DMEM/high glucose media met dragers alleen, d.w.z. methanol, steriel water en BSA bij geschikte verdunningen. Op dag 28 werd chondrogene differentiatie histologisch onderzocht door de pellets te fixeren in 10% neutraal gebufferde formaline, vervolgens in te bedden in paraffine en weefselsecties te snijden, die gekleurd waren met toluïdine blauw (Sigma) als marker van proteoglycansynthese8. Bovendien werd de hoeveelheid glycosaminoglycaan die in de laatste 24 uur van de kweek voorafgaand aan de oogst op dag 28 in het differentiatiemedium werd uitgescheiden, gemeten met behulp van de dmmb-test. Het dmmb-testprotocol werd aangepast aan de methode van Farndale et al., 1986 als volgt46: (i) de dmmb-kleurstofoplossing werd bereid door toevoeging van 3.04 g glycine, 2.37 g NaCl en 16 mg 1,9 DMMB tot 1 liter gedemineraliseerd water; (ii) de pH werd aangepast 3.0 met zoutzuur en de kleurstof in oplossing werd opgeslagen in een bruine fles; (iii) 50 µl van monsters van de cultuur medium geoogst uit de cel geplaatste steigers op dag 28 waren toegevoegd in drievoud aan een 96-wells plaat; (iv) 200 µl van de DMMB kleur-oplossing was toegevoegd aan het kweekmedium en de extinctie werd beoordeeld bij 540 nm onmiddellijk. Chondroïtinesulfaat (CS) uit haaienkraakbeen (Sigma) werd gebruikt om een standaard absorptiecurve te verkrijgen (0-40 µg/ml, CS) waaruit het GAG-gehalte in de monsters van kweekmedium werd berekend. De absorptieniveaus voor GAG-gehalte in de monsters van kweekmedium werden genormaliseerd om rekening te houden met de achtergrondabsorptie als gevolg van de aanwezigheid van fenolrood in het medium door de normen in DMEM-medium op te lossen. Voor adipogenesis, werden MSc culturen gehandhaafd in cultuurmedia die 1 µM Dex, 0 bevatten.5 mM 3-isobutyl-methylxanthine (Sigma), 1% insuline, transferrine en selenium (its-x 100 pre-mix; PAA) en 100 µM indomethacine (Sigma), gedurende 28 dagen bij 37 °C en 5% CO2, zoals eerder beschreven 47. Controlecellen werden in volledige media met dragers gehandhaafd. Differentiatie werd onderzocht met behulp van Oil Red o kleuring van lipide druppels. De cellen werden gedurende 1 uur gefixeerd in 10% neutrale bufferformaline waarna de kleuringsoplossing werd toegevoegd. De relatieve Oil Red o-accumulatie werd gemeten na behandeling met 100% isopropanol gedurende 15 minuten en met behulp van een spectrofotometer werd de absorptie van het supernatans bij 540 nm afgelezen.MSc transplantation into a femoral osteochondral defect model

na institutionele ethische beoordeling en goedkeuring (the Institutional Animal Care and Use Committee of Fukui University, Department of Orthopaedics and Rehabilitation Medicine: erkenningsnummer 25-053), vrouwelijke athymische naakte ratten (F344 / N Jcl rnu/ rnu, CLEA Japan, Inc. Tokio, Japan) van 6-10 weken oud en met een gewicht van 150-170 gram werden willekeurig ingedeeld in de volgende groepen: (I) PA MSCs (n = 6 dieren); (ii) CD271+ MSCS (n = 6 dieren); (iii) een controlegroep van alleen Alpha Chondro Shield scaffold (geen cellen, n = 3 dieren). Deze aantallen dieren per groep zijn eerder in hetzelfde instituut gebruikt om significante verschillen tussen de behandelingsgroepen aan te tonen op het niveau van 5% 48. De ratten werden verdoofd door blootstelling aan 3% isofluraan in O2-gas en bleven tijdens de operatie op 1,5% isofluraan in O2-gas. Na het steriliseren van de knieën met behulp van 70% ethanol, een mediale parapatellaire huid incisie werd gemaakt, gevolgd door ontleden door de spier en vervolgens bloot het kniegewricht door laterale dislocatie van de patella. Bilaterale osteochondrale afwijkingen van 2 mm diameter en 1 mm Diepte werden gemaakt in de patellaire groef van het dijbeen van elk dier met behulp van een 2 mm diameter chirurgische boor. Alpha Chondro Shield werd gebruikt als de celdrager / steiger om 5 × 104 PA MSCS of CD271+ MSCS versus geen cellen (als controles) te leveren. Voorafgaand aan de transplantatie werden de cellen door trypsinisatie geoogst en in een volume van 10 µl standaardkweekmedium gezaaid op schijven van Alpha Chondro Shield met een diameter van 2 mm, waarna ze gedurende 30 minuten in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C en 5% CO2 werden geïncubeerd om de celhechting en opname in het schavot te bevorderen. De cel-gezaaide en controle scaffolds werden getransplanteerd in de defecten en gefixeerd op zijn plaats met fibrine lijm, die werd toegestaan om te zetten voor ongeveer 10-20 seconden (Fig. 6). De knieschijf werd verplaatst en het bindweefsel en de huid werden gehecht met nylon hechtingen. Dieren mochten zich vrij verplaatsen na herstel en kregen een standaard onderhoudsdieet en water ad libinum. 3 weken na de transplantatie werden de dieren gedood door een overdosis van 3% isofluraan om de mate van wondherstel macroscopisch en histologisch te onderzoeken.

macroscopische scoring van kraakbeenwondgenezing

na blootstelling van het kniegewricht bij opgeofferd dieren werd het defect macroscopisch gescoord door twee chirurgen die blind waren voor de behandelingsarm met behulp van een vastgesteld systeem voor de beoordeling van kraakbeenwondgenezing in kleinere diermodellen.49 De mate van weefselherstel werd gescoord van 0 punten (beste resultaat) tot 4 punten (slechtste resultaat) elk voor: (1) de kleur van het reparatieweefsel; (2) de omvang van de bloedvaten die in het reparatieweefsel worden gezien; (3) de gladheid van het oppervlak van het herstelweefsel; (4) de mate waarin het wonddefect werd gevuld met herstelweefsel; (5) de mate van degeneratie van het aangrenzende gewrichtskraakbeen. De gescoorde punten voor elk criterium werden toegevoegd en de mate van beste reparatie werd weergegeven met de laagste score van een totale score van 20.

histologische scoring van kraakbeenwondgenezing

na chirurgische excisie werden dierlijke knieën gedurende 48 uur gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline (Sigma) en gedurende 24-48 uur in K-CX-ontkalkingsoplossing (FALMA, Tokio, Japan) bij 4 °C. Hierna werden de rattenknieën ‘ s nachts gewassen in stromend leidingwater, verwerkt en ingebed in paraffinewasblokken, klaar om te worden opgedeeld. Weefselsecties werden gesneden met een dikte van 5 micron in een standaard roterend microtoom en deze werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) en toluïdine blauw voorafgaand aan montage in DPX en histologisch onderzoek. De omvang en kwaliteit van kraakbeenreparatie werd histologisch en onafhankelijk beoordeeld door twee examinatoren met behulp van het wakitani scoresysteem36, aangepast om twee extra parameters op te nemen, d.w.z. om de aanwezigheid van bloedvaten en lichaamsvreemde reuzencellen (fbgc ‘ s) te onderzoeken. Het scoresysteem bestond dus uit zeven verschillende parameters: (1) celmorfologie; (2) matrixkleuring; (3) Oppervlakte-regelmaat; (4) dikte van het kraakbeen; (5) integratie van het herstelweefsel met het kraakbeen van de gastheer; (6) de mate van vascularisatie binnen het defect; (7) de mate van fbgc-reactie. Voor elk van deze parameters vertegenwoordigde de laagste score (0) de ‘beste’ reparatie en een hoogste score (4) de ‘slechtste’ reparatie. De totale scores werden toegevoegd en vervolgens vergeleken tussen groepen uit een totale score van 21.

immunohistochemie voor humaan mitochondriaal antigeen

weefselsecties werden gekleurd met een anti-humaan mitochondriaal antigeen (HMA) antilichaam (kloon 113-1: Abcam, Cambridge, UK) om de aanwezigheid van humaan MSCs te beoordelen. Na het ophalen van het antigeen werden de secties ondergedompeld in drie veranderingen van PBS en gedurende 20 minuten Geblokkeerd met 2,5% horse serum (Vector Labs Ltd) bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. De secties werden vervolgens geïncubeerd met de muis anti – HMA antilichaam (1:400 verdunning in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Hierna werd elk ongebonden antilichaam bij drie veranderingen van PBS voorzichtig weggespoeld en werden de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met gebiotinyleerde anti-muis IgG. De secties werden driemaal gewassen in PBS en de endogene peroxidisatieactiviteit werd geblokkeerd met 0,3% waterstofperoxide in methanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatiestap werd de Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK) voorbereid en mocht hij 30 minuten voor gebruik staan volgens de instructies van de fabrikant. Nadat de endogene peroxidisatieactiviteit was geblokkeerd, werden de secties in drie maal PBS gewassen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met het ABC-reagens. Na dit, werd een DAB chromogeen (Vector labs) toegevoegd gedurende 6-8 minuten, afhankelijk van de intensiteit van de gewenste kleur. Secties werden vervolgens gewassen en gedehydrateerd door middel van series ethanol (70-100%), geklaard met xyleen en gemonteerd in Pertex. Chondrogene pellet van menselijke MSCs werd gebruikt als positieve controle. Negatieve controle omvatte chondrogene pellet waarbij het primaire antilichaam werd weggelaten.

Scanning elektronenmicroscopie

de hechting van MSC ‘ s die vóór de implantatie in de Alpha Chondro Shield scaffold waren gezaaid, werd als volgt onderzocht met scanning elektronenmicroscopie (SEM): nadat de met cellen gezaaide scaffolds gedurende 30 minuten waren geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C en 5% CO2, werden ze gewassen in PBS en vervolgens gedurende 2 uur gefixeerd in 2% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) en vervolgens gewassen in 0.1 M fosfaatbuffer voorafgaand aan de behandeling met 1% osmiumtetraoxide gedurende 1 uur. De monsters werden vervolgens gedehydrateerd door middel van een gesorteerde reeks ethanoloplossing, gedurende 30 minuten behandeld met overgangsvloeistof, t-butylalcohol, gevriesdroogd, bedekt met goudpalladium en uiteindelijk afgebeeld met behulp van een JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japan) of Zeiss EVO10 scanning elektronenmicroscoop (Carl Zeiss, Cambridge, UK).

levende / dode kleuring om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen in door cellen gezaaide steigers

MSC-gezaaide steigers werden bevlekt met levende/dode kleuringsoplossing volgens het Protocol van de fabrikant, zoals eerder beschreven 8. In het kort werden de met cellen ingezaaide steigers 30 minuten in het donker bij 37 °C ondergedompeld in de levende/dode kleuringoplossing.vervolgens werden de steigers uit de kleuringoplossing verwijderd, gewassen in PBS en onmiddellijk afgebeeld met behulp van een confocale microscoop (Leica Microsystems DM6000B-SP57CS).

in vitro angiogenesetests

de humane EA.de endothelial cellijn van hy926 werd gebruikt als model om om het even welke angiogenic activiteit van cultuur geconditioneerd medium van PA MSC en CD271+ MSC CM te onderzoeken. EA.hy926 endotheliale celproliferatie / migratie en endotheliale tubulusvorming werden als volgt onderzocht: (i) EA.hy926 cellen werden gekweekt in standaard kweekmedium (DMEM/ F-12 aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine) in 24 well platen gedurende 2 dagen tot 100% samenvloeiende monolagen gevormd. Een steriele pipetpunt werd gebruikt om een kras te maken in de monolaag. Vervolgens werden de putten gewassen met steriele PBS en vervolgens werd 1 ml geconditioneerde media van PA MSc-culturen of CD271+ MSc-culturen toegevoegd aan elk van drievoudige putten per geteste voorwaarde. Serumvrij DMEM-cultuurmedium werd gebruikt als controlemiddel. De plaat werd geïncubeerd in het cel IQ platform voor levende cel gedigitaliseerde weergave over een periode van 2 dagen, waarna de sluiting van de kraswonde, levensvatbare celaantallen en de omvang van migratie van individuele cellen werden gekwantificeerd gebruikend de software van de beeldanalyse van cel IQ. De proliferatieve respons van EA.hy926 endotheliale cellen aan pa MSC en CD271+ MSc geconditioneerde media (versus serumvrij controlemedium) werden ook onderzocht met behulp van de MTT-assay; (ii) EA.de vorming van de endotheliale tubulus van hy926 werd getest met groeifactor-gereduceerd Matrigel (Bioscience van BD), dat werd aliquoteerd in 96-wells-platen (50 µl Matrigel/well) en vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C. EA werd geïncubeerd.hy926 endothelial cellen werden gezaaid op de Matrigel bij 2 × 104 cellen / put in 200 µl pa MSC en CD271+ MSC geconditioneerde media of serum-vrije controle cultuurmedium. De platen werden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 dag, waarna ze werden afgebeeld met behulp van Cell IQ imaging platform (3 beelden per put). De totale lengte/beeld van de endotheliale tubulus en het totale aantal vertakkingspunten/beeld van de endotheliale tubulus werden gemeten met behulp van de Cell IQ image analyser-software.

statistische analyse

statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism6-software (GraphPad Software, Inc. CA, USA). Voor in-vivo-experimenten werden ten minste n = 3 dieren per aandoening getest. Voor in vitro experimenten werden n = 3-4 onafhankelijke experimenten uitgevoerd voor alle analyses, waarbij gegevens werden geanalyseerd met eenrichtingsanova wanneer er één variabele factor was, en tweeweganova wanneer er twee variabele factoren waren. Voor macroscopische en histologische scores van kraakbeenherstel werden de verschillen tussen de groepen onderzocht met behulp van de meervoudige vergelijkingstesten van Dunn. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd. Alle gegevens zijn gepresenteerd als gemiddelden ± SEMs of gemiddelden ± SDs (zoals aangegeven in de figuur legends).