alle metoder i studier på mennesker og dyr er utført i henhold til relevante institusjonelle retningslinjer og forskrifter.

Isolering og kultur av Plasttilhengende MSCs og CD271 immunopositive MSCs fra fettvev

etter etisk godkjenning fra National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC nummer 12 / EE / 0136) og informert samtykke fra alle givere, PA MSCs og CD271+ MSCs ble isolert fra AT som hadde blitt høstet som kirurgisk avfallsprodukter. AT ble hakket og behandlet med 0.3 E/ml kollagenase (Sigma, Dorset UK) i to timer ved 37 °c, hvoretter Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 20% (v/v) føtalt kalveserum (FCS) og 1% (v/v) penicillin og streptomycin (Alle FRA Paa, Yeovil, Somerset, STORBRITANNIA) ble tilsatt og det fordøyede preparatet sentrifugert ved 600 g i 10 minutter. Den resulterende pelleten ble re-suspendert i DMEM supplert med 10% (v/v) FCS og 1% (v/v) penicillin og streptomycin, dvs.standard kulturmedium og passert gjennom en 100 µ cellesil (BD Biosciences, Berkshire, STORBRITANNIA). Filtratet ble re-sentrifugert ved 600 g i 10 minutter og pelleterte celler re-suspendert i 5 ml standard kulturmedium og passert gjennom en 40 µ cellesil. Den resulterende cellesuspensjonen ble deretter behandlet Med Erytrocytlysebuffer (Miltenyi Biotech, Surrey, STORBRITANNIA) i 10 minutter ved romtemperatur. For hver av preparatene ble MSCs isolert fra de mononukleerte cellene som er tilstede etter erytrocytlysering gjennom deres økte adhesjon til vevskultur plast8 eller ved magnetisk assosiert cellesortering (MACS) FOR CD271 immunopositivitet14. Disse cellene ble kultur utvidet i standardkulturmedium i en fuktet atmosfære ved 37 °C med rutinemessig passaging ved trypsinisering ved 80% sammenløp. PA MSCs og CD271 + MSCs ved passages II-III ble brukt til alle etterfølgende eksperimenter. Flowcytometri ble brukt til å vurdere anrikningen FOR CD271 + – celler (VED HJELP AV MACS-teknologi), hvor de nylig isolerte cellene ble lagret ved -80 °c over natten etter isolering, og deretter tint og umiddelbart immunosteret FOR CD271; for alle prøver var >90% av cellene VAR CD271 immunopositive på dette tidspunktet (data ikke vist).

in vitro differensieringsprotokoller

differensieringskapasiteten TIL PA og CD271+ MSCs for å danne osteocytter, kondrocytter og adipocytter ble vurdert som beskrevet tidligere8,45. Kort for osteogenese ble monolagskulturer Av MSCs behandlet med 10 nM dexametason, 50 ng / ml askorbinsyre og 1 mM beta glycerofosfat (versus bærerkontroller) hver 2-3 dager i en periode på 4 uker, hvoretter kulturer ble høstet ved fiksering og farget for alkalisk fosfataseaktivitet som følger: celler ble løst med 10% nøytral bufferformalin i 10 minutter. I mellomtiden ble fargeløsning fremstilt ved å plassere 25 mg naftolfosfat (Naftol AS-MX fosfat: Sigma) i 0,5 ml dimetylformamid. Denne oppløsningen ble blandet med 50 ml 0,2 M Tris-HCl-buffer inneholdende 50 mg fast red TR (Sigma). Etter blanding ble den endelige løsningen filtrert ved Hjelp Av Whatman No. 1 filterpapir (Whatman). Den fikserende løsningen ble deretter fjernet og celler ble vasket MED PBS, deretter ble 1 ml av fargeløsningen tilsatt hver brønn i 1 time. Til slutt ble flekken fjernet og digitaliserte bilder ble tatt med et invertert mikroskop. Differensiering langs den osteogene linjen ble ytterligere evaluert ved økt mengde alkalisk fosfataseaktivitet i differensierte celler sammenlignet med utifferentierte celler ved bruk av et kommersielt tilgjengelig sett (Biovision, USA) og ved å følge produsentens protokoll; kort sagt ble celler homogenisert i analysebufferen. De homogeniserte cellene ble deretter sentrifugert for å fjerne uoppløselig materiale ved 13.000 g i 3 minutter. Deretter ble 80 µ av hver av prøvene lastet i separate brønner på en 96 brønnplate. Deretter ble det tilsatt 50 µ 5 mM pNPP-oppløsning til hver prøvebrønn. Etter et blandingstrinn ved pipettering opp og ned ble brønnene inkubert ved 25 °C i 60 minutter. En standardkurve ble generert ved å fortynne 40 µ av 5 mM pNPP til 160 µ av analysebuffer for å generere 1 mM pNPP-standard. Deretter ble 0, 4, 6, 12, 16 og 20 µ av denne standardløsningen lastet inn i en 96 brønnplate for å generere 0-20 nmol/ml pnpp-standarder som kunne måles ved spektrofotometri. For kondrogenese ble cellepellets fremstilt I DMEM / høy glukose (Sigma) supplert med 100 nM deksametason (DEX), 37.5 µ / ml ascorbat-2-fosfat, 1% (vol/vol) insulin, transferrin Og selen (ITS-X100; Sigma) og 10 ng/ml transformerende vekstfaktor-β 1(TGF-β 1) (PeproTech, London, STORBRITANNIA) og penicillin og streptomycin. Kontrollkulturer ble behandlet MED DMEM / høyglukosemedier med bærere alene, dvs. metanol, sterilt vann og BSA ved passende fortynninger. På dag 28 ble chondrogenic differensiering undersøkt histologisk ved å feste pellets i 10% nøytral bufret formalin, deretter embedding i parafin og kutte vev seksjoner, som ble farget med toluidinblått (Sigma) som en markør for proteoglykan synthesis8. I tillegg ble nivået av glykosaminoglykan utskilt i differensieringsmediet i de siste 24 timene av kultur før høsting på dag 28 målt ved BRUK AV DMMB-analysen. DEN DMMB analyse protokollen ble tilpasset fra metoden For Farndale et al., 1986 som følger46: (i) DMMB-fargeløsningen ble utarbeidet ved å legge til 3.04 g glycin, 2,37 g NaCl og 16 mg 1,9 DMMB til 1 liter deionisert vann; (ii) pH ble justert til 3,0 med saltsyre og fargestoffoppløsningen ble lagret i en brun flaske; (iii) 50 µ av kulturmedium høstet fra de cellefrøede stillasene på dag 28 ble tilsatt i tre eksemplarer til en 96 brønnplate; (iv) 200 ④l AV DMMB-fargestoffoppløsningen ble tilsatt til kulturmediet og absorbansen ble vurdert ved 540 nm umiddelbart. Kondroitinsulfat (CS) fra haibrusk (Sigma) ble brukt til å gi en standardkurve for absorbans (0-40 µ / ml, CS) hvorfra GAGINNHOLDET i prøvene av kulturmedium ble beregnet. Nivåene av absorbans FOR GAGINNHOLD i prøvene av kulturmedium ble normalisert for å ta hensyn til bakgrunnsabsorbansresultatet fra tilstedeværelsen av fenolrød i mediet ved å oppløse standardene i DMEM-medium. FOR adipogenese ble MSC-kulturer opprettholdt i kulturmedier som inneholdt 1 µ DEX, 0.5 mM 3-isobutyl-metylxantin (Sigma), 1% insulin, transferrin og selen (ITS-X 100 pre-mix; PAA) OG 100 µ indometacin( Sigma), i 28 dager ved 37 °C og 5% CO2, som tidligere beskrevet47. Kontrollceller ble opprettholdt i komplette medier med bærere. Differensiering ble undersøkt Ved Bruk Av Olje Rød o farging av lipiddråper. Celler ble løst i 10% nøytral buffer formalin i 1 time hvoretter fargeløsningen ble tilsatt. Relativ olje Rød o akkumulering ble målt etter behandling med 100% isopropanol i 15 minutter og lese absorbansen av supernatanten ved 540 nm ved hjelp av et spektrofotometer.

MSC transplantasjon til en femoral osteochondral defekt modell

Etter institusjonell etisk gjennomgang Og godkjenning (Institutional Animal Care And Use Committees Of Fukui University, Institutt for Ortopedi Og Rehabiliteringsmedisin: Godkjenningsnummer 25-053), kvinnelige athymiske nakenrotter (F344/N Jcl Rnu / rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Japan) i alderen 6-10 uker og veide 150-170 gram ble tilfeldig fordelt i følgende grupper: (I) PA MSCs (n = 6 dyr); (ii) CD271+ MSCs (n = 6 dyr); (iii) en kontrollgruppe Av Alpha Chondro Shield stillas alene (ingen celler, n = 3 dyr). Disse antall dyr per gruppe har tidligere blitt brukt på samme institutt for å demonstrere signifikante forskjeller mellom behandlingsgrupper på 5% nivå48. Rottene ble bedøvet ved eksponering for 3% isofluran I o2-gass og opprettholdt ved 1,5% isofluran I O2-gass under kirurgi. Etter sterilisering av knærne ved hjelp av 70% etanol, ble en medial parapatellar hud snitt gjort etterfulgt av dissekere gjennom muskelen og deretter utsette kneleddet ved lateral forvridning av patella. Bilaterale osteochondrale defekter på 2 mm diameter og 1 mm dybde ble opprettet i patellarsporet av lårbenet til hvert dyr ved hjelp av en 2 mm diameter kirurgisk bore. Alpha Chondro Shield ble brukt som cellebærer/stillas for å levere 5 × 104 PA MSCs eller CD271+ MSCs versus ingen celler (som kontroller). Før transplantasjonen ble cellene høstet ved trypsinisering og sådd i et volum på 10 µ av standard kulturmedium på 2 mm diameter skiver Av Alpha Chondro Skjold, deretter inkubert i en fuktet atmosfære ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter for å fremme celletilhørighet og innlemmelse i stillaset. Celle-seeded og kontroll stillasene ble transplantert inn defekter og festet på plass med fibrin lim, som fikk lov til å sette i ca 10-20 sekunder (Fig. 6). Patella ble flyttet, og bindevev og hud sydd med nylon suturer. Dyr fikk lov til å bevege seg fritt etter utvinning og matet en standard vedlikeholdsdiett og vann ad libinum. Ved 3 uker etter transplantasjon ble dyr ofret ved overdosering av 3% isofluran for å undersøke omfanget av sårreparasjon makroskopisk og histologisk.

Makroskopisk scoring av brusk sårtilheling

etter å ha eksponert kneleddet i ofrede dyr, ble defekten skåret makroskopisk av to kirurger som ble blindet til behandlingsarmen ved hjelp av et etablert system for vurdering av brusk sårtilheling i mindre dyremodeller49. Graden av vevsreparasjon ble skåret fra 0 poeng (beste resultat) til 4 poeng (verste resultat) hver for: (1) fargen på reparasjonsvevet; (2) omfanget av blodkar sett i reparasjonsvevet; (3) glattheten av overflaten av reparasjonsvevet; (4) i hvilken grad sårdefekten var fylt med reparasjonsvev; (5) omfanget av degenerasjon av tilstøtende leddbrusk. De scoret poeng for hvert kriterium ble lagt og graden av beste reparasjon ble representert med lavest score fra en total score på 20.

Histologisk scoring av brusksårheling

etter kirurgisk eksisjon ble dyreknær festet i 10% nøytral bufret formalin (Sigma) i 48 timer og plassert I k-CX avkalkende løsning (FALMA, Tokyo, Japan) i 24-48 timer ved 4 °C. Etter dette ble rottekneene vasket over natten i rennende vann fra springen, behandlet og innebygd i parafinvoksblokker klar til snitting. Vevsseksjoner ble kuttet med 5 mikrometer tykkelse i et standard roterende mikrotom, og disse ble farget med hematoksylin og eosin (h&E) og toluidinblått før montering i DPX og histologisk undersøkelse. Omfanget og kvaliteten på bruskreparasjonen ble vurdert histologisk og uavhengig av to sensorer ved Hjelp Av Wakitani scoring system36, modifisert for å inkludere to tilleggsparametere, dvs. for å undersøke tilstedeværelsen av blodkar og fremmedlegemer gigantiske celler(FBGCs). Derfor besto scoringssystemet av syv forskjellige parametere: (1) cellemorfologi; (2) matriksfarging; (3) overflatefrekvens; (4) tykkelse av brusk; (5) integrering av reparasjonsvevet med vertsbrusk; (6) omfanget av vaskularisering i defekten; (7) omfanget AV fbgc-reaksjon. For hver av disse parameterne representerte den laveste poengsummen (0) den beste reparasjonen og den høyeste poengsummen (4) den verste reparasjonen. Den totale score ble lagt til og deretter sammenlignet mellom grupper ut av en total score på 21.

Immunhistokjemi for humant mitokondrielt antigen

vevsseksjoner ble farget med et anti-humant mitokondrielt antigen (HMA) antistoff (Klon 113-1: Abcam, Cambridge, STORBRITANNIA) for å vurdere tilstedeværelsen av humane MSCs. Etter antigeninnhenting ble seksjonene nedsenket i tre ENDRINGER AV PBS og blokkert i 20 minutter med 2,5% hesteserum (Vector Labs Ltd) ved romtemperatur for å forhindre ikke-spesifikk binding. Seksjonene ble deretter inkubert med musens anti-HMA antistoff (1:400 fortynning I PBS) i 1 time ved romtemperatur i et fuktet kammer. Etter dette ble ethvert ubundet antistoff vasket av i tre endringer AV PBS forsiktig og seksjonene ble inkubert med biotinylert Anti-mus IgG i 30 minutter ved romtemperatur. Seksjonene ble vasket tre ganger i PBS og endogen peroksidiseaktivitet ble blokkert ved bruk av 0,3% hydrogenperoksid i metanol i 30 minutter ved romtemperatur. Under dette inkubasjonstrinnet ble Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK) forberedt og fikk stå i 30 minutter før bruk i henhold til produsentens instruksjoner. Etter blokkering av den endogene peroksydiseaktiviteten ble seksjonene vasket i TRE GANGER PBS og inkubert MED ABC-reagenset i 30 minutter ved romtemperatur. Etter dette ble ET dab-kromogen (Vector labs) tilsatt i 6-8 minutter, avhengig av intensiteten av ønsket farge. Seksjoner ble deretter vasket og dehydrert gjennom en serie etanol (70-100%), ryddet med xylen og montert I Pertex. Chondrogenic pellet av human MSCs ble brukt som en positiv kontroll. Negativ kontroll inkluderte kondrogenpellet der det primære antistoffet ble utelatt.

scanning electron microscopy

adhesjonen Av MSCs sådd inn I Alpha Chondro Shield stillaset før implantasjon ble undersøkt ved scanning electron microscopy (sem) som følger: etter at de cellefrøede stillasene hadde blitt inkubert i en fuktet atmosfære ved 37 °c og 5% CO2 i 30 minutter, ble de vasket I PBS og deretter festet i 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) i 2 timer, deretter vasket i 0.1 M fosfatbuffer før behandling med 1% osmiumtetraoksid i 1 time. Prøvene ble deretter dehydrert gjennom en gradert serie etanoloppløsning, behandlet med overgangsløsning, t-butylalkohol i 30 minutter, frysetørket, belagt med gullpalladium og til slutt avbildet ved hjelp AV ET JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japan) Eller Zeiss EVO10 skanningelektronmikroskop (Carl Zeiss, Cambridge, STORBRITANNIA).

LIVE/DEAD flekker å analysere celle levedyktighet i celle-seeded stillas

MSC-seeded stillas ble farget MED LEVENDE / DØD flekker løsning etter produsentens protokoll, som beskrevet tidligere8. Kort sagt ble de cellefrøede stillasene nedsenket I DEN LEVENDE / DØDE fargeløsningen i 30 minutter i mørket ved 37 °C. stillasene ble deretter fjernet fra fargeløsningen, vasket I PBS og umiddelbart avbildet ved hjelp Av et konfokalt mikroskop (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

in vitro angiogeneseanalyser

HUMAN EA.hy926 endotelcellelinje ble brukt som en modell for å undersøke enhver angiogen aktivitet av kulturkondisjonert medium fra PA MSC OG CD271 + MSC CM. EA.hy926 endotelcelleproliferasjon / migrasjon og endotel tubuledannelse ble undersøkt som følger: (I) EA.hy926-celler ble dyrket i standardkulturmedium (DMEM/ F-12 supplert med 10% fbs, 1% penicillin og streptomycin) i 24 brønnplater i 2 dager til 100% konfluente monolag dannet. En steril pipettespiss ble brukt til å lage en ripe i monolaget. Deretter ble brønnene vasket med sterile PBS og deretter ble 1 ml kondisjonerte medier FRA PA MSC-kulturer eller CD271+ MSC-kulturer tilsatt i hver av triplikatbrønner per tilstand testet. Serumfritt DMEM kulturmedium ble brukt som kontroll. Platen ble inkubert I Cell IQ-plattformen for levende celle digitalisert avbildning over en 2-dagers periode, hvoretter riper sårlukking, levedyktige celletall og omfanget av migrasjon av individuelle celler ble kvantitert ved hjelp Av Cell IQ-bildeanalyseprogramvaren. Den proliferative responsen TIL EA.hy926 endotelceller TIL PA MSC og CD271+ MSC kondisjonerte medier (versus serumfritt kontrollmedium) ble også undersøkt ved HJELP AV MTT-analysen; (ii) EA.hy926 endotel tubuledannelse ble testet ved bruk av vekstfaktor-redusert Matrigel (BD Bioscience), som ble aliquotert til 96-brønnplater (50 µ Matrigel/brønn) og deretter inkubert i 30 min ved 37 °C. EA.hy926 endotelceller ble sådd på Matrigel ved 2 × 104 celler/brønn i 200 µ pa MSC og CD271+ MSC kondisjonerte medier eller serumfritt kontrollkulturmedium. Platene ble inkubert ved 37 °C i 1 dag, hvoretter de ble avbildet ved Hjelp Av Cell IQ imaging platform (3 bilder per brønn). Den totale endotelrørlengde / bilde og totalt antall endotelrørgreningspunkter / bilde ble målt ved Hjelp Av Cell IQ image analysator-programvaren.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført Ved Hjelp Av GraphPad Prism6 programvare (GraphPad Software, Inc. CA, USA). For in vivo eksperimenter ble minst n = 3 dyr per tilstand testet. For in vitro-forsøk ble n = 3-4 uavhengige forsøk utført for alle analyser, hvor data ble analysert med enveis ANOVA når det var en variabel faktor, og toveis ANOVA når det var to variable faktorer. For makroskopiske og histologiske resultater av bruskreparasjon ble forskjeller mellom grupper undersøkt ved Hjelp Av dunns flere sammenligningstester. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som signifikant. Alle data har blitt presentert som betyr ± SEMs eller betyr ± SDs (som angitt i figuren legender).