Tutti i metodi in studi umani e animali sono stati eseguiti in conformità con le pertinenti linee guida istituzionali e normative.

Isolamento e coltura di MSC aderenti alla plastica e MSC immunopositivi CD271 dal tessuto adiposo

A seguito dell’approvazione etica da parte dell’Autorità di ricerca sanitaria del Servizio sanitario nazionale (NHS) (LREC numero 12/EE/0136) e del consenso informato di tutti i donatori, le MSC PA e le MSC CD271+ sono state isolate da AT che erano state raccolte come L’AT è stato tritato e trattato con 0.3 U/ml di collagenasi (Sigma, Dorset UK) per due ore a 37 °C dopo di che è stato aggiunto il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 20% (v/v) siero di vitello fetale (FCS) e 1% (v/v) penicillina e streptomicina (tutti da PAA, Yeovil, Somerset, UK) e la preparazione digerita centrifugata a 600 g per 10 minuti. Il pellet risultante è stato nuovamente sospeso in DMEM integrato con 10% (v/v) FCS e 1% (v/v) penicillina e streptomicina, cioè terreno di coltura standard e passato attraverso un filtro cellulare da 100 µm (BD Biosciences, Berkshire, UK). Il filtrato è stato nuovamente centrifugato a 600 g per 10 minuti e le cellule pellettate sono state nuovamente sospese in un mezzo di coltura standard da 5 ml e passate attraverso un filtro di cellule da 40 µm. La sospensione cellulare risultante è stata quindi trattata con tampone di lisi eritrocitaria (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) per 10 minuti a temperatura ambiente. Per ciascuna preparazione AT, le MSC sono state isolate dalle cellule mononucleate presenti dopo la lisi degli eritrociti attraverso la loro maggiore adesione alla coltura tissutale plastic8 o mediante magnetic associated cell sorting (MACS) per l’immunopositività14 di CD271. Queste cellule sono state coltivate espanse in terreno di coltura standard in atmosfera umidificata a 37 °C con passaggio di routine per tripsinizzazione alla confluenza dell ‘ 80%. PA MSCs e CD271 + MSCs a passaggi II-III sono stati utilizzati per tutte le successive sperimentazioni. La citometria a flusso è stata utilizzata per valutare l’arricchimento per le cellule CD271+ (utilizzando la tecnologia MACS), dove le cellule appena isolate sono state conservate a -80 °C durante la notte dopo l’isolamento, quindi scongelate e immediatamente immunostenute per CD271; per tutti i campioni, >il 90% delle cellule era immunopositivo CD271 in questo momento (dati non mostrati).

Protocolli di differenziazione in vitro

La capacità di differenziazione di PA e CD271+ MSC di formare osteociti, condrociti e adipociti è stata valutata come descritto in precedenza8,45. In breve, per l’osteogenesi, le colture monostrato di MSC sono state trattate con 10 nM di desametasone, 50 ng / ml di acido ascorbico e 1 mm di beta glicerofosfato (rispetto ai controlli carrier) ogni 2-3 giorni per un periodo di 4 settimane, dopo di che le colture sono state raccolte mediante fissazione e colorate per l’attività della fosfatasi alcalina come segue: Nel frattempo, la soluzione di colorazione è stata preparata posizionando 25 mg di naftolo-fosfato (naftolo AS-MX fosfato: Sigma) in 0,5 ml di dimetil formammide. Questa soluzione è stata miscelata con 50 ml di tampone Tris-HCl da 0,2 M contenente 50 mg di fast red TR (Sigma). Dopo aver mescolato bene, la soluzione finale è stata filtrata usando la carta da filtro n. 1 di Whatman (Whatman). La soluzione fissativa è stata quindi rimossa e le cellule sono state lavate con PBS, quindi 1 ml della soluzione di colorazione è stato aggiunto a ciascun pozzetto per 1 ora. Infine, la macchia è stata rimossa e le immagini digitalizzate sono state catturate con un microscopio invertito. La differenziazione lungo il lignaggio osteogenico è stata ulteriormente valutata aumentando la quantità di attività della fosfatasi alcalina nelle cellule differenziate rispetto alle cellule indifferenziate utilizzando un kit disponibile in commercio (Biovision, USA) e seguendo il protocollo del produttore; in breve, le cellule sono state omogeneizzate nel tampone del test. Le cellule omogeneizzate sono state quindi centrifugate per rimuovere il materiale insolubile a 13.000 g per 3 minuti. Quindi 80 µl di ciascuno dei campioni sono stati caricati in pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti. Quindi sono stati aggiunti 50 µl di 5 mm di soluzione pNPP a ciascun pozzetto del campione. Dopo una fase di miscelazione pipettando su e giù, i pozzetti sono stati incubati a 25 °C per 60 minuti. Una curva standard è stata generata diluendo 40 µl di 5 mm di pNPP in 160 µl di tampone di dosaggio per generare uno standard pNPP da 1 mm. Quindi 0, 4, 6, 12, 16 e 20 µl di questa soluzione standard sono stati caricati in una piastra a 96 pozzetti per generare standard pNPP 0-20 nmol/ml che possono essere misurati mediante spettrofotometria. Per la condrogenesi, i pellet cellulari sono stati preparati in DMEM / alto glucosio (Sigma) integrato con desametasone 100 nM (DEX), 37.5 µg/ml ascorbato-2-fosfato, 1% (vol/vol) insulina, transferrina e selenio (ITS-X100; Sigma) e 10 ng/ml fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londra, Regno Unito) e penicillina e streptomicina. Le colture di controllo sono state trattate con DMEM / mezzi ad alto glucosio con soli vettori, cioè metanolo, acqua sterile e BSA a diluizioni appropriate. Al giorno 28, la differenziazione condrogenica è stata esaminata istologicamente fissando i pellet in formalina tamponata neutra al 10%, quindi incorporando in paraffina e tagliando sezioni di tessuto, che sono state colorate con blu di toluidina (Sigma) come marker della sintesi di proteoglicani8. Inoltre, il livello di glicosaminoglicano secreto nel mezzo di differenziazione nelle ultime 24 ore di coltura prima della raccolta al giorno 28 è stato misurato utilizzando il test DMMB. Il protocollo di dosaggio DMMB è stato adattato dal metodo di Farndale et al., 1986 come segue46: i)la soluzione colorante DMMB è stata preparata aggiungendo 3.04 g di glicina, 2.37 g di NaCl e 16 mg di 1,9 DMMB per 1 litro di acqua deionizzata; (ii) il pH è stato regolato a 3.0 con acido cloridrico e la soluzione colorante era conservato in una bottiglia marrone; (iii) 50 µl di aliquote di cultura medio raccolto dalla cella di serie ponteggi al giorno 28 sono aggiunte, in triplice copia, di una piastra da 96 pozzetti; (iv) 200 µl di DMMB soluzione colorante è stato aggiunto al mezzo di coltura e l’assorbanza è stata valutata a 540 nm immediatamente. Il solfato di condroitina (CS) della cartilagine di squalo (Sigma) è stato utilizzato per fornire una curva standard di assorbanza (0-40 µg/ml, CS) da cui è stato calcolato il contenuto di GAG nei campioni di terreno di coltura. I livelli di assorbanza per il contenuto di GAG nei campioni di terreno di coltura sono stati normalizzati per tenere conto dell’assorbanza di fondo risultante dalla presenza di rosso fenolo all’interno del mezzo sciogliendo gli standard nel mezzo DMEM. Per l’adipogenesi, le colture MSC sono state mantenute in terreni di coltura contenenti 1 µM DEX, 0.5 mm 3-isobutil-metilxantina (Sigma), 1% insulina, transferrina e selenio (premiscela ITS-X 100; PAA) e 100 µM indometacina (Sigma), per 28 giorni a 37 °C e 5% CO2, come precedentemente descritto47. Le celle di controllo sono state mantenute in supporti completi con vettori. La differenziazione è stata esaminata utilizzando la colorazione di olio rosso O di goccioline lipidiche. Le cellule sono state fissate in formalina tampone neutra al 10% per 1 ora dopo di che è stata aggiunta la soluzione di colorazione. L’accumulo relativo di olio rosso O è stato misurato dopo il trattamento con isopropanolo al 100% per 15 minuti e leggendo l’assorbanza del surnatante a 540 nm utilizzando uno spettrofotometro.

MSC transplantation into a femoral osteocondral defect model

Following institutional ethical review and approval (The Institutional Animal Care and Use Committees of Fukui University, Department of Orthopaedics and Rehabilitation Medicine: Approval Number 25-053), female athymic nude rats (F344 / N Jcl rnu / rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Giappone) di età compresa tra 6-10 settimane e peso 150-170 grammi sono stati assegnati in modo casuale nei seguenti gruppi: (io) PA MSCs (n = 6 animali); (ii) CD271+ MSCs (n = 6 animali); (iii) un gruppo di controllo di Alpha Chondro scudo impalcatura da solo (senza cellule, n = 3 animali). Questi numeri di animali per gruppo sono stati utilizzati in precedenza nello stesso istituto per dimostrare differenze significative tra i gruppi di trattamento al livello del 5% 48. I ratti sono stati anestetizzati dall’esposizione al 3% di isoflurano nel gas O2 e mantenuti all ‘ 1,5% di isoflurano nel gas O2 durante l’intervento chirurgico. Dopo aver sterilizzato le ginocchia con etanolo al 70%, è stata praticata un’incisione cutanea parapatellare mediale seguita da sezionare attraverso il muscolo e quindi esporre l’articolazione del ginocchio mediante dislocazione laterale della rotula. Difetti osteocondrali bilaterali di diametro 2 mm e profondità 1 mm sono stati creati nella scanalatura rotulea del femore di ciascun animale utilizzando un trapano chirurgico di diametro 2 mm. Alpha Chondro Shield è stato utilizzato come vettore cellulare/scaffold per fornire 5 × 104 MSC PA o CD271+ MSC contro nessuna cella (come controlli). Prima del trapianto, le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione e seminate in un volume di 10 µl di terreno di coltura standard su dischi di 2 mm di diametro di Alpha Chondro Shield, quindi incubate in atmosfera umidificata a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti per promuovere l’adesione cellulare e l’incorporazione nello scaffold. Le impalcature seminate e di controllo sono state trapiantate nei difetti e fissate in posizione con colla di fibrina, che è stata lasciata impostare per circa 10-20 secondi (Fig. 6). La rotula è stata trasferita e il tessuto connettivo e la pelle sono stati suturati con suture di nylon. Gli animali sono stati autorizzati a muoversi liberamente dopo il recupero e nutriti con una dieta di mantenimento standard e acqua ad libinum. A 3 settimane dopo il trapianto, gli animali sono stati sacrificati da un sovradosaggio del 3% di isoflurano per esaminare l’entità della riparazione della ferita macroscopicamente e istologicamente.