ヒトおよび動物の研究におけるすべての方法は、関連する制度的ガイドラインおよび規制に従って実施された。

脂肪組織からのプラスチック付着性MscおよびCD271免疫陽性Mscの単離および培養

国民保健サービス（NHS）健康研究機関（LREC番号12/EE/0136）からの倫理的承認およびすべてのドナーからのインフォームドコンセントに続いて、PA MscおよびCD271+Mscは、外科廃棄物として採取されたATから単離された。 ATはみじん切りにし、0で処理した。３Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ ＵＫ）を３ ７℃で２時間、その後、２ ０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシン（全てＰＡＡ、Ｙｅｏｖｉｌ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＵＫから）を補充したダ 得られたペレットを、１ ０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ、すなわち標準培地に再懸濁し、１ ０ ０μ ｍ細胞ストレーナ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ） 濾液を600gで10分間再遠心分離し、ペレット化した細胞を5ml標準培養培地に再懸濁し、40μ m細胞ストレーナーに通した。 次いで、得られた細胞懸濁液を、赤血球溶解緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）で室温で１ ０分間処理した。 各ＡＴ調製物について、赤血球溶解後に存在する単核細胞からｍｓｃを、組織培養ｐｌａｓｔｉｃへの接着の増加８またはＣＤ２ ７ １免疫能のための磁気関連細胞選別（ＭＡＣ）によ これらの細胞は、80％の合流でトリプシン化によるルーチン継代と37℃で加湿雰囲気中で標準的な培養培地中で拡張培養した。 継代ＩＩ〜ＩＩＩのＰＡ ＭｓｃｓおよびＣＤ２ ７ １＋ＭＳＣＳを、その後の全ての実験に使用した。 【０ ０ ２ ５】【０ ０ ２ ６】【０ ０ ２ ７】【０ ０ ２ ８】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９】【０ ０ ２ ９

In vitro分化プロトコル

骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を形成するためのPAおよびCD271+MSCsの分化能力は、前に記載されているように評価した8,45。 本発明の一実施形態では、Ｍｓｃｓの単層培養物は、１ ０ｎｍのデキサメタゾン、５ ０ｎｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１ｍ Ｍのベータグリセロリン酸（対キャリア対照）で処理され、２〜３日ごとに４週間の期間、培養物は、固定によって回収され、アルカリホスファターゼ活性のために以下のように染色された：細胞は、１ ０分間、１ ０％中性緩衝ホルマリンで固定された。 一方、ジメチルホルムアミド0.5mlに25mgのナフトール-リン酸（Naphthol AS-MX phosphate：Sigma）を配置することにより染色液を調製した。 この溶液を、５ ０ｍｇのｆａｓｔ ｒｅｄ ＴＲ（Ｓｉｇｍａ）を含有する０． よく混合した後、最終溶液をＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ． 次いで、固定液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、１ｍｌの染色液を各ウェルに１時間添加した。 骨形成系統に沿った分化は、市販のキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して、および製造業者のプロトコールに従うことによって、未分化細胞と比較して分化細胞中のアルカリホスファターゼ活性の量の増加によってさらに評価された；簡単に言えば、細胞はアッセイ緩衝液中で均質化された。 次いで、均質化された細胞を遠心分離して、不溶性物質を１ ３，０ ０ ０ｇで３分間除去した。 次いで、８ ０μ ｌの各試料を９ ６ウェル板の別々のウェルに装填した。 次いで、５ ０μ ｌの５ｍ ＭのＰＮＰＰ溶液を各試料ウェルに添加した。 上下にピペッティングすることによる混合工程に続いて、ウェルを25℃で60分間インキュベートした。 40μ lの5mMのpNPPを160μ lのアッセイ緩衝液に希釈して1mMのpNPP標準を生成することによって標準曲線を作成した。 次いで、0、4、6、12、16および20μ lのこの標準溶液を96ウェルプレートに装填して、分光光度法によって測定することができる0〜20nmol/mlのpNPP標準を生成した。 軟骨形成のために、細胞ペレットを、１ ０ ０ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）、３ ７を補充したＤＭＥＭ／高グルコース（Ｓｉｇｍａ）中で調製した。およびセレン（ＩＴＳ−Ｘ１ ０ ０；Ｓｉｇｍａ）ならびに１ ０ｎｇ／ｍｌ形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含む。 対照培養物を、担体のみを有するＤＭＥＭ／高グルコース培地、すなわちメタノール、滅菌水およびＢＳ Ａで適切な希釈で処理した。 28日目に、軟骨原性分化は、10％中性緩衝ホルマリンにペレットを固定し、その後、パラフィンに埋め込まれ、プロテオグリカン合成のマーカーとしてトルイジンブルー（シグマ）で染色された組織切片を切断することによって組織学的に調べた8。 さらに、28日目に収穫する前に培養の最後の24時間で分化培地に分泌されたグリコサミノグリカンのレベルは、DMMBアッセイを用いて測定した。 ＤＭＭＢアッセイプロトコルは、Ｆａｒｎｄａｌｅ ｅ ｔ ａ ｌ．,1986follows46:(i)3を添加してDMMB色素溶液を調製した。04gのグリシン、2.37gのNaClおよび16mgの1,9DMMBの1リットルの脱イオン水;(ii)pHを塩酸で3.0に調整し、色素溶液を茶色のボトルに保存した;(iii)50μ lの細胞播種足場から収穫された培養培地のアリコートを28日目に96ウェルプレートに三重に加えた;(iv)200μ lのDMMB色素溶液を培養培地に加え、吸光度を培養培地で評価した。すぐに540nm。 サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸塩（ＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）を使用して、吸光度の標準曲線（０〜４ ０μ ｇ／ｍｌ、ＣＳ）を提供し、そこから培養培地の試料中のＧＡＧ含量を計算した。 培地中のＧＡＧ含有量に対する吸光度のレベルは、標準をＤＭＥＭ培地に溶解することにより、培地内のフェノールレッドの存在から得られる背景吸光度を説明するために正規化された。 脂肪形成のために、ＭＳＣ培養物を、１μ ＭのＤＥＸ、０を含有する培養培地中に維持した。５ｍ Ｍの３−イソブチル−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、１％インスリン、トランスフェリンおよびセレン（ＩＴＳ−Ｘ１ ０ ０プレミックス；ＰＡＡ）および１ ０ ０μ Ｍインドメタシン（Ｓｉｇｍａ）を、３ ７℃およ 対照細胞は、担体を含む完全培地中に維持した。 脂質液滴の油赤Ｏ染色を用いて分化を調べた。 細胞を１ ０％中性緩衝ホルマリン中に１時間固定した後、染色溶液を添加した。 相対油赤O蓄積は、100％イソプロパノールで15分間処理し、分光光度計を用いて540nmで上清の吸光度を読み取った後に測定した。

MSC大腿骨軟骨欠損モデルへの移植

制度的倫理審査および承認（福井大学整形外科リハビリテーション医学部門の制度的動物ケアおよ ６〜１ ０週齢で、体重１ ５ ０〜１ ７ ０グラムを以下の群に無作為に割り付けた：（ｉ）ＰＡ Ｍｓｃ（ｎ＝６動物）；（ｉ ｉ）ＣＤ２ ７ １＋Ｍｓｃ（ｎ＝６動物）；（ｉｉｉ）Αコンドロシールド足場単独の対照群（細胞なし、ｎ＝３ グループあたりの動物のこれらの数は、5％レベルでの治療群間の有意差を実証するために、以前に同じ研究所で使用されてきた48。 ラットはO2ガスの3%のイソフルランへの露出によって麻酔され、外科の間にO2ガスの1.5%のイソフルランで維持されました。 70％エタノールを使用して膝を滅菌した後、内側のparapatellar皮膚切開を行い、続いて筋肉を切開し、膝蓋骨の側方脱臼によって膝関節を露出させた。 直径2mmおよび深さ1mmの両側骨軟骨欠損は、直径2mmの外科用ドリルを用いて各動物の大腿骨の膝蓋溝に作成された。 アルファコンドロシールドを細胞担体／足場として使用して、５×１ ０ ４ＰＡ ＭｓｃまたはＣＤ２ ７ １＋Ｍｓｃを無細胞に対して送達した（対照として）。 移植前に、細胞をトリプシン化によって回収し、10μ lの標準培養培地に2mmの直径のアルファコンドロシールドディスクに播種し、37℃および5％CO2で30分間湿らせた雰囲気中でインキュベートし、細胞の付着および足場への取り込みを促進した。 細胞播種および対照足場を欠損部に移植し、フィブリン接着剤で所定の位置に固定し、これを約10〜20秒間セットさせた（図10B）。 6). 膝蓋骨を再配置し，結合組織と皮膚をナイロン縫合で縫合した。 動物は、回復後に自由に移動させ、標準的な維持食および水ad libinumを与えた。 移植後3週間で、動物は肉眼的および組織学的に創傷修復の程度を調べるために3％イソフルランの過剰摂取によって犠牲にされた。

軟骨創傷治癒の巨視的スコアリング

犠牲にされた動物の膝関節を露出させた後、欠陥は、より小さな動物モデル49で軟骨創傷治癒の評価のための確立されたシステムを使用して治療アームに盲目にされた二人の外科医によって肉眼的にスコアリングされた。 組織修復の程度は、0ポイント（最良の結果）から4ポイント（最悪の結果）それぞれのために得点した：（1）修復組織の色;（2）修復組織内に見られる血管の程度; (3)修復組織の表面の滑らかさ;(4)創傷欠損が修復組織で満たされた程度;(5)隣接する関節軟骨の変性の程度。 各基準の得点が追加され、最高の修復の程度は、合計スコア20から最低のスコアで表されました。外科的切除後、動物膝を１ ０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中に４ ８時間固定し、Ｋ−Ｃ Ｘ脱石灰化溶液（ＦＡＬＭＡ、東京、日本）中に４℃で２ ４〜４ ８時間置いた。

軟骨創傷治癒の組織学的スコアリング

外科的切除後、動物膝を１ ０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中に４ ８時間固定し、Ｋ−Ｃ Ｘ脱石灰化溶液（ＦＡＬＭＡ、東京、日本）中に２ ４〜４ ８時間４℃で置いた。 これに続いて、ラットの膝を流水で一晩洗浄し、加工し、切片化の準備ができたパラフィンワックスブロックに埋めた。 組織切片を、標準回転ミクロトーム中で５ミクロンの厚さで切断し、これらを、ｄｐｘに取り付ける前および組織学的検査の前に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＜ｄｉｖ ｉ ｄ＝「６ ２ ３ａ２ｄｅｅａ５」＞＜／ｄｉｖ＞Ｅ）およびトルイジンブルーで染色した。 軟骨修復の程度と質は、Wakitaniスコアリングsystem36を使用して二つの審査官によって組織学的かつ独立して評価された、すなわち二つの追加のパラメータを含むように変更された。 血管および異物巨細胞（FBGCs）の存在を調べる。 （1）細胞形態;（2）マトリックス染色;（3）表面規則性;（4）軟骨の厚さ;（5）宿主軟骨と修復組織の統合;（6）欠陥内の血管新生の程度;（7）FBGC反応の程度。 これらのパラメータのそれぞれについて、最低スコア（0）は”最良”の修復を表し、最高スコア（4）は”最悪”の修復を表しました。 全体的なスコアが追加され、合計スコア21のうちグループ間で比較されました。ヒトｍｓｃの存在を評価するために、組織切片を、抗ヒトｍｓｃ抗原（Ｈ Ｍ Ａ）抗体（クローン１ １ ３−１：Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で染色した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ヒトｍｓｃの存在を評価した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ヒトｍｓｃの 抗原検索の後、切片をＰＢＳの３つの変化に浸漬し、非特異的結合を防止するために、室温で２.５％馬血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ Ｌｔｄ）で２ ０分間遮断した。 次いで、切片をマウス抗Ｈ Ｍ Ａ抗体（１）とインキュベートした。:400pbsで希釈）加湿チャンバ内で室温で1時間。 これに続いて、任意の未結合抗体を、ＰＢＳの３つの変化で穏やかに洗浄し、切片を、室温で３ ０分間、ビオチン化抗マウスＩｇｇとインキュベートした。 切片をPBSで三回洗浄し、内因性過酸化活性をメタノール中0.3％過酸化水素を用いて室温で30分間遮断した。 このインキュベーション工程の間に、Ｖｅｃｔａ ＡＢＣ ｒｅｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ Ｌｔｄ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を調製し、製造業者の指示に従って使用前に３ ０分間放置した。 内因性過酸化活性を遮断した後、切片を３回ＰＢＳ中で洗浄し、ＡＢＣ試薬と共に室温で３ ０分間インキュベートした。 これに続いて、ＤＡＢ色原体（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）を、所望の色の強度に応じて６〜８分間添加した。 次いで、切片を洗浄し、一連のエタノール（７ ０〜１ ０ ０％）を通して脱水し、キシレンで除去し、Ｐｅｒｔｅｘに装着した。 ヒトＭｓｃｓの軟骨原性ペレットを陽性対照として用いた。 陰性対照には一次抗体が省略された軟骨原性ペレットが含まれていた。

走査型電子顕微鏡

移植前にアルファコンドロシールド足場に播種MSCsの接着は、次のように走査型電子顕微鏡（SEM）によって調べた：細胞播種足場は、37℃、5％CO2で加湿雰囲気中で30分間インキュベートされた後、それらはPBSで洗浄し、2％グルタルアルデヒドに0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）に2時間固定し、0で洗浄した。1時間1%の四酸化オスミウムとの処置前の1つのMの隣酸塩緩衝。 次いで、試料を、段階的な一連のエタノール溶液を通して脱水し、遷移溶媒、ｔ−ブチルアルコールで３ ０分間処理し、凍結乾燥し、金パラジウムで被覆し、最後に、ＪＳＭ−６ ３ ９ ０（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）またはＺｅｉｓｓ ＥＶＯ１ ０走査電子顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて画像化した。細胞播種足場における細胞生存率をアッセイするためのライブ／デッド染色

MSC播種足場を、前に記載されているように、製造業者のプロトコ 次いで、足場を染色溶液から除去し、ＰＢＳ中で洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＭ６ ０ ０ ０Ｂ−ＳＰ５ ７ＣＳ）を用いて直ちに撮像した。

インビトロ血管新生アッセイ

ヒトEA。Ｈ ｙ９ ２ ６内皮細胞株を、ＰＡ ＭＳＣおよびＣＤ２ ７ １＋ＭＳＣ ＣＭ由来の培養馴化培地の任意の血管新生活性を調べるためのモデルとして使用した。 エー…hy926内皮細胞増殖/遊走および内皮細管形成を以下のように調べた：（i）EA。hy926細胞は、10％fbs、1％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した標準培地（DMEM/F-12）中で24ウェルプレート中で2日間培養し、100％合流単層が形成された。 滅菌ピペットチップを使用して単分子層に傷をつけた。 続いて、ウェルを滅菌ＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＡ ＭＳＣ培養物またはＣＤ２ ７ １＋ＭＳＣ培養物からの馴化培地１ｍｌを、試験された条件ごとに３つのウェルの各々に添加した。 無血清ＤＭＥＭ培地を対照として使用した。 プレートは、2日間にわたって生細胞デジタル化イメージングのための細胞IQプラットフォームでインキュベートした後、スクラッチ創傷閉鎖、生細胞数と個々の細胞の遊走の程度は、細胞IQ画像解析ソフトウェアを使用して定量化された。 EAの増殖応答。ＰＡ ＭＳＣおよびＣＤ２ ７ １＋ＭＳＣ馴化培地（対無血清対照培地）に対するｈ ｙ９ ２ ６内皮細胞もまた、ＭＴＴアッセイ；（ｉ ｉ）Ｅ Ａを使用して調べた。ｈ ｙ９ ２ ６内皮細管形成を、成長因子減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて試験し、これを９ ６ウェルプレート（５ ０μ ｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ウェル）に分注した後、３ ７℃Ｅ Ａで３ ０分間インキュベートした。ｈ ｙ９ ２ ６内皮細胞を、２ ０ ０μ ｌのＰＡ ＭＳＣおよびＣＤ２ ７ １＋ＭＳＣ馴化培地または無血清対照培養培地中の２×１ ０ ４細胞／ウェルでマトリゲル上に播種した。 プレートを３ ７℃で１日間インキュベートし、その後、Ｃｅｌｌ ＩＱ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ウェル当たり３枚の画像）を使用して画像化した。 総内皮細管長／画像および内皮細管分岐点／画像の総数を、Ｃｅｌｌ Ｉ Ｑ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｅｒソフトウェアを使用して測定した。統計解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ． カリフォルニア州、米国）。 インビボ実験のために、条件ごとに最小のn=3動物を試験した。 In vitro実験では、n=3-4の独立した実験は、データが一つの可変因子があったときに一方向ANOVAで分析し、二つの可変因子があったときに双方向ANOVAで分析したすべ 軟骨修復の肉眼的および組織学的スコアについて，群間の差をＤｕｎｎの多重比較試験を用いて調べた。 0.05未満のp値は有意であると考えられた。 すべてのデータは、平均±Ｓｅｍｓまたは平均±Ｓｄｓとして提示されている（図の凡例に示されているように）。