Seriell passaging av lungemetastaser in vivo beriker for metastatisk potensial
PDX-linjen WU-BC3 ble generert ved å engrafte brysttumorceller fra en pasient med metastatisk TNBC inn i humaniserte brystfettputer (Mfp) av nod/scid mus mus.26,27 vi konstruerte disse tumorcellene for å stabilt uttrykke Klikkbille Rød Luciferase (CBR-Luc), mCherry og en shRNA spesifikk for p53 (shA2) for å lage PDX-linjen BC3_A2 (tidligere kjent SOM BC3-p53KD28) (Supplerende Fig. 1a). Vi viste at tumorceller metastaserte fra Multifunksjonsmaskiner til fysiologisk relevante steder, inkludert lunge, lever, bein, hjerne og lymfeknuter.28 lungemetastaser (P0) ble isolert fra replikatmus, samlet og engrafted i Mfpene til mottakermus. De resulterende lungemetastaser (P1) ble isolert, samlet og innpodet i Mfpene av ekstra mus. Lungemetastaser fra disse musene (P2)ble også samlet og samlet (Supplerende Fig. 1b). Vi utførte bioluminescens imaging (BLI)av lunger, bein og lever på necropsy å kvantifisere den relative størrelsen av metastase ved hver passasje (Supplerende Fig. 1c). Seriell passaging beriket for tumorceller med økt kapasitet til å metastasere til alle steder (Supplerende Fig. 1d-f, h) og nødvendige mus for å bli avlivet tidligere (Supplerende Fig. 1i). I motsetning til dette resulterte ikke serielle passerende svulster mellom Mfp-Er i økt lungemetastase (Supplerende Fig. 1g), noe som indikerer at oppkjøpet av forbedret metastatisk kapasitet ikke bare var en konsekvens av serielt passerende svulster in vivo. Videre viste ikke tumorceller med forbedret metastatisk kapasitet en signifikant økning i vekstegenskaper når de ble isolert fra Mfp-Er og plassert tilbake i Mfp-ene til mottakermus (Supplerende Fig. 1j). Samlet sett viser disse resultatene at seriell passaging av tumorceller fra lungene til Mfp i denne modellen beriker for metastatisk potensial, men ikke organspesifikk homing.
Mesenkymalt genuttrykk reduseres i lungemetastaser i forhold til MFP-svulster
for å identifisere endringer i genuttrykksmønstre som følger med metastase, utførte VI RNA-sekvensering (RNAseq) på lungemetastaser (P0 Og P2) og mfp (P0 Og P2) svulster (Fig. 1a Og Utfyllende Tabell 1). Etter å ha trukket RNAseq leser kartlegging til mus transkriptome, bare menneskelige transkripsjon leser ble brukt for nedstrøms analyser. Hovedkomponentanalyse (pca) viste redusert uenighet blant biologiske replikater med gjentatt passaging in vivo, da biologiske replikater Av P2 tumorprøver gruppert nærmere med hverandre enn med andre subpopulasjoner analysert (Fig . 1b). Genset Berikelsesanalyse (GSEA) viste AT EMT var den mest signifikant nedregulerte banen i Både P0 og P2 lungemetastaser i forhold TIL mfp-svulster (Fig. 1c). TGF-β signalering, som regulerer EMT, ble også signifikant nedregulert i Både p0 og P2 lungemetastaser (Fig. 1c).
PDX lungemetastaser signaturer identifiserer gener de-regulert i metastaser. En Skjematisk fremstilling av mpf-tumorer og lungemetastaser isolert for RNAseq. B hovedkomponentanalyser (PCAs) fra rnaseq-data generert fra mfp-svulster og lungemetastaser brukt i denne studien. Hvert datapunkt representerer en prøve fra en enkelt mus. c GSEA pathway analyse på beriket lungemetastase signatur (P2); de øverste 5 ned (blå)- og opp (rød)regulerte prosessene vises. Nes, normalisert berikelse score. Bokser angir FDR < 0,1 for statistisk signifikans. Anrikningsplott for epitel mesenkymal overgang (EMT) og TGF-β signalering For P0 Og P2 er vist i høyre panel. p< 0.001 FOR EMT og TGF-β signalering Ved P0 Og P2. d qRT-PCR-analyse av vimentinuttrykk I BC3_A2 mfp-svulster og metastaserende subpopulasjoner isolert fra lunge. Sammenkoblede t-tester, p = 0,02 For p0 lunge, p < 0,001 For p2 lunge. Hvert datapunkt representerer en mus. Feilfelt representerer SEM av biologiske replikater. Se Også Utfyllende Fig. 2. E IHC-farging ble utført på de angitte vevsseksjonene ved bruk av et antistoff som gjenkjenner den humane spesifikke formen av vimentin. Skalastenger indikerer 100@m. f Foss tomt som viser uttrykk FOR EMT gener I P0 Og P2 lungemetastaser sammenlignet med tilsvarende mfp svulster. p-verdier er gitt I Supplerende Tabell 1. Prøver fra minst tre uavhengige mus ble inkludert for rnaseq-analyser
Kvantitativ sanntid (qRT-PCR) ble utført for å overvåke ekspresjon av vimentin, en mesenkymal markør, I mfp-svulster og lungemetastaser gjennom seriell passaging. Vimentin-uttrykk viste et dynamisk mønster med høyere uttrykk i MFP-svulster i forhold til tilsvarende lungemetastaser ved hver passasje (Fig. 1d) og til levermetastaser Ved P0 (Supplerende Fig. 2a). Vimentin proteinnivåer rekapitulerte dette dynamiske mønsteret (Fig. 1e). Ytterligere EMT-gener ble også nedregulert i lungemetastaser i forhold til tilsvarende mfp-svulster (Fig. 1f). Ekspresjon av mesenkymalmarkøren CDH2 (genet som koder For n-cadherin) fulgte samme mønster som vimentin(Supplerende Fig. 2b), mens ekspresjon av epitel markør CDH1 (genet koding E-cadherin) utstilt en invers trend (Supplerende Fig. 2c). Co-engrafted humane stromale fibroblaster ble ryddet ved tidspunktet for tumorhøsting (Supplerende Fig. 3a-f–, utelukker muligheten for at de bidro til uttrykket av mesenkymale markører i mfp-svulster. Samlet sett viser disse resultatene at svulster nedregulerer ekspresjon av mesenkymale gener når de er etablert i metastatiske steder.
Bestemmelse av bibliotekets kompleksitet for høy gjennomstrømmingsgevinst av funksjonsskjerm
EN HØY gjennomstrømmingsgevinst (GOF) skjerm ble designet for å identifisere funksjonelle drivere av metastase fra Vår p2 lungemetastaser signatur. HOXA1,en kjent driver av metastase, 29 tjente som en positiv kontroll for skjermoptimalisering, OG GFP ble brukt som en negativ kontroll. BC3_A2-celler ble transdusert med lentivirus som koder FOR ENTEN HOXA1 eller GFP, og infiserte tumorceller ble blandet i forskjellige forhold (Supplerende Fig. 4a). Blandede populasjoner av tumorceller ble deretter innpodet I Mfpene til mottakermus, og BLI ble brukt til å score lungemetastaser på tidspunktet for nekropsy (Supplerende Fig. 4b). I et annet sett med eksperimenter ble metastatisk driver ID19 brukt i kombinasjon med GFP, men i dette tilfellet ble blandede populasjoner av tumorceller injisert i halevenen til mottakermus for å modellere sluttstadiene av metastase (Supplerende Fig. 4c). En signifikant økning i fotonflux ble observert fra svulster MED ET HOXA1: GFP eller ID1: GFP-forhold på 1: 10. Disse kompleksitetstestene viste at en bona fide metastasedriver kunne oppdages i skjermen hvis den ble samlet med 9 ikke-driver åpne leserammer (ORFs), men et basseng med en sjåfør med 19 ikke-drivere maskerte vår evne til å oppdage sjåføren. Basert på disse resultatene begrenset vi bassengstørrelsen til 12 ORFs.
high throughput gain-of-function screening in vivo identifiserer kandidatfunksjonelle drivere av tnbc metastase
For å bestemme hvilke av de oppregulerte gener fra P2 lungemetastase signaturen som var i stand til å drive lungemetastase, designet vi tilpassede strekkodede lentivirale biblioteker som koder For ORFs av de 230 gener som var mest oppregulert i lungemetastaser. ORFs ble individuelt uttrykt I BC3_A2-celler slik at hver cellelinje uttrykte en ENKELT ORF, celler ble deretter samlet i grupper på 12, Og bassenger ble implantert i Mfp-ene til mottakermus (n = 10 mus per basseng, Fig. 2a). En kontrollplasmiduttrykkende GFP ble inkludert i hver pool for å måle indre metastase i DENNE tnbc-modellen. HVER ORF var assosiert med en unik DNA strekkode. En referanse pellet av sammenslåtte celler ble snap frosset for å bekrefte lik representasjon av HVER ORF på tidspunktet for tumorimplantasjon. Tretten uker ble valgt som studieendepunkt fordi HOXA1, MEN ikke gfp-uttrykkende svulster, metastasert til lunge på dette tidspunktet (Supplerende Fig. 5a). Tretten uker etter engraftment, lungene ble utsatt FOR bli ex vivo (Supplerende Fig. 5a), metastatiske lesjoner ble isolert, og genomisk DNA (gDNA) ble ekstrahert og brukt som mal for qPCR for å forsterke unike strekkoderegioner assosiert med hver ORF (Supplerende Fig. 5b). MFP svulster ble også isolert og utsatt for disse analysene (Fig. 2a). Representasjonen av hver strekkodet ORF I MFP i forhold til referanseprøven ble bestemt for hvert basseng (Fig. 2b; Supplerende Fiken. 5c, d). Representasjon i lungen ble deretter normalisert til anrikning i Mfp vs referansen (Fig. 2b, c). Metastase drivere segregert i tre grupper, inkludert de som er beriket i både lunger og Mfp (Fig. 2b, øvre høyre kvadrant Og Supplerende Fig. 5c), de som er beriket utelukkende I Mfp-Er (Fig. 2b, nedre høyre kvadrant) og de som er beriket utelukkende i lungene (Fig. 2b, øvre venstre kvadrant Og Fig. 2c). Celler som uttrykker GFP ble beriket i lungemetastaser i noen av bassengene, og gjennomsnittlig berikingspoeng for GFP i lungen var omtrent 5 (Supplerende Fig. 5e). Derfor brukte vi dette som en berikelse score cutoff for å definere en sann hit i skjermen vår og identifiserte 44 gener som ble selektivt beriket i lungemetastaser i forhold til primære svulster. Disse treffene ble rangert etter berikelse score (Fig. 2c Og Supplerende Tabell 2). BLANT de fem beste treffene VAR CEACAM5 den eneste hvis uttrykk i primære svulster ble funnet å forutsi dårlig overlevelse hos brystkreftpasienter (Supplerende Fig. 6a). Derfor undersøkte vi videre den funksjonelle rollen TIL CEACAM5 i brystkreft metastase.
høy gjennomstrømning gain-of-funksjon screening in vivo identifiserer funksjonelle drivere av metastase. En Skjematisk viser format som brukes for gain-of-function (GOF) skjerm. Se Også Utfyllende Fig. 5. ORF, åpne leseramme. Ti mus ble implantert i hver kohort. B Spredningsplott som viser relativ representasjon av HVER ORF i mfp-svulster etter normalisering til referansen (x-aksen) og i lungene i forhold til MFP-svulster (y-aksen). ΔΔ-METODEN ble brukt til kvantifisering av qpcr-data. CEACAM5 er vist i rødt. c-Gener beriket i lungemetastaser, men ikke MFP-svulster, ble rangert i synkende rekkefølge av anrikning i lunge. Stiplet linje indikerer berikelse score cutoff. Se Også Utfyllende Fig. 5 Og Supplerende Tabell 2
Bekreftelse av forbedret CEACAM5-uttrykk i flere metastaserende PDX-modeller
vi fant AT CEACAM5-uttrykk ble dynamisk regulert da metastaserende subpopulasjoner ble serielt passert mellom lungene og Mfp-Ene in vivo (Fig. 3a), som bekrefter funn fra RNAseq (Supplerende Tabell 1 Og Supplerende Fig. 6b). PÅ samme måte VAR CEACAM5-uttrykket høyere i leveren(Supplerende Fig. 7a) og hjernen (Supplerende Fig. 7b) metastaser i forhold til tilsvarende mfp-svulster. Ceacam5 proteinnivåer var også høyere i lungemetastaser i forhold TIL mfp-svulster (Fig. 3b). Økningen I CEACAM5-ekspresjon i metastatiske lesjoner var ikke avhengig av p53-demping i DENNE PDX-linjen, da lungemetastaser fra den isogene PDX-linjen som uttrykte villtype p5326, 30 også viste høyere ekspresjonsnivåer AV CEACAM5(Supplerende Fig. 7c).
CEACAM5 er oppregulert i metastaser, og uttrykket er omvendt korrelert med vimentin i PDX-modeller AV TNBC. Et Uttrykk FOR CEACAM5 I mfp-svulster og metastaserende lesjoner av mus engrafted MED BC3_A2-svulster ble bestemt av qRT-PCR. Sammenkoblede t-tester, p < 0,001 for P0 lunge, p2 MFP tumor Og p2 lunge. Hver prikk representerer en individuell mus. Feilfelt representerer SEM av biologiske replikater. Se Også Utfyllende Fig. 7. b mfp-tumorer og tilsvarende metastaser fra mus engrafted MED BC3_A2-tumorer ble analysert VED IHC ved BRUK AV ET CEACAM5-antistoff. Skalastenger indikerer 100@m. C-Ekspresjon AV CEACAM5 i mfp-svulster og metastaserende lesjoner av mus innpodet MED PIM001-P-svulster ble bestemt av qRT-PCR. Data presenteres på en loggskala. Paret t-test, p< 0,001. Hver prikk representerer en individuell mus. Feilfelt representerer SEM av biologiske replikater. d MFP-tumorer og tilsvarende lungemetastaser fra mus innpodet MED PIM001-P-tumorer ble analysert VED IHC ved BRUK AV ET CEACAM5-antistoff. Skalastenger indikerer 100@m. E, F IHC av serielle tumorvevsseksjoner fra mus engrafted MED BC3_A2 (e) eller PIM001-P (f) farget med antistoffer spesifikke FOR CEACAM5 (topp panel) eller vimentin. Skalastenger indikerer 100@m. g-Uttrykk FOR CEACAM5 (topppanel) eller vimentin (bunnpanel) ble bestemt i et panel av brystkreftcellelinjer. Feilfelt representerer SEM av tekniske triplicates. h IHC ble utført for å overvåke fosforylert p38 i mfp-svulster og lungemetastaser HOS BC3_A2-mus. Målestenger indikerer 100 µ
ET annet sett MED PDX-modeller AV TNBC (PIM001) ble evaluert for å avgjøre om økningen I CEACAM5 i metastaserende lesjoner var en generell egenskap ved metastase. PIM001-P ble etablert fra den primære behandlingstumoren-naï hos en pasient med metastatisk TNBC, MENS PIM001-M ble etablert fra dermal metastase fra samme pasient. PIM001 – p tumorceller ble konstruert for å uttrykke BÅDE CBR-Luc og mCherry og deretter innpodet I Mfpene til mottakermus. PÅ tidspunktet for nekropsy ble MFP-svulster og lungemetastaser isolert. CEACAM5-uttrykket ble økt på begge mRNA-nivåene (Fig. 3c) og protein-nivåer (Fig. 3D) I PIM001-P lungemetastaser sammenlignet med tilsvarende mfp-svulster. Interessant NOK var CEACAM5-proteinnivåene høyere i PDX MFP-svulster etablert fra pasientens dermale metastase (PIM001-M) sammenlignet med PDX MFP-svulstene etablert fra hennes primære brysttumor (PIM001-P) (Supplerende Fig. 7d). Samlet viser disse resultatene at forhøyelse AV CEACAM5 er en felles egenskap for metastaser i PDX-modeller AV TNBC.
CEACAM5-uttrykk er omvendt korrelert med vimentin-uttrykk og fosforylering av p38
fordi uttrykk FOR CEACAM5 i PDX-modeller var omvendt korrelert med uttrykk for vimentin (Figs. 1d, 3a; Supplerende Fiken. 2a og 7a, b), immunhistokjemi (IHC) ble brukt til å overvåke lungemetastaser og mfp-svulster for relative nivåer av vimentin og CEACAM5. Proteinnivåer korrelert med mRNA-nivåer i BEGGE PDX-modellene (Fig. 3e, f). Vimentin-uttrykk var også omvendt korrelert MED CEACAM5-uttrykk i et panel av brystkreftcellelinjer(Fig. 3g). Serin / treonin-spesifikk proteinkinase p38alfa (OGSÅ KJENT SOM MAPK14, heretter referert til som p38) fosforyleres under EMT.31 Interessant, fosforylert (aktiv) p38 korrelert med høye ekspresjonsnivåer av vimentin i mfp-svulster, og p38 fosforylering redusert i lungemetastase hvor vimentin-nivåene var lave(Fig . 3h). Samlet viser disse dataene AT CEACAM5-uttrykk er omvendt korrelert med uttrykk FOR EMT-markører i lungemetastaser.
Ektopisk overproduksjon AV CEACAM5 hemmer tgf-β signalering og uttrykk for EMT markører
Gitt AT CEACAM5-uttrykk omvendt korrelert med mesenkymal status, evaluerte vi om CEACAM5 hadde en direkte rolle i å regulere uttrykk for mesenkymale markører. BC3_A2 celler konstruert for å overprodusere human CEACAM5 eller GFP som en negativ kontroll (Supplerende Fig. 8a, b) ble undersøkt for ekspresjon av vimentin OG CDH2 / N-cadherin (mesenkymale markører) OG CDH1/ e-cadherin (epitelmarkør). Overuttrykk AV CEACAM5 førte til økt uttrykk FOR CDH1 (Supplerende Fig. 8c) og redusert ekspresjon AV CDH2 (Supplerende Fig. 8d) og vimentin (Supplerende Fig. 8e). I tillegg reduserte overproduksjon AV CEACAM5 og forsinket tgf-β mediert fosforylering Av Smads I BC3_A2-celler (Fig. 4a, c, Supplerende Fig. 9a) og p38 fosforylering i BEGGE BC3_A2-celler (Fig. 4a, b, Supplerende Fig. 9a) og mda-MB-231 celler (Supplerende Fig. 8f, Utfyllende Fig. 9b). Endelig forsinket overproduksjon AV CEACAM5 TGF-β-indusert EMT som vurdert Ved E-cadherin og vimentin-uttrykk (Fig . 4d, Supplerende Fig. 9c). Disse resultatene tyder på AT CEACAM5 negativt regulerer EMT og identifiserer en funksjon FOR CEACAM5 i brystkreft metastase.
CEACAM5 overproduksjon nedregulerer uttrykk for mesenkymale markører og svekker tgf-β signalering og svekker TGF-β signalering. A BC3_A2-celler konstruert for å overprodusere CEACAM5 eller GFP ble dyrket i nærvær eller fravær av 1 ng / ml TGF – β for de angitte tidsperiodene. Cellulære lysater ble utsatt For Vestlig blotting for de indikerte proteinene. B, C Histogram viser foldeendringen (log scale) i fosforyleringsstatus for p38 (b) eller Smad2/3 (c) sammenlignet med det ved tidspunkt 0 for celler som uttrykker GFP. Feilfelt representerer SEM av minst tre uavhengige eksperimenter. D BC3_A2-celler som uttrykte GFP eller CEACAM5 ble dyrket i nærvær eller fravær av 1 ng / ml TGF – β for de angitte tidsperiodene. Cellulære lysater ble utsatt For Vestlig blotting for de indikerte proteinene. Alle resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Se Også Supplerende Fiken. 8 og 9
Overproduksjon AV CEACAM5 fremmer metastatisk utvekst og reduserer EMT in vivo
EMT er assosiert med redusert celleproliferasjon.19 SÅLEDES antydet ceacam5s evne til å hemme EMT at det kan fungere for å fremme tumorutvekst på metastatiske steder. FOR å teste denne hypotesen ble BC3_A2-celler konstruert for å overprodusere CEACAM5 eller gfp (kontroll) injisert i haleårene til mottakermus for å overvåke effekten AV CEACAM5 overproduksjon på tumorvekst i lungen. Overuttrykk AV CEACAM5 førte til økt tumorvekst i lungene (Fig. 5a Og Utfyllende Fig. 10a), redusert ekspresjon av vimentin på proteinnivået (Supplerende Fig. 10b), og redusert fosforylering av p38 (Fig. 5d, e). Redusere ceacam5 nivåer I BC3_A2 med to forskjellige shRNAs (Fig. 5b) hadde motsatt effekt ved at transduserte celler vokste langsommere i lungene enn kontrollceller etter injeksjon av halevene (Fig . 5c Og Supplerende Fig. 10c). I TILLEGG resulterte ceacam5 knockdown i økt lesjonstall, men redusert lesjonsstørrelse (Supplerende Fig. 10d, e). Disse resultatene tyder PÅ AT CEACAM5 silencing fremmer emt og tumorcelle ekstravasasjon samtidig som det hemmer metastatisk utvekst.
Uttrykk FOR CEACAM5 fremmer vekst av lungemetastaser. EN BC3_A2 celler overproducing CEACAM5 ELLER GFP ble injisert i halen årer av mus. BLI ble brukt til å kvantifisere fotonflux i lungene av mus ved de angitte tidspunktene. Paret t-test, p = 0,03. Feilfelt representerer SEM av biologiske replikater (n = 5 mus per gruppe). b BC3_A2-celler som uttrykker kontroll shRNA (shLuc) eller to forskjellige shrna (#3 og #5) spesifikke FOR CEACAM5 ble utsatt for qRT-PCR for å overvåke CEACAM5-uttrykk. Feilfelt representerer SEM av tekniske triplicates. Se Også Utfyllende Fig. 10. c BC3_A2-celler som uttrykker shLuc eller to forskjellige CEACAM5 shRNAs ble injisert i haleårene til mus. BLI ble brukt til å kvantifisere fotonflux i lungene av mus ved de angitte tidspunktene. Sammenkoblede t-tester, p = 0,01 for sh # 3 og p < 0,001 for sh # 5. Data ble normalisert til det opprinnelige tidspunktet og presenteres på en loggskala. Feilfelt representerer SEM av biologiske replikater (n = 5 mus per gruppe). d BC3_A2-celler som overproduserte CEACAM5 ble injisert i haleårene til mus, og lungene ble isolert og utsatt FOR IHC med de indikerte antistoffene. Skalastenger indikerer 100@m. E-Celler som farget positivt FOR CEACAM5, vimentin eller p-p38 i vevsseksjonene representert i panel d ble kvantitert ved Bruk Av vectra 3.0 automated imaging system. Sammenkoblede t-tester, p = 0,0008 FOR CEACAM5, p = 0,03 for vimentin og p = 0,03 for p-p38. Feilfelt representerer SEM av minst tre uavhengige biologiske replikater. f RNA isolert FRA BC3_A2-celler som overproduserte CEACAM5 eller GFP og dyrket enten in vitro eller isolert fra lungen etter injeksjon av halevene (in vivo, a, d) ble utsatt FOR gsea-baneanalyse (venstre to kolonner). De øverste 5 nedregulerte (blå) og topp 5 oppregulerte (røde) prosessene vises. Bokser angir FDR < 0,1 for statistisk signifikans. Nes (normalisert berikelse score). Betydningen av disse banene I p0 og P2 mfp svulster vs. tilsvarende lungemetastaser er vist for sammenligning (høyre to kolonner). Data er representert av biologiske triplikater. Se Også Utfyllende Fig. 11
FOR å overvåke hvordan overproduksjon AV CEACAM5 påvirket genuttrykk, BLE BC3_A2-celler konstruert for å overprodusere CEACAM5 ELLER GFP dyrket in vitro eller isolert fra lungen etter injeksjon av halevene (in vivo). RNA ble isolert og utsatt For RNAseq. Differensiell genekspresjonsanalyse ble utført, OG GSEA identifiserte EMT som den eneste kreft hallmark pathway som var signifikant nedregulert både in vitro og in vivo VED CEACAM5 overproduksjon (Fig. 5f, Utfyllende Fig. 11). Dette resultatet ligner det som er observert I p0 og p2 lungemetastaser (Fig. 1c, 5f). Samlet indikerte disse dataene at oppregulering AV CEACAM5-ekspresjon i metastatiske lesjoner induserer MET og forbedrer utveksten av metastatiske tumorceller på sekundære steder.
CEACAM5-uttrykk er oppregulert i metastatiske lesjoner fra brystkreftpasienter
DERETTER ble CEACAM5-uttrykk vurdert i metastatiske lesjoner og brysttumorvev fra pasienter med brystkreft. IHC-farging på et matchet vevssett bestående av en primærtumor og en lungemetastase fra en pasient med brystkreft (Supplerende Tabell 3) viste høyere CEACAM5-nivåer i lungemetastasen i forhold til den primære brysttumoren (Fig . 6a Og Utfyllende Fig. 12a). For å utvide disse analysene, en vevsmikroarray (TMA) bestående av lungemetastaser fra 25 brystkreftpasienter (Supplerende Fig. 12b, c og Supplerende Tabell 3) ble farget FOR CEACAM5 (Supplerende Fig. 12b), og farging intensitet ble tildelt en score (Fig. 6b). Denne scoringsmetoden ble også brukt på EN TMA fra Det Humane Proteinatlaset bestående av humane brysttumorer farget FOR CEACAM5. 32 flertallet av lungemetastaser uttrykte høye nivåer AV CEACAM5 (Fig. 6c) sammenlignet med brysttumorer (Fig. 6d), som viser AT CEACAM5 var høyere i metastaserende lesjoner sammenlignet med primære brysttumorer.
CEACAM5 proteinnivåer er forhøyet i metastatiske lesjoner hos brystkreftpasienter og er omvendt korrelert med uttrykk for vimentin. a primærtumoren og tilsvarende lungemetastase fra en pasient med brystkreft ble utsatt FOR IHC for å overvåke CEACAM5-nivåer. Skalastenger indikerer 100@m. b en tumorvevsmikroarray (TMA) bestående av lungemetastaser fra 25 brystkreftpasienter ble utsatt FOR IHC med ET CEACAM5-spesifikt antistoff, og fargeintensitet ble skårt. Representative bilder vises. Skalastenger indikerer 100@m. c scoringssystemet i b ble brukt på TMA bestående av lungemetastaser fra 25 brystkreftpasienter for å vurdere relative CEACAM5-nivåer. d scoringssystemet i b ble påført en TMA fra Humant Proteinatlas bestående av 25 primære brysttumorer for å vurdere relative CEACAM5-nivåer. e primærtumoren og tilsvarende lungemetastase fra en pasient med brystkreft (fra a) ble fargelagt for CEACAM5 og vimentin og analysert ved immunfluorescensmikroskopi. Skalastenger indikerer 100@m. f-Celler som farget positivt FOR CEACAM5, vimentin eller begge i vevsseksjonene representert i e ble kvantitert ved Bruk Av vectra 3.0 automated imaging system. g TMA bestående av lungemetastaser fra 25 brystkreftpasienter ble co-farget FOR CEACAM5 og vimentin og analysert ved immunfluorescensmikroskopi. Representative bilder vises. Skalastenger indikerer 100@m. h-Celler som farget positivt FOR CEACAM5, vimentin eller begge i vevsseksjonene vist i g ble kvantitert ved bruk Av vectra 3.0 automated imaging system. Se Også Utfyllende Fig. 12
Vi vurderte deretter det samsvarende vevssettet for samuttrykk AV CEACAM5 og vimentin. Co-farging FOR CEACAM5 og vimentin viste høyere NIVÅER AV CEACAM5 i lungemetastasen i forhold til matchet brysttumor, og det omvendte fargemønsteret ble observert for vimentin (Fig . 6e, f). I tillegg viste en mindre populasjon av tumorceller co-farging for BÅDE CEACAM5 og vimentin (Fig. 6f). Disse cellene som farger positivt for begge proteiner, kan representere celler i en hybrid EMT/MET-tilstand.33 TMA bestående av lungemetastaser fra 25 brystkreftpasienter viste også en invers korrelasjon MELLOM CEACAM5 og vimentin-farging (Fig. 6g, h; Supplerende Fiken. 12a-e). Disse resultatene bekreftet konklusjonene med VÅRE PDX-modeller AV TNBC og viste at CEACAM5-uttrykk er omvendt korrelert med vimentin-uttrykk i primære brysttumorer og metastaserende lesjoner. Samlet sett tyder disse resultatene på AT CEACAM5 fremmer MET for å lette tumorutvekst på metastatiske steder(Supplerende Figur 12a, b).
