az emberi és állatkísérletekben alkalmazott összes módszert a vonatkozó intézményi irányelveknek és előírásoknak megfelelően végezték.

a műanyaghoz tapadó MSC-k és CD271 immunopozitív MSC-k izolálása és tenyésztése zsírszövetből

a Nemzeti Egészségügyi Szolgálat (NHS) Egészségügyi Kutatási hatóságának etikai jóváhagyását (LREC szám: 12/EE/0136) és az összes donor tájékoztatáson alapuló beleegyezését követően a PA MSC-ket és CD271+ MSC-ket izolálták az AT-ből, amelyet sebészeti hulladékként gyűjtöttek be. Az AT-T daráltuk és 0-val kezeltük.3 E/ml kollagenázt (Sigma, Dorset, UK) két órán át 37 Ca-n, ezt követően Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM) adtak hozzá 20% (v/v) magzati borjúszérummal (FCS) és 1% (v/v) penicillinnel és sztreptomicinnel (mind PAA, Yeovil, Somerset, UK), és az emésztett készítményt 600 g-on centrifugálták 10 percig. A kapott pelletet DMEM-ben újra szuszpendáltuk 10% (v/v) FCS-vel és 1% (v/v) penicillinnel és sztreptomicinnel, azaz standard táptalajjal kiegészítve, és 100 db (BD Biosciences, Berkshire, Egyesült Királyság) sejtszűrőn vezetjük át. A szűrletet 600 g-on 10 percen át újra centrifugáltuk, majd a pelletált sejteket 5 ml standard táptalajban újra szuszpendáltuk, és egy 40 MHz-es sejtszűrőn átvezetettük. A kapott sejtszuszpenziót ezután eritrocita lízis pufferrel (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) kezeltük 10 percig szobahőmérsékleten. Mindegyik AT készítmény esetében az MSC-ket izoláltuk az eritrocita lízis után jelen lévő mononukleált sejtekből a szövettenyészethez való fokozott tapadásuk révén műanyag8 vagy mágneses asszociált sejtválogatás (MACS) a CD271 immunopozitivitáshoz 14. Ezeket a sejteket standard táptalajban párásított atmoszférában tenyésztettük 37-nél 60% – os összefolyásnál a tripszinizáció rutinszerű áthaladásával. PA MSC-ket és CD271+ MSC-ket használtak a II-III. Áramlási citometriát használtunk a CD271 + sejtek dúsulásának felmérésére (MACS technológia alkalmazásával), ahol a frissen izolált sejteket az izolálás után egy éjszakán át -80 ~ C-on tároltuk, majd felolvasztottuk és azonnal IMMUNSZINKRONIZÁLTUK a CD271-re; az összes minta esetében >a sejtek 90% – a CD271 immunopozitív volt ebben az időpontban (az adatok nem szerepelnek).

In vitro differenciálódási protokollok

a PA és a CD271+ MSC-k osteocyták, chondrocyták és adipocyták képződésére vonatkozó differenciálódási képességét az előzőek szerint értékelték8,45. Röviden, Az osteogenesis céljából az MSC-k egyrétegű tenyészeteit 10 nM dexametazonnal, 50 ng/ml aszkorbinsavval és 1 mM-es béta-glicerofoszfáttal (a hordozó kontrollokkal szemben) kezeltük 2-3 naponként 4 héten keresztül, ezt követően a tenyészeteket fixálással gyűjtöttük össze, és az alkalikus foszfatáz aktivitás szempontjából festettük az alábbiak szerint: a sejteket 10% semleges puffer formalinnal rögzítettük 10 percig. Eközben festőoldatot készítettünk úgy, hogy 25 mg naftol-foszfátot (Naftol AS-MX foszfát: Sigma) 0,5 ml dimetil-formamidba helyeztünk. Ezt az oldatot 50 ml 0,2 M-es Tris-HCl pufferrel kevertük, amely 50 mg fast red TR-t (Sigma) tartalmazott. Jól összekeverés után a végső oldatot Whatman No.1 szűrőpapírral (Whatman) szűrjük. A fixáló oldatot ezután eltávolítottuk, és a sejteket PBS-sel mostuk, majd 1 ml festőoldatot adtunk minden lyukba 1 órán át. végül a foltot eltávolítottuk, és fordított mikroszkóppal digitalizált képeket készítettünk. Az oszteogén vonal mentén történő differenciálódást tovább értékelték a differenciált sejtekben az alkalikus foszfatáz aktivitás megnövekedett mennyiségével a differenciálatlan sejtekhez képest egy kereskedelmi forgalomban kapható kit (Biovision, USA) és a gyártó protokolljának betartásával; röviden, a sejteket homogenizáltuk a vizsgálati pufferben. A homogenizált sejteket ezután centrifugáljuk, hogy az oldhatatlan anyagot 13 000 g-on 3 percig eltávolítsuk. Ezután a minták mindegyikéből 80 ~ l-t töltöttünk egy 96 kútlemez külön kútjába. Ezután 50 db 5 mM-es pnpp oldatot adtunk minden mintakúthoz. A Fel-Le pipettázással végzett keverési lépést követően a kutakat 25cc-n inkubáltuk 60 percig. A standard görbét úgy állítottuk elő, hogy 40 6 mm-es pnpp-t hígítottunk 160 ml vizsgálati pufferbe, hogy 1 mM-es pNPP-szabványt hozzunk létre. Ezután ebből a standard oldatból 0, 4, 6, 12, 16 és 20 6L-t töltöttünk egy 96 kútlemezbe, hogy spektrofotometriával mérhető 0-20 nmol/ml pNPP szabványt hozzunk létre. A kondrogenezishez SEJTPELLETEKET állítottunk elő DMEM / magas glükózban (Sigma) 100 nM-rel kiegészítve dexametazon (DEX), 37.5 db/ml aszkorbát-2-foszfát, 1% (térfogat/térfogat) inzulin, transzferrin és szelén (ITS-X100; Sigma) és 10 ng/ml transzformáló növekedési faktor-61 (TGF-61) (PeproTech, London, Egyesült Királyság), valamint penicillin és sztreptomicin. A kontroll tenyészeteket DMEM / magas glükóz tartalmú táptalajokkal kezeltük, csak hordozókkal, azaz metanollal, steril vízzel és BSA-val megfelelő hígítás mellett. A 28. napon a kondrogén differenciálódást szövettanilag megvizsgáltuk úgy, hogy a pelleteket 10% – os semleges pufferolt formalinba rögzítettük, majd paraffinba és vágószövetekbe ágyaztuk, amelyeket toluidinkék (Sigma) festettünk a proteoglikán szintetizáció8 markereként. Ezenkívül a differenciáló közegbe szekretált glikozaminoglikán szintjét a betakarítás előtti utolsó 24 órában a 28. napon a DMMB assay segítségével mértük. A DMMB vizsgálati protokollt Farndale et al., 1986 az alábbiak szerint46: (i) a DMMB festékoldatot 3 hozzáadásával állítottuk elő.04 g glicint, 2,37 g NaCl-t és 16 mg 1,9 DMMB-1 liter ionmentesített vizet; ii.a pH-t sósavval 3,0-ra állítottuk be, és a festékoldatot barna üvegben tároltuk; iii. a sejtmagos állványzatokból a 28. napon betakarított táptalajt három példányban 96 kútlemezhez adtuk; iv. 200 ml DMMB festékoldatot adtunk a táptalajhoz, és az abszorbanciát a 28. napon a SEJTMAGOS állványzatokból nyert táptalajon mértük 540 nm azonnal. A cápaporcból (Sigma) származó kondroitin-szulfátot (CS) használtuk egy standard abszorbanciagörbe (0-40 6G/ml, CS) előállításához, amelyből kiszámítottuk a táptalaj mintáinak GAG-tartalmát. A táptalaj mintáiban a GAG-tartalom abszorbanciaszintjét normalizáltuk, hogy figyelembe vegyük a fenolvörös jelenlétéből eredő háttér-abszorbanciát a táptalajban a standardok DMEM táptalajban történő feloldásával. Az adipogenezishez, az MSC kultúrákat olyan táptalajokban tartottuk fenn, amelyek tartalmazzák 1 kb, 0.5 mM-es 3-izobutil-metil-xantin (Sigma), 1% inzulin, transzferrin és szelén (ITS-X 100 előkeverék; PAA) és 100 6 mm indometacin (Sigma), 28 napig 37 6CC és 5% CO2 mellett, a korábban leírtaknak47. A kontrollsejteket teljes közegben tartottuk fenn hordozókkal. A differenciálódást lipidcseppek Olajvörös o festésével vizsgáltuk. A sejteket 10% – os semleges puffer formalinban rögzítettük 1 órán keresztül, majd a festőoldatot adtuk hozzá. A relatív Olajvörös o felhalmozódást 100% – os izopropanollal 15 percen át végzett kezelés után mértük, majd spektrofotométerrel leolvastuk a felülúszó abszorbanciáját 540 nm-en.

MSC transzplantáció femoralis osteochondralis defektus modellbe

intézményi etikai felülvizsgálatot és jóváhagyást követően (a Fukui Egyetem Ortopédiai és Rehabilitációs Orvostudományi Tanszékének intézményi állatgondozási és Felhasználási bizottságai: 25-053 Jóváhagyási szám), női atimikus meztelen patkányok (F344/N Jcl rnu/rnu, CLEA Japan, Inc. Tokió, Japán) 6-10 hetes korúak és 150-170 gramm súlyúak voltak véletlenszerűen a következő csoportokba sorolva: (i) PA MSC-k (n = 6 állat); (ii) CD271+ MSC-k (n = 6 állat); (iii) csak az Alfa Chondro Shield állványzat kontrollcsoportja (sejtek nélkül, n = 3 állat). Ezeket a csoportonkénti állatszámokat korábban ugyanabban az intézetben használták a szignifikáns különbségek kimutatására a kezelési csoportok között az 5% – os szinten48. A patkányokat 3% O2-gázban lévő izoflurán-expozícióval érzéstelenítették, és a műtét során 1,5% O2-gázban lévő izofluránon tartották. A térd 70% – os etanollal történő sterilizálása után mediális parapatelláris bőrmetszést végeztünk, majd az izomon keresztül boncoltuk, majd a térdízületet a patella oldalirányú diszlokációjával tártuk fel. 2 mm átmérőjű és 1 mm mélységű kétoldali osteochondralis defektusokat hoztak létre az egyes állatok combcsontjának patelláris horonyában egy 2 mm átmérőjű sebészeti fúróval. Alpha Chondro pajzsot használtunk sejthordozóként/állványként 5 604 pa MSCs vagy CD271+ MSCs szállítására, szemben a No sejtekkel (kontrollként). A transzplantáció előtt a sejteket tripszinizálással gyűjtöttük be, és 10 ml térfogatú standard táptalajban 2 mm átmérőjű Alpha Chondro Shield lemezekre vetettük, majd párásított légkörben inkubáltuk 37 Kb C és 5% CO2 hőmérsékleten 30 percig, hogy elősegítsük a sejtek tapadását és beépülését az állványba. A sejtmagos és kontrollállványokat a hibákba ültettük át, és fibrin ragasztóval rögzítettük a helyükre, amelyet körülbelül 10-20 másodpercig hagytunk megkötni (ábra. 6). A térdkalácsot áthelyezték, a kötőszövetet és a bőrt nejlonvarratokkal varrták össze. Az állatok a felépülést követően szabadon mozoghattak, és a szokásos fenntartó étrendet és vizet ad libinum. A transzplantációt követő 3. héten az állatokat 3% izoflurán túladagolásával áldozták fel, hogy makroszkóposan és szövettanilag megvizsgálják a sebjavítás mértékét.