肺転移の連続継代は転移の可能性を高める

PDXラインWU-BC3は、転移性TNBC患者の乳房腫瘍細胞をNOD|SCIDマウスのヒト化乳房脂肪パッド(Mfp)に移植することによって生成されました。本発明者らは、これらの腫瘍細胞を、クリックビートルレッドルシフェラーゼ（ＣＢＲ−Ｌｕｃ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびｐ５ ３（ＳＨＡ２）に特異的なｓｈＲＮＡを安定的に発現させて、ＰＤＸラインＢＣ３＿Ａ２（以前はＢＣ３−ｐ５ ３ＫＤ２ ８ 1a）。 腫よう細胞はＭｆｐｓから肺，肝臓，骨，脳，リンパ節などの生理的に関連する部位に転移することを示した。28肺転移（P0）は、複製マウスから単離され、プールされ、レシピエントマウスのMfpに移植された。 得られた肺転移（P1）は、単離され、プールされ、追加のマウスのMfpに移植された。 これらのマウス（Ｐ２）からの肺転移もまた収集され、プールされた（補足図１ ０Ａ）。 1b）。 本発明者らは、剖検時に肺、骨、および肝臓の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行い、各通過における転移の相対的な大きさを定量化した（補足図１）。 1c）。 全ての部位に転移する能力が増大した腫瘍細胞のために濃縮された連続継代（補足図１ ０Ａ）。 ることを必要とした（図１ｄ−ｆ、ｈ）。 1i）。 対照的に、Ｍｆｐ間の連続継代腫瘍は、肺転移の増加をもたらさなかった（補足図４）。 このことは、増強された転移能力の獲得が、単にin vivoでの連続継代腫瘍の結果ではなかったことを示す。 さらに、増強された転移能力を有する腫瘍細胞は、Ｍｆｐから単離され、レシピエントマウスのＭｆｐに戻されたときに、増殖特性の有意な増加を示さなかった（ 1j）。 一緒に取られて、これらの結果は、このモデルでは肺からMfpへの腫瘍細胞のシリアル継代は、転移性の可能性ではなく、臓器特異的ホーミングのために富mfp腫瘍と比較して肺転移で間葉系遺伝子発現が減少する

転移に伴う遺伝子発現パターンの変化を同定するために、肺転移（P0およびP2）およびMFP（p0およびp2）腫瘍に対してRNAシークエンシング（RNAseq）を行った（図。 1aおよび補足表1)。 マウスのトランスクリプトームへのマッピングRNAseq読み取りを減算した後、唯一のヒト転写産物読み取りは、下流の分析のために使用されました。 主成分分析（PCA）は、分析された他の亜集団よりも互いにより密接にクラスタ化されたP2腫瘍試料の生物学的複製として、in vivoで繰り返し継代と生物学的複製の間で不和が減少したことを明らかにした（fig. 1b）。 遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＥＭＴが、ＭＦＰ腫瘍と比較して、Ｐ０およびＰ２肺転移の両方において最も有意に下方制御された経路であることを明らかにした（図 1c）。 ＥＭＴを調節するＴＧＦ−βシグナル伝達もまた、Ｐ０およびＰ２肺転移の両方において有意に下方制御された（図２Ｂ）。 1c）。

定量的リアルタイム（qRT-PCR）は、ビメンチン、間葉マーカー、mfp腫瘍 ビメンチンの発現は、各継代における対応する肺転移と比較して、ＭＦＰ腫瘍においてより高い発現を有する動的パターンを示した（図１ ０Ａ）。 およびｐ０での肝転移（補足図１ｄ）およびｐ０での肝転移（補足図１Ｄ）を参照のこと。 2a）。 ビメンチン蛋白質レベルは、この動的パターンを再現した（図。 1e）。 追加のＥＭＴ遺伝子もまた、対応するＭＦＰ腫瘍と比較して肺転移において下方制御された（図１ ０Ｂ）。 1階）。 間葉系マーカー CDH2（N-カドヘリンをコードする遺伝子）の発現は、ビメンチンと同じパターンに従った（補足図。 上皮マーカー ＣＤ Ｈ１（Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子）の発現は、逆の傾向を示した（補足図２Ｂ）が、一方、上皮マーカー ＣＤ Ｈ１（Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子）の発現は、逆 2c）。 同時生着したヒト間質線維芽細胞は、腫瘍採取の時までに除去された（補足図１ ０Ａ）。 これらは、ＭＦＰ腫瘍における間葉系マーカーの発現に寄与した可能性を除外した。 まとめると、これらの結果は、腫瘍が一度転移部位に確立された間葉系遺伝子の発現を下方制御することを示している。

機能画面の高スループット利得のためのライブラリの複雑さの決定

高スループット利得機能（GOF）画面は、私たちのP2肺metastasesシグネチャからmetastasis 転移の既知のドライバーであるＨＯＸＡ１は、スクリーン最適化のための陽性対照として働き、ｇｆｐは陰性対照として使用された。 ＢＣ３＿Ａ２細胞を、ＨＯＸＡ１またはＧＦＰのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、感染した腫瘍細胞を異なる比率で混合した（補足図１ ０Ａ）。 4a）。 次いで、腫瘍細胞の混合集団をレシピエントマウスのＭｆｐに生着させ、ｂｌｉを使用して、剖検時に肺転移をスコア化した（補足図４）。 4b）。 第２の一連の実験では、転移性ドライバー ＩＤ１ ９をＧＦＰと組み合わせて使用したが、この場合、転移の最終段階をモデル化するために、腫瘍細胞の混合集団を 4c）。 光子流束の有意な増加は、ＨＯＸＡ１：ＧＦＰまたはＩＤ１：ＧＦＰ比が１：１ ０の腫瘍から観察された。 これらの複雑さテストは、9つの非ドライバオープンリーディングフレーム（Orf）でプールされた場合、善意のmetastasisドライバが画面で検出できることを示しましたが、19の非ドライバを持つ一つのドライバのプールは、ドライバを検出する能力をマスクしました。 これらの結果に基づいて、プールのサイズを12Orfに制限しました。

高スループットgain-of-functionスクリーニングin vivoでtnbc metastasisの候補機能ドライバーを識別

P2肺metastasis署名からupregulated遺伝子のどれが肺metastasisを駆動することができたかを決定するために、我々は最も高度に肺metastasisでupregulatedされた230遺伝子のOrfをエンコードするカスタムバーコードレンチウイルスライブラリーを設計した。 ＯＲＦを、それぞれの細胞株が単一のＯＲＦを発現するように、ＢＣ３＿Ａ２細胞で個別に発現させ、次いで、細胞を１ ２の群にプールし、そしてプールを、レシピエントマウス（プールあたりｎ＝１ ０匹のマウス、図１ ４Ａ）のＭｆｐに移植した。 2a）。 このＴＮＢＣモデルにおける内在性転移を測定するために、ＧＦＰを発現する対照プラスミドを各プールに含めた。 各ORFは、ユニークなDNAバーコードに関連付けられていました。 プールされた細胞の参照ペレットを、腫瘍移植時に各ＯＲＦの同等の表現を確認するために、急凍結した。 ＧＦＰ発現腫瘍ではなく、ＨＯＸＡ１がこの時点までに肺に転移したので、１ ３週間を試験の評価項目として選択した（補足図１ ４Ａ）。 5a）。 生着後１ ３週間、肺をＢＬＩ ｅ ｘ ｖｉｖｏに供した（補足図１ ４）。 ５Ａ）、転移性病変を単離し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、ｑＰＣＲの鋳型として使用して、各ＯＲＦに関連する固有のバーコード領域を増幅した（補足図５Ａ）。 5b）。 また、ＭＦＰ腫瘍を単離し、これらの分析に供した（図１ ０Ｂ）。 2a）。 参照サンプルに対するＭＦＰ中の各バーコードＯＲＦの表現を、各プールについて決定した（図１ ０Ａ）。 図2b;補足図2B;補足図2b。 5c、d）。 次いで、肺における表現は、Ｍｆｐ対参照における濃縮に対して正規化された（図１ ０Ａ）。 2b、c）。 転移ドライバーは、肺およびMfpの両方に富化したものを含む三つのグループに分離した（図。 図2bに示すように、右上象限および補足図。 図５Ｃ）、Ｍｆｐのみに濃縮されたもの（図５Ｃ）である。 図2b、右下象限）および肺にのみ富化されたもの（図2b、右下象限）および肺にのみ富化され 図2bに示すように、左上象限および図2bに示すように、左上象限 2c）。 ＧＦＰを発現する細胞は、プールのいくつかにおいて肺転移が濃縮され、肺におけるＧＦＰの平均濃縮スコアは、約５であった（補足図１ ０Ａ）。 5e）。 したがって、我々は、我々の画面で真のヒットを定義するために濃縮スコアカットオフとしてこれを使用し、原発腫瘍に対する肺metastasesに選択的に濃縮された44 これらのヒットは、濃縮スコアによってランク付けされた（図。 2cおよび補足表2)。 トップ５ヒットの中で、ＣＥＡＣＡＭ５は、原発腫瘍での発現が乳癌患者の生存不良を予測することが見出された唯一のものであった（補足図５）。 6a）。 したがって、我々はさらに乳癌metastasisにおけるCEACAM5の機能的役割を検討した。

追加の転移性PDXモデルにおける強化されたCEACAM5発現の確認

我々は、転移性サブ集団がin vivoで肺とMfpの間で連続的に継代されたようにCEACAM5発現が動的に調節されたことを見出した（図。 図3a)、RNAseqからの知見を確認する（補足表1および補足図。 6b）。 同様に、ＣＥＡＣＡＭ５発現は、肝臓でより高かった（補足図１ ０Ａ）。 図７ａ）および脳（補足図７Ａ）および脳（補足図７Ｂ）。 対応するＭＦＰ腫瘍に対する転移。 ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質レベルは、ｍｆｐ腫瘍と比較して肺転移においても高かった（図１ ０Ｂ）。 3b）。 野生型ｐ５ ３ ２ ６、３ ０を発現する等原性ＰＤＸ株からの肺転移もまた、より高いＣＥＡＣＡＭ５発現レベルを示したので、転移病変におけるＣＥＡＣＡＭ５発現の増加は、このＰＤＸ株でのｐ５ ３サイレンシングに依存しなかった（補足図３）。 7c）。

TNBC（PIM001）のPDXモデルの第二のセットは、転移病変におけるCEACAM5の増加が転移の一般的な特性であったかどうかを PIM001-Pは転移性TNBCを有する患者の治療ナイーブ原発腫瘍から確立されたが、PIM001-Mは同じ患者からの皮膚metastasisから確立された。 ＰＩＭ０ ０ １−Ｐ腫瘍細胞を、ＣＢＲ−ＬｕｃおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方を発現するように操作し、次にレシピエントマウスのＭｆｐに移植した。 剖検時にＭＦＰ腫ようおよび肺metastasesが単離された。 ＣＥＡＣＡＭ５発現は、両方のｍＲＮＡレベルで増加した（図１ ０Ｂ）。 （図３Ｃ）およびタンパク質レベル（図３Ｃ）。 対応するＭＦＰ腫瘍と比較して、ＰＩＭ０ ０ １−Ｐ肺転移では３ｄ）である。 興味深いことに、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質レベルは、彼女の原発性乳房腫瘍（ＰＩＭ０ ０ １−Ｐ）から確立されたＰＤＸ ＭＦＰ腫瘍と比較して、患者の皮膚転移（ＰＩＭ０ ０ １−Ｍ）から確立されたＰＤＸ ＭＦＰ 7d）。 集合的に、これらの結果は、ＣＥＡＣＡＭ５の上昇がＴＮＢＣのＰＤＸモデルにおける転移の共通の特性であることを実証する。PDXモデルにおけるCEACAM5の発現はビメンチンの発現と逆相関していたため、CEACAM5の発現はビメンチンの発現およびp38のリン酸化と逆相関していた（図 図１ｄ、図３ａ；補足図１Ｄ、図３ａ。 2aおよび7a、b）、免疫組織化学（IHC）は、ビメンチンおよびCEACAM5の相対的なレベルについて肺metastasesおよびMFP腫瘍をモニターするために用いられた。 タンパク質レベルは、両方のPDXモデルにおいてmRNAレベルと相関していた（図10B）。 3e、f）。 ビメンチン発現はまた、乳癌細胞株のパネルにおけるＣＥＡＣＡＭ５発現と逆相関した（図１ ０Ａ）。 3g）。 セリン/スレオニン特異的プロテインキナーゼp38alpha（MAPK14としても知られている、以下p38と呼ばれる）はEMT中にリン酸化される。興味深いことに、リン酸化された（活性）ｐ３ ８は、ＭＦＰ腫瘍におけるビメンチンの高発現レベルと相関し、ビメンチンレベルが低い肺転移ではｐ３ ８リン酸化 3時間）。 集合的に、これらのデータは、ＣＥＡＣＡＭ５発現が肺転移におけるＥＭＴマーカーの発現と反比例することを示す。

Ceacam5の異所性過剰産生は、TGF-βシグナル伝達とEMTマーカーの発現を阻害する

CEACAM5発現が逆に間葉系状態と相関していることを考えると、我々はCEACAM5が間葉系マーカーの発現を調節する上で直接の役割を持っていたかどうかを評価した。 ＢＣ３＿Ａ２細胞は、陰性対照としてヒトＣＥＡＣＡＭ５またはＧＦＰを過剰産生するように操作された（補足図１ ０Ａ）。 8a、b）は、ビメンチンとCDH2/N-カドヘリン（間葉系マーカー）とCDH1/E-カドヘリン（上皮マーカー）の発現を調べた。 ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現は、ＣＤ Ｈ１の発現の増加をもたらした（補足図１ ０Ａ）。 およびＣＤ Ｈ２の発現の減少（図８Ｃ）およびＣＤ Ｈ２の発現の減少（補足図８Ｃ）を含む。 およびｖｉｍｅｎｔｉｎ（補足図８Ｄ）およびｖｉｍｅｎｔｉｎ（補足図８Ｄ）。 8e）。 加えて、ＣＥＡＣＡＭ５の過剰産生は、ＢＣ３＿Ａ２細胞におけるＳｍａｄｓのＴＧＦ−β媒介リン酸化を減少させ、遅延させた（図１ ０Ａ）。 図4a、c、補足図。 ＢＣ３＿Ａ２細胞の両方におけるｐ３ ８リン酸化（図９Ａ）およびｐ３ ８リン酸化（図９Ａ）。 図4a、b、補足図。 Ｍｄａ−ＭＢ−２ ３ １細胞（図９Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２ ３ １細胞（図９Ｂ）を含む。 図8f、補足図。 9b）。 最後に、ＣＥＡＣＡＭ５の過剰産生は、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチン発現によって評価されたように、ＴＧＦ−β誘導ＥＭＴを遅延させた（図１ ４Ａ）。 図４Ｄ、補足図４Ｄ、補足図４Ｄ。 9c）。 これらの結果は、CEACAM5が負EMTを調節し、乳癌metastasisにおけるCEACAM5の機能を同定することを示唆している。

CEACAM5の過剰産生は、転移性伸長を促進し、IN vivoでEMTを減少させます

EMTは、細胞増殖の減少に関連しています。したがって、ＥＭＴを阻害するＣＥＡＣＡＭ５の能力は、それが転移部位での腫瘍の増殖を促進するために機能し得ることを示唆した。 この仮説を試験するために、ＣＥＡＣＡＭ５またはｇｆｐ（対照）を過剰産生するように操作されたＢＣ３＿Ａ２細胞を、肺の腫瘍増殖に対するＣＥＡＣＡＭ５過剰産生の効果をモニターす ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現は、肺における腫瘍増殖の増加をもたらした（図１ ０Ｂ）。 図５ａおよび補足図５ｂおよび補足図５ｂ。 図１ ０ａ）、タンパク質レベルでのビメンチンの発現の減少（補足図１ ０Ａ）。 びｐ３ ８のリン酸化を減少させた（図１ ０Ｂ）。 5d、e）。 ２つの異なるｓｈＲＮＡを用いてＢＣ３＿Ａ２中のＣＥＡＣＡＭ５レベルを低下させる（図１ ０Ｂ）。 形質導入された細胞は、尾静脈注射後の対照細胞よりも肺内でよりゆっくりと成長するという点で反対の効果を有していた（図５Ｂ）。 図５ｃおよび補足図５ｃおよび補足図５ｃ。 10c）。 さらに、CEACAM5ノックダウンは、病変数を増加させたが、病変サイズを減少させた（補足図。 10d,e)。 これらの結果は、CEACAM5サイレンシングは、同時に転移性伸長を阻害しながら、EMTおよび腫瘍細胞の血管外漏出を促進することを示唆している。

CEACAM5の過剰産生が遺伝子発現にどのように影響するかを監視するために、CEACAM5またはGFPを過剰産生するように設計されたBC3_A2細胞をin vitroで培養するか、または尾静脈注射後（in vivo）肺から単離した。 ＲＮＡを単離し、Ｒｎａｓｅｑに供した。 差動遺伝子発現解析を実施し、ＧＳＥＡは、ＥＭＴを、ＣＥＡＣＡＭ５過剰産生によってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で有意に下方制御された唯一の癌特徴経路として同定した（図１Ｂ）。 図５Ｆ、補足図５Ｆ、補足図５Ｆ。 11). この結果は、Ｐ０およびＰ２肺転移で観察された結果と同様である（図１および図２）。 1c、5f）。 集合的に、これらのデータは、転移性病変におけるＣＥＡＣＡＭ５発現の上方調節が、ＭＥＴを誘導し、二次部位における転移性腫瘍細胞の伸長を増強することを示した。

ceacam5の発現は、乳癌患者からの転移病変でアップレギュレートされます

次に、ceacam5の発現は、乳癌患者から得られた転移病変および乳房腫瘍組織 乳癌患者からの原発腫瘍および肺metastasisからなる一致した組織セット上のIHC染色（補足表3）は、原発乳房腫瘍と比較して肺metastasisにおいてより高いCEACAM5レベ および補足図６ａおよび補足図６ｂ。 12a）。 拡大これらの分析は、組織マイクロアレイ(TMA)の肺転移25日から乳がん患者の補正、pdfファイルをご利用下さい。 図１ ２Ｂ、ｃおよび補足表３）をＣＥＡＣＡＭ５について染色した（補足図１ ２Ｂ、ｃおよび補足表３）。 染色強度をスコアに割り当てた（図１ ２Ｂ）。 6b）。 このスコアリング方法はまた、CEACAM5について染色されたヒト乳房腫瘍からなるヒトタンパク質アトラスからのTMAにも適用された。 （図６Ｃ）乳房腫瘍と比較した（図６Ｃ）。 ＣＥＡＣＡＭ５は、原発性乳房腫瘍と比較して転移性病変で高かったことを示す。

我々は、次にCEACAM5とビメンチンの共発現のために一致した組織セットを評価しました。 ＣＥＡＣＡＭ５およびビメンチンの共染色は、一致した乳房腫瘍と比較して肺転移においてより高いレベルのＣＥＡＣＡＭ５を明らかにし、ビメンチンについて逆染色パター 6e,f)。 加えて、腫瘍細胞の少数の集団は、ＣＥＡＣＡＭ５およびビメンチンの両方について共染色を示した（図１ ０Ａ）。 6階）。 両方のタンパク質に対して陽性で染色された細胞は、ハイブリッドＥＭＴ／ＭＥＴ状態の細胞を表すことができる。２ ５人の乳癌患者からの肺転移からなるＴＭＡもまた、ＣＥＡＣＡＭ５とビメンチン染色との間に逆相関を示した（図３ ３）。 図６ｇ、ｈ；補足図６Ｇ、ｈ；補足図６Ｇ。 12a-e）。 これらの結果は、TNBCの我々のPDXモデルで作られた結論を確認し、CEACAM5発現が原発性乳房腫瘍および転移性病変におけるビメンチン発現と反比例するこ まとめると、これらの結果は、CEACAM5が転移部位での腫瘍の伸長を促進するためにMETを促進することを示唆している（補足図12a、b）。