Le compartiment myéloïde du système immunitaire inné se compose d’un certain nombre de types cellulaires dont les fonctions comprennent la clairance des cellules endommagées et apoptotiques, la présentation de l’antigène, l’immunosuppression et la protection de l’hôte contre les microorganismes étrangers.

Les monocytes représentent un sous-ensemble hautement plastique de cellules qui composent le système immunitaire inné. Ces cellules sont capables de traverser le système vasculaire et, lorsqu’elles sont exposées à des cytokines spécifiques, subissent une différenciation en différents types cellulaires. Les monocytes circulants sont classés comme non classiques ou classiques et peuvent être distingués par leur modèle d’expression des récepteurs de surface cellulaire. Les monocytes classiques dans la circulation présentent CD14+++ Hi/CD16-/lo et sont surtout présents aux endroits d’infection ou de maladie (1,2).

Les monocytes humains non classiques dans la circulation affichent l’expression de surface CD16+++Hi/CD14+/lo (1). Après activation, les monocytes subissent plusieurs modifications fonctionnelles morphologiques et biochimiques, entraînant une différenciation des monocytes en nouveaux types cellulaires tels que les macrophages (3).

Dans un paradigme appelé activation classique, les monocytes humains présentent une plasticité phénotypique qui peut être initiée par une exposition à l’interféron—γ cytokine favorisant la réponse Th1 (IFN-γ) ou au facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), ainsi qu’au lipopolysaccharide d’endotoxine (LPS) (4,5). Ce mécanisme d’activation classique génère des macrophages M1, qui fonctionnent pour produire des médiateurs pro-inflammatoires qui assurent une protection de l’hôte contre les bactéries et les virus (6). Les monocytes humains peuvent également être différenciés des macrophages M2 par exposition à des cytokines favorisant la réponse Th2 telles que l’interleukine-10 (IL-10) et le facteur de croissance transformant-β (TGF-β) (4,7). Les macrophages M2 expriment des niveaux élevés de CD206 (récepteur du mannose) et de CD163, produisent de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires et favorisent la cicatrisation des plaies et le remodelage de la matrice.

Les cellules dendritiques (CD) sont un autre ensemble de cellules immunitaires dérivées de monocytes dont la fonction est de présenter des antigènes aux lymphocytes T pour initier une réponse immunitaire adaptative basée sur les lymphocytes T. Les CD peuvent être classés en grande partie en trois sous-groupes: classiques (cDCs), plasmacytoïdes (pDCs) et dérivés de monocytes (moDCs). Les CDC se trouvent généralement dans le tissu lymphoïde, la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse. Les PDC ressemblent à des plasmocytes et se trouvent généralement dans la circulation sanguine (8). Les monocytes peuvent se différencier en DCs, souvent appelés DCs dérivés de monocytes (moDCs), après exposition au facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF) et à l’IL-4 (9,10). Il a été rapporté que les MODC expriment les marqueurs de surface cellulaire CD80, CD83, CD86 et CD1a in vitro (11-13). Bien que les MODC diffèrent des macrophages par la forme et la fonction des cellules, ils partagent l’expression de plusieurs antigènes de surface cellulaire, y compris CD11c, CD206 et CD1a (14).

Plusieurs groupes ont signalé une différenciation réussie des monocytes CD14+ humains en macrophages; cependant, beaucoup de ces protocoles publiés sont différents. Une variante courante parmi ces méthodes est l’inclusion (15) ou l’omission (16) de l’IL-6. Une autre différence entre les protocoles est le moment du traitement. Ce manque de cohérence entre les protocoles est problématique.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons examiné et comparé l’inclusion et l’omission de l’IL-6 dans le traitement par cytokines utilisé dans les méthodologies courantes de différenciation des monocytes humains. Nous avons constaté qu’en l’absence d’IL-6, ces stratégies produisent des cellules avec un faible degré d’homogénéité, ce qui peut donner des résultats expérimentaux ambigus. Deuxièmement, pour mieux résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle stratégie in vitro progressive avec l’inclusion de l’IL-6. Nous avons constaté que cette stratégie améliorait considérablement l’homogénéité cellulaire des macrophages M1 et M2 ainsi que des MODC différenciés des monocytes CD14+ humains. Cette amélioration de la méthodologie fournira aux chercheurs de meilleurs modèles pour étudier le système immunitaire et les états pathologiques.

Matériaux et méthodes

Préparations cellulaires

Des couches de buffy ont été prélevées sur le sang total de cinq donneurs masculins sains ou plus qui avaient été mis en commun. Des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été préparées à partir de couches de buffy par centrifugation par gradient de densité Ficoll-Paque (1,077 g/ mL de densité) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) à 400 × g à 18 ° C pendant 35 min pour séparer les constituants sanguins. Les cellules ont été lavées plusieurs fois à l’aide de 1 × PBS et comptées à l’aide d’un compteur de cellules Nexcelom Cellometer Auto T4 plus (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Une fois comptés, les monocytes CD14+ ont été isolés des PBMC par marquage magnétique à l’aide de microbilles conjuguées MAB CD14 (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) suivie d’une séparation à l’aide de colonnes magnétiques (130-042-401 et 130-042-302; Miltenyl Biotec) selon les instructions du fabricant, à une exception près: lors de la collecte des cellules CD14 + de la colonne magnétique, les cellules ont été rincées initialement à l’aide d’un tampon de 5 mL reposant uniquement sur la gravité (sans utilisation du piston fourni). Après le rinçage initial de 5 ml, un tampon supplémentaire de 5 mL a été ajouté et rincé doucement à l’aide du piston fourni.

Culture cellulaire

Les monocytes CD14+ humains ont été ensemencés à une densité cellulaire de 2,0-3.0 × 105 cellules / mL en milieu RPMI 1640 avec 2 mm / L de L-glutamine (Life Technologies, Frederick, MD) additionnée de 10% de FBS inactivé à la chaleur (Sigma, Carlsbad, CA), de 100 U / mL de pénicilline (Life Technologies) et de 100 mg / mL de streptomycine (Life Technologies) à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2. Pour différencier les cellules en macrophages M1, les cytokines utilisées étaient le GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), l’IFN-γ (20 ng/mL), l’IL-6 (20 ng/mL) et l’endotoxine LPS (20 ng/mL). Pour la différenciation des macrophages M2, les cytokines utilisées étaient le facteur stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), l’IL-4, l’IL-6 et l’IL-13 à une concentration de 20 ng/mL (PeproTech). Les MODC ont été générés par l’ajout de GM-CSF (100 ng/ mL) et d’IL-4 (20 ng/mL). Le calendrier de chaque stratégie est décrit plus en détail à la figure 1.

Cytométrie en flux

Des macrophages et des DCs polarisés ont été cultivés pendant 9 jours sur des boîtes de 10 cm2 (BD Falcon, Billerica, MA). Le jour 9, des milieux et des cellules non adhérentes ont été collectés; les cellules adhérentes ont été lavées à l’aide de 1 × PBS, éliminées à l’aide d’un tampon de dissociation cellulaire (Life Technologies), puis ajoutées aux milieux collectés / cellules non adhérentes à laver. Les cellules en suspension ont été centrifugées et lavées deux fois (1 × PBS, 0,5% de BSA, EDTA de 2 mM), comptées, puis incubées avec des anticorps primaires conjugués aux fluorophores contre CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadhérine (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), et CD64 (FITC) dans l’obscurité pendant 45 min à 4°C. La fluorescence a été détectée par un trieur de cellules S3TM (Bio-Rad, Hercules, CA).

Test d’endocytose

Des macrophages humains polarisés ont été plaqués dans des lames de verre à chambre à 4 puits (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) à une densité de 3.0 × 105 cellules / mL au jour 7 et ont continué à être cultivées avec les cytokines appropriées pendant les 2 jours restants. Le bisimide de pérylène (PBI-12-Man) (17) était un cadeau aimable de Ke-Rang Wang à l’Université du Hebei. Les cellules ont été cultivées avec 10 µg/mL de PBI-12-Man pendant 30 min à 37°C, puis lavées avec 1× PBS. Les cellules ont été fixées à l’aide d’éthanol à 70% et montées avec du DAPI (P36962; Life Technologies). Pour visualiser l’endocytose de l’homme PBI-12, des lames ont été excitées et émises à 585 nm. Des images en fluorescence rouge ont été quantifiées à l’aide du logiciel de balayage de diapositives Metafer (MetaSystems, Boston, MA). Les tests statistiques ont été réalisés à l’aide du logiciel MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Des tests de somme de rang ont été effectués pour vérifier la signification statistique univariée entre les échantillons.

Immunofluorescence

Les macrophages ont été différenciés à l’aide des méthodes décrites précédemment pendant 7 jours, puis transférés sur des lames de chambre en verre à 4 puits Nunc Lab-Tek II avec les cytokines appropriées. Les cellules ont été laissées à croître pendant les 7 jours suivants; 14 jours après le placage initial, les cellules ont été fixées à l’aide d’éthanol à 70% et montées à l’aide d’un agent de montage anti-décoloration au diamant Prolong avec du DAPI. Les cellules ont été visualisées en microscopie à contraste de phase et à fluorescence sur l’EVOS FL Auto (Life Technologies).

Résultats et discussion

Stratégies et conditions de différenciation des monocytes CD14+humains

Nous avons commencé par évaluer quelles stratégies étaient les plus efficaces pour produire des populations homogènes de macrophages M1 et M2 humains ainsi que des MODC. Les monocytes CD14+ humains ont été isolés et ensemencés sur des plaques de culture tissulaire pour être différenciés en macrophages ou en MODC in vitro. Nous avons ensuite testé trois conditions de traitement spécifiques pour déterminer la méthode qui a donné les populations de macrophages et de McDo les plus uniformes. Pour la première condition, nous avons cultivé des cellules avec l’ajout uniquement de GM-CSF ou de M-CSF pendant 9 jours (Figure 1). Cette condition est appelée  » seulement  » (figure 1). La deuxième stratégie de traitement consistait à exposer continuellement les cellules au milieu de cytokines applicable au jour 0, à reconstituer les milieux, les cytokines et les LPS au jour 5 et à analyser les cellules au jour 9. Cette condition est dite  » continue  » (Figure 1). La troisième stratégie consistait à stimuler les monocytes CD14+ avec du GM-CSF ou du M-CSF pendant 5 jours, puis à ajouter des milieux frais contenant des LPS pour les macrophages M1 humains et toutes les cytokines applicables pour un groupe de traitement donné (GM-CSF, IFN-γ et IL-6 pour les macrophages M1 ou M-CSF, IL-4, IL-13 et IL-6 pour les macrophages M2). Cette stratégie de traitement a été qualifiée de  » progressive  » (figure 1). Le traitement des monocytes CD14+ avec 100 ng / mL de GM-CSF et d’IL-4 pendant 5 jours et le remplacement des milieux et de toutes les cytokines au jour 5 ont généré des MODC. Les MODC ont ensuite été stimulés avec de l’IL-6 et du LPS pendant 24 h avant l’analyse (jour 8) pour favoriser la maturation et l’activation du DC. Cette méthode de culture a été qualifiée de  » stimulée  » (Figure 1). Les MODC qui n’ont jamais reçu d’exposition à l’IL-6 et au LPS ont été qualifiés de  » non stimulés  » (figure 1). Après 9 jours de culture dans les conditions spécifiques décrites ci-dessus, l’expression du récepteur de surface cellulaire et la fonctionnalité cellulaire ont été analysées.

L’exposition à l’IL-6 augmente l’efficacité de la polarisation de M2 in vitro

Des études antérieures ont montré que l’exposition des macrophages à la cytokine IL-6 non seulement biaisait la différenciation des monocytes d’une cellule dendritique à un phénotype de macrophage, mais que l’exposition à l’IL-6 augmente également le profil d’expression de l’ARNm associé aux macrophages M2 (15,18). Pour confirmer ces résultats et tester l’effet de l’IL-6 sur la polarisation M1 et M2, des monocytes CD14+ humains dans les conditions de culture continue et progressive ont été traités avec ou sans IL-6. L’examen de l’expression du marqueur de surface des macrophages M2 dans les cellules différenciées de M1 n’a montré aucun changement significatif lors de la culture avec de l’IL-6 (Figure 2), suggérant que le traitement par IL-6 ne shunt pas les macrophages polarisés M1 vers un phénotype M2.

Inversement, l’analyse des groupes de culture de macrophages M2 continus et en phase a révélé que le traitement par IL-6 augmentait l’expression des marqueurs de surface des macrophages M2. Dans les populations de macrophages de M2, l’expression de CD206 et de CD36 est restée élevée et n’a pas été modifiée lorsqu’elle était exposée à l’IL-6 (Figure 2, A et B). Le CD163 et l’E-cadhérine ont cependant montré des augmentations significatives des niveaux d’expression de surface et de l’homogénéité de la population lorsqu’ils étaient traités avec de l’IL-6 (Figure 2, C et D). Ceci est démontré par une diminution des pics de CD163 et de cadhérine à faible expression (flèches rouges sur la figure 2, C et D) et le déplacement qui en résulte vers une population à expression homogène et élevée.

L’IL-6 est souvent utilisé pour induire la maturation du moDC (18,19). Afin de déterminer si le traitement par IL-6 pouvait entraîner des MODC indésirables au sein des populations polarisées par les macrophages, l’expression du marqueur de surface DC mature (CD83) a été examinée. L’analyse cytométrique en flux a démontré qu’aucune des conditions de culture M1 ou M2 ne favorisait une augmentation significative de l’expression de CD83 (figure 2E). Cela suggère qu’il n’y avait pas de contamination par le moDC au sein de ces populations de macrophages ou que les MODC contaminants étaient insensibles à l’IL-6.

La polarisation progressive conduit à une expression accrue des marqueurs canoniques de surface cellulaire M1, M2 et moDC

Pour confirmer que les monocytes CD14+ humains étaient entièrement différenciés en macrophages ou en MODC au jour 9, la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser les marqueurs de surface cellulaire et évaluer les différences morphologiques (Figure 3, A-C). Les monocytes CD14+ humains ont été différenciés (figure 1) pour évaluer quelle stratégie donnerait une expression élevée des marqueurs de surface appropriés de type cellulaire. Un panel de marqueurs de surface cellulaire a été testé pour chacun des types de cellules. Notre panneau de marqueurs de surface cellulaire M1 était composé des marqueurs canoniques CD86 et CD80 (Figure 3, A-C). Pour le panneau de macrophages M2, nous avons utilisé CD206, CD163, CD124 (récepteur IL-4-α), E-cadhérine et CD36 (récepteur piégeur de classe B) (Figure 3, A-C). Pour les MODC, CD83, CD86 et CD1a ont été utilisés. Les niveaux d’expression de surface de tous les marqueurs testés ont été déterminés pour tous les types de cellules (Figure supplémentaire S1). L’intensité médiane de fluorescence (IMF) a été calculée et représentée par un changement de pli par rapport au témoin non coloré correspondant (voir les tableaux de la figure 3).

Il est intéressant de noter que l’analyse des marqueurs de surface cellulaire M2, CD36 et IL-4Ra, dans les macrophages polarisés uniquement pour le GM-CSF M1 a révélé des augmentations spectaculaires (Figure 3A). En comparant les cellules traitées uniquement avec le GM-CSF à tous les groupes de traitement M1, le groupe traité uniquement avec le GM-CSF présentait une expression nettement plus élevée du CD36. Ces cellules contenant uniquement du GM-CSF ont également exprimé de faibles niveaux des marqueurs CD86 et CD80 associés à M1. De même, la condition continue a donné des cellules non seulement faibles en CD86 et CD80, mais également élevées en expression CD36 et IL-4Ra. Inversement, lorsque les monocytes CD14+ humains ont été différenciés dans la condition de phase M1, CD86 et CD80 ont été sensiblement régulés à la hausse, tandis que l’expression de CD36 et d’IL-4Ra est restée faible. Une analyse cytométrique en flux plus poussée de l’expression des marqueurs de surface cellulaire a révélé que les macrophages M1 avaient une expression plus faible de CD206, CD36 et CD163 par rapport aux macrophages M2 sous exposition progressive et continue (Figures supplémentaires S1 et S4). De plus, ces conditions de culture variées génèrent des cellules aux caractéristiques morphologiques et à la structure distinctes (figure 3A). Alors que les cellules traitées uniquement par le GM-CSF semblent plus grandes, les données de diffusion vers l’avant (FSC) ont révélé des différences minimes de taille entre les groupes (figures supplémentaires S2 et S3). La comparaison de la complexité interne (SSC) entre les conditions de traitement a révélé une augmentation de la granularité dans les groupes GM-CSF et phasés (figure supplémentaire S2). Ensemble, ces résultats montrent que le GM-CSF seul et le traitement continu produisent des cellules qui expriment de faibles niveaux de marqueurs M1 et des niveaux élevés de certains marqueurs M2, en plus de présenter des changements morphologiques.

Les conditions de culture des macrophages M2 ont donné des résultats légèrement plus ambigus que ceux trouvés avec les conditions de culture des macrophages M1 (figure 3B). Par rapport au groupe M-CSF uniquement, les groupes échelonnés et continus ont montré des niveaux d’expression accrus de CD206. À l’inverse, les niveaux de surface d’IL-4Ra étaient nettement plus élevés dans des conditions de M-CSF uniquement, par rapport aux niveaux continus et phasés. L’expression de l’E-cadhérine est restée uniforme d’un groupe à l’autre, tandis que le CD163 était significativement plus élevé dans les groupes M-CSF uniquement et par étapes. Une observation à noter est que le groupe d’exposition continue était constamment beaucoup moins homogène en ce qui concerne l’expression des marqueurs de surface cellulaire. Ceci est illustré par la distribution bimodale et la grande variance des niveaux d’expression trouvés sur l’histogramme. De plus, des différences morphologiques spectaculaires peuvent être observées entre les groupes de traitement. Sur la base des images à contraste de phase, le groupe M-CSF uniquement a produit des cellules qui semblent plus petites et très granulaires (figure 3B). L’analyse cytométrique en flux démontre que ces cellules ont une taille similaire (FSC), cependant, il y a une augmentation de la granularité cellulaire dans les conditions de traitement progressif et continu (Figure supplémentaire S2). Enfin, la privation de glutamine a modifié la polarisation de M2, démontrant que les produits métaboliques sont nécessaires dans le cadre de cette stratégie (Figure supplémentaire S5). Au total, ces données suggèrent que les conditions de phase donnent la plus grande efficacité pour la polarisation des macrophages M2.

Nous avons ensuite examiné l’expression de marqueurs de surface de MODC non stimulés ou stimulés par l’IL-6 et le LPS 24 h avant l’analyse cytométrique en flux. La stimulation par l’IL-6 et le LPS a entraîné une augmentation de l’expression de CD80, CD83 et CD86 (Figure 3C). L’expression de la surface cellulaire CD83 du marqueur DC mature a considérablement augmenté lors de l’activation en utilisant l’IL-6 et le LPS au jour 8 par rapport au groupe non stimulé. Cela a confirmé que l’IL-6 et le LPS étaient capables de favoriser la maturation des cellules dendritiques (Figure supplémentaire S1L). L’expression de CD1a est demeurée uniforme entre les groupes non stimulés et stimulés. Fait intéressant, les CD stimulés sont restés en suspension, mais ils semblaient commencer à s’agréger et à adhérer les uns aux autres (figure 3C). Ces résultats confirment les résultats antérieurs concernant la polarisation du moDC et fournissent un contrôle supplémentaire pour l’analyse des marqueurs de surface afin d’identifier les populations de moDC indésirables dans les différentes conditions de culture des macrophages.

Les macrophages M2 générés par une exposition progressive aux cytokines possèdent une fonctionnalité associée à M2

Le récepteur du mannose (CD206) est un récepteur endocytaire et de recyclage qui est fortement exprimé dans nos populations de macrophages M2 dans des conditions de traitement progressif. Nous voulions ensuite évaluer l’absorption endocytaire médiée par le CD206 dans nos macrophages. Ceci a été déterminé à l’aide du PBI-12-Man, un agent biocompatible qui fluorescent lors de la liaison au récepteur du mannose (17). Après un traitement de 1 h des macrophages M1 et M2 avec le PBI-12-Man, la fluorescence rouge du PBI-12-Man était principalement intracellulaire chez les macrophages M2 dans des conditions de traitement échelonné et continu (Figure 4, A et B). Cette découverte suggère que la liaison de la surface cellulaire au CD206 et à l’endocytose entraîne une localisation vésiculaire. Ceci est en accord avec les données précédentes de la cytométrie en flux, qui ont démontré que dans des conditions de traitement échelonné, les macrophages M2 affichaient une expression plus élevée de CD206 à la surface cellulaire par rapport à la population de macrophages M1. Fait intéressant, nous avons constaté que les cellules GM-CSF uniquement présentaient des niveaux élevés d’endocytose PBI-12-Man (Figure 4, A et B). Ceci est en corrélation avec nos données cytométriques en flux (figure 2), qui ont démontré que les conditions de culture du GM-CSF uniquement produisent des cellules M1 avec une expression de marqueur de surface associée à M2. Au total, nous démontrons que ces cellules possédaient les caractéristiques normales des macrophages et que CD206 était fonctionnel dans la population de macrophages M2.

Après 14 jours de culture, les macrophages M2 ont également montré leur capacité à fusionner, atteignant une taille supérieure à 200 µm et contenant plusieurs noyaux par cellule (Figure 4C). Celles-ci ressemblaient à des cellules géantes multi-nucléées (MNGC) qui possédaient des capacités phagocytaires et autres (20). De plus, les MNGC ont été associés à des corps étrangers dans le corps, à la tuberculose et au cancer (20-23). Cette fusion cellulaire a été trouvée exclusivement dans nos populations de macrophages M2 et était beaucoup plus significative dans la condition de phase M2. Bien que les groupes M-CSF uniquement aient des cellules multinucléées (figure 4C), leur taille et leur nombre étaient beaucoup plus faibles que le groupe phasé. Compte tenu de la capacité de ces cellules à remplir cette fonction associée aux macrophages, ces résultats indiquent en outre que les conditions de culture en phase produisent des macrophages hautement semblables à ceux de M2.

Nous avons décrit ici notre nouveau protocole de polarisation progressive des macrophages. Nous avons constaté que l’inclusion de l’IL-6 et la synchronisation du traitement par polarisation progressive sont absolument essentielles pour générer les macrophages les plus semblables à M1 et M2 in vitro. Cette découverte a été testée rigoureusement par rapport à d’autres méthodes de polarisation. Pour cette raison, nous pensons que la méthode de polarisation progressive constitue un pas en avant substantiel. Cela donnera aux chercheurs des normes expérimentales unifiées pour produire des populations homogènes de macrophages à utiliser in vitro et la possibilité de comparer leurs résultats. Bien que ce protocole offre un certain nombre d’améliorations par rapport aux stratégies de polarisation actuelles, nous pensons que des recherches supplémentaires et une optimisation des temps d’exposition et du cocktail de cytokines seraient utiles. Cela nous aidera à mieux comprendre les rôles complexes des macrophages M1 et M2 dans diverses formes de progression de la maladie et à faire progresser le développement de nouvelles thérapeutiques.