TEKST

Behandling av meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) har blitt komplisert ved å øke forekomsten av antibiotikaresistens. MRSA-stammer uttrykker penicillinbindende protein 2a (PBP2a), kodet av mecA, som gir resistens mot β-laktamer ved å beskytte det reaktive serinet i en smal, utilgjengelig spalt, slik at celleveggsyntese kan fortsette i nærvær av antibiotika (1, 2). Ceftobiprol og ceftarolin er anti-MRSA cefalosporiner som hemmer PBP2a ved terapeutisk nyttige konsentrasjoner. R2-gruppen av ceftobiprol strekker seg inn i den smale spalten Av PBP2a for å få tilgang til det aktive stedet, mens ceftarolinbinding forårsaker en allosterisk endring I PBP2a, og avslører det aktive stedet for binding med et andre molekyl (3, 4). Ceftobiprol er evaluert i kliniske studier, og ceftarolin er FDA godkjent FOR behandling av hud-og hudstrukturinfeksjoner, inkludert DE som er forårsaket AV MRSA (5-10).

Tidligere studier fra vår gruppe har vist at passasje AV KOLSTAMMEN i ceftobiprol velger resistente mutanter med mutasjoner I PBP2a (11). Denne studien undersøker om ceftarolinpassasjen også velger for lignende mutasjoner. Passage eksperimenter ble utført med to FORSKJELLIGE MRSA bakgrunn: COL, en arkaisk homogent resistente isolere fra 1961, OG SF8300, en heterogent resistente moderne USA300 MRSA stamme. COLnex Og SF8300ex, meca-negative derivatstammer Av COLn OG SF8300, ble oppnådd ved (12) eksisjon av kromosomal stafylokokk kassettkromosom mec (SCCmec) (13). Villtype mecA ble gjeninnført på plasmid pYK20 (avledet fra plasmid pAW8 og inneholdende villtype mecA klonet fra COL ) til COLnex og SF8300ex for passasjestudier. Hvis mecA medierte resistens, bør enten herding av en resistent mutant av plasmidet eller innføring i en mottakelig bakgrunn resultere i henholdsvis tap eller gevinst av fenotype, noe som gjør det mulig å bestemme mecas bidrag til resistens. Stammer og plasmider som brukes i denne studien er oppført I Tabell 1 og 2. COLnex (pYK20) og SF8300ex (pYK20) ble serielt passert i tryptisk soyabuljong som inneholdt økende konsentrasjoner av ceftarolin (Skogslaboratorier) som tidligere beskrevet (11).

Plasmid mecA ble sekvensert for mutasjoner i passaged stammer. Siden Pbp er målet for β-laktam, ble pbp1, -2, -3 og -4 også sekvensert. Til slutt ble gdpP og acrB sekvensert, da mutasjoner i disse genene var blitt identifisert i en meca-negativ ceftobiprol-resistent mutant AV COL (16). Plasmid pYK208300T* (pYK20 Fra SF8300ex bestått i ceftarolin), hadde en enkeltpunktsmutasjon (G til A ved kodende sekvensposisjon 1339) i mecA, noe SOM resulterte I EN ikke-synonymt aminosyreendring, E447K. ingen mutasjoner var tilstede i andre pbp-gener, acrB eller gdpP (Tabell 4).

tabell 4

Mutasjoner i meca-positive mutantstammer passert med ceftobiprole og ceftarolin

Plasmid pYK20COLT* (Pyk20 Fra COLnex passert i ceftarolin) hadde ingen mutasjoner i meca. En punktmutasjon (C Til T ved CDS-posisjon 1327) som introduserte h443y-mutasjonen I GdpP, en punktmutasjon (G til A ved CDS-posisjon 466) som introduserte d156n-mutasjonen I PBP2, og to punktmutasjoner (A Til G ved CDS-posisjon 601 og C Til G ved CDS-posisjon 723) som introduserte t201a-og F241L-mutasjoner I PBP4 ble funnet (Tabell 4). Ceftarolin-passasje av COL som inneholdt mecA i sin naturlige kromosomale plassering, resulterte også i en mutant med høy resistens, men manglet mutasjoner i mecA (data ikke vist). Sekvensanalyse av den passaged mutanten viste en punktmutasjon i pbp2 (G Til A ved CDS-posisjon 1891), noe som resulterte I aminosyreforandringen G631S, og en i pbp4 (T Til A ved CDS-posisjon 414), og introduserte EN n138k-mutasjon. Disse dataene indikerer at selv i nærvær av meca, kan ceftarolin velge for mutasjoner i andre gener, noe som resulterer i resistens.

Herding Av COLnexpB (pYK20COLB*) og SF8300expT (pYK208300T*) av deres plasmider, som hver hadde meca-mutasjoner, reduserte Mic-Ene for alle β-laktamer som ble testet (Tabell 5 og 6). Herding Av COLnexpT (pYK20COLT*) av plasmidet, som manglet meca-mutasjoner, hadde ingen effekt På Mic (Tabell 5). Transformasjonen av pYK20COLB*, som inneholder 6 substitusjonsmutasjoner i mecA, til den følsomme COLnex-moderen, noe som ga transformanten COLnex (pYK20COLB*), resulterte i ceftarolin-og ceftobiprolresistens på høyt nivå. Transformasjonen av pYK208300T*, som inneholder enkeltmutasjonen E447K i mecA, Til COLnex, som ga transformanten COLnex(pYK208300T*), resulterte i høy resistens mot ceftobiprol (MIC på 64 µ/ml), men kun lav resistens mot ceftarolin (MIC på 4 µ/ml) (Tabell 5). Transformasjonen av pYK20COLB* til SF8300ex, som resulterte I Transformasjonen SF8300ex(pYK20COLB*), resulterte i høy resistens mot ceftarolin og ceftobiprol (MIC på 32 µ/ml til hver) (Tabell 6). Flere forsøk på å transformere SF8300ex med pYK208300T * mislyktes.