Le CRBN est efficacement dégradé par des PROTACs hétérodimérisants VHL-CRBN

La technologie PROTAC utilise des ligases E3 pour détruire les protéines cibles. On s’est donc demandé si une ligase E3 elle-même pouvait être ubiquitinée et dégradée par une autre ligase E3 si deux ligases E3 différentes étaient placées à proximité. Les dégradants de la VHL pourraient potentiellement être des substituts de l’érythropoïétine par activation de HIF1a. Pour concevoir cela, nous avons connecté le pomalidomide, une molécule ciblant le CRBN, à VHL032, un ligand de ligase VHL E3 (Fig. 1 BIS). L’agent de liaison a connecté le groupe amino du pomalidomide et le groupe acétyle terminal de VH032; comme il s’agit de régions exposées au solvant, une connexion entre elles ne perturberait probablement pas leur liaison à chaque ligase E3. Pour la synthèse de PROTACs hétérodimérisants VHL-CRBN (Fig. 1B et Fig. supplémentaires. S1A), le 4-fluorothalidomide (1) et le ligand VHL (5) ont été préparés comme indiqué précédemment 33. Le 4-Fluorothalidomide (1) a été traité avec quatre lieurs d’amines (2) portant un groupe ester de tert-butyle en présence de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour former un intermédiaire (3). Après déprotection du groupe tert-butyle en 3 par traitement à l’acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM), l’acide (4) a été couplé au ligand VHL (5 ou 7) en présence de 1–1H-1,2,3-triazolopyridinium 3-oxyde hexafluorophosphate (HATU) et de DIPEA pour donner les PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 et TD – 487 (8).

Après traitement avec ces composés, nous avons examiné les niveaux de VHL et de CRBN par analyse Western blot. Le traitement par TD-158, TD-165 ou TD-343 a provoqué une diminution dépendante de la concentration du taux de protéines CRBN (Fig. 1C, panneau supérieur). Les niveaux de VHL forme longue et de VHL forme courte ont cependant augmenté, probablement en raison de la stabilisation par l’interaction chimique-protéine (Fig. 1C, panneaux du milieu supérieur et du milieu inférieur) 34. Dans le cas d’un traitement par 10 µM TD-158, les taux de CRBN ont été rétablis; cet effet « crochet » est une caractéristique typique qui se produit dans le contexte de la dégradation protéique induite par PROTAC à forte dose 9,35,36,37. Cependant, le TD-487, un stéréoisomère du TD-165, n’a pas réussi à induire la dégradation du CRBN (Fig. 1C). TD-343 possédait une activité relativement faible, ce qui implique que l’incorporation d’oxygène dans le lieur inhibe l’activité PROTAC. Une analyse quantitative de la réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR) a indiqué que la diminution du taux de CRBN induite par l’hétérodimérisation des PROTACs par VHL-CRBN ne résultait pas de modifications de l’ARNm (Fig. supplémentaire. S1B). Les valeurs de la concentration de dégradation de 50 % (DC50) et de la dégradation maximale (Dmax) ont été mesurées pour tous les composés synthétisés. Les valeurs DC50 et Dmax calculées pour le TD-158 étaient de 44,5 nM et de 97 nM.1%, respectivement, et les valeurs correspondantes pour TD-165 étaient de 20,4 nM et 99,6% (Fig. 1D et Fig. supplémentaires. S1D). Le dégradant contenant un linker plus court TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) a affiché une activité plus faible par rapport au TD-165 (Fig. supplémentaire. S1C). Le TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), avec de l’oxygène incorporé dans le lieur, a conduit à une dégradation inefficace du CRBN. Pour tester l’effet de la liaison à la thalidomide, nous avons examiné la dégradation du CRBN par hétérodimérisation de PROTACs VHL-CRBN avec une liaison différente. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), avec une liaison glycolique, et TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), avec une liaison amide, ont montré une dégradation réduite du CRBN, tandis que TD-759 (DC50 = 28,8 nM), avec une liaison glycine, a montré une puissance similaire à celle du TD-165. Pour déterminer si les niveaux relatifs de protéines pourraient contribuer à cette dégradation biaisée des protéines, nous avons traité des cellules surexprimant VHL, CRBN, ou les deux avec TD-158, et analysé les niveaux de CRBN et de VHL. Dans tous les cas, les niveaux de CRBN ont été réduits tandis que les niveaux de VHL sont restés similaires ou augmentés (Fig. 1E). Dans des expériences de parcours temporel, le TD-158 a dégradé le CRBN de plus de 80 % en 3 h et l’a complètement dégradé après 12 h (Fig. 1F). Une dégradation du CRBN induite par le TD-158 a également été observée dans diverses lignées cellulaires humaines (Fig. S2A-D).

La dégradation du CRBN par des PROTACs hétérodimérisants du VHL-CRBN dépend du CRL2VHL

Pour vérifier que la dégradation du CRBN par le TD-158 dépendait de l’UPS ou des ligases d’ubiquitine À CYCLE Cullin (CRL), nous avons testé le bortézomib, un inhibiteur du protéasome, et le MLN4924, un inhibiteur de la neddylation. Le cotraitement avec le TD-158 et le bortézomib ou le MLN4924 a empêché la dégradation du CRBN (Fig. 2A et Fig. supplémentaires. S3A). Comme prévu, la formation de chaînes de poly-ubiquitine a augmenté de manière marquée en présence de TD-158 (Fig. 2B). De plus, le knockdown de VHL par de petits ARN interférents (siRNA) a atténué la dégradation du CRBN induite par le TD-158 dans les cellules HEK293T (Fig. 2C). En revanche, l’expression de la VHL dans les cellules 786-O, une lignée cellulaire de carcinome rénal déficiente en VHL, a restauré la dégradation du CRBN induite par le TD-158 (Fig. 2D). Conformément à ces résultats, le knockdown médié par le siRNA de Cullin2, une protéine d’échafaudage du complexe CRL2VHL, a empêché la dégradation du CRBN induite par le TD-158 (Fig. 2E). Collectivement, ces résultats indiquent que la dégradation du CRBN par PROTACs hétérodimérisant VHL-CRBN dépend du complexe CRL2VHL.

Une dégradation efficace par les PROTACs nécessite la formation d’un complexe ternaire avec la protéine cible et la ligase E39,38. Pour tester cela, nous avons effectué des expériences de co-immunoprécipitation. Nous avons constaté que la VHL endogène co-immunoprécipitée de CRBN marquée par un drapeau exprimé de manière exogène en présence de TD-158, mais pas en son absence (Fig. 2F). Des expériences de descente GST utilisant des protéines purifiées ont montré que le CRBN interagissait directement avec le complexe VHL-Élongine B/C en présence de TD-158 (Fig. 2G). De plus, l’ajout d’un excès de pomalidomide ou de ligand VHL a inhibé la dégradation du CRBN induite par le TD-158 (Fig. S3B, C). Le CRBN Y384/W386A (AA) exprimé de manière exogène, un mutant défectueux lié au pomalidomide 16, n’a pas été dégradé par le TD-158 (Fig. supplémentaire. S3D). Ainsi, ces données suggèrent que la formation d’un complexe ternaire chez CRBN, VHL et TD-158 est une condition préalable à la dégradation du CRBN.

Une analyse protéomique globale révèle que le TD-158 induit la dégradation du CRBN

Pour examiner la dégradation du CRBN de manière impartiale, nous avons effectué une analyse protéomique quantitative. Pour minimiser les effets secondaires de la dégradation du CRBN, nous avons traité des cellules Jurkat, qui exprimaient des substrats CRBN et IMID neo, avec du TD-158 ou du DMSO (contrôle du véhicule) pendant 12 h. Les protéines de chaque échantillon ont été digérées et les peptides digérés ont été marqués pour un marquage isobare couplé à la chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem. Cette analyse a permis d’identifier 7 148 protéines contenant plus de trois peptides uniques non redondants (Tableau supplémentaire S1). Seules trois protéines – CRBN, CNIH1 et LMBRD2 – répondaient aux critères d’une valeur P = 0,05 et d’un changement de plus de 1,5 fois. Parmi eux, le CRBN était la seule protéine qui changeait de plus de 2 fois (Fig. 3 BIS). Cependant, les niveaux d’autres composants des complexes CRL4CRBN (CUL4A, CUL4B, DDB1 et RBX1) et des complexes CRL2VHL (élongine C, élongine B, CUL2 et RBX1) sont restés inchangés (Fig. 3B, C). Il est intéressant de noter que les niveaux de néo-substrats d’IMIDES précédemment rapportés, y compris IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 et ZNF653, n’ont pas été modifiés lors du traitement par TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Ces résultats ont été confirmés par immunoblotting chez Jurkat et diverses lignées cellulaires de myélome multiple (Fig. 3D et Fig. S2A-D).

La dégradation du CRBN par PROTACs hétérodimérisant VHL-CRBN résume un déficit en CRBN

Un substrat endogène du CRL4CRBN est la glutamine synthétase GLUL, qui est une enzyme clé dans la biogenèse de la glutamine. L’acétyltransférase CBP/p300 acétylate deux résidus de lysine N-terminale de GLUL dans des conditions de taux élevés de glutamine, et la GLUL acétylée résultante est capturée et ubiquitinée par CRL4CRBN puis éliminée par les protéasomes22. Pour examiner l’effet du TD-158 sur les taux de GLUL, nous avons affamé des cellules Hep3B de glutamine pendant 48 h, puis nous avons réapprovisionné la glutamine en présence ou en l’absence de TD-158. Le TD-158 induit une dégradation du CRBN indépendamment du statut glutamine, et les niveaux de GLUL diminuent plus lentement au fil du temps en présence de TD-158 qu’en son absence (Fig. 4 BIS, B). De plus, des essais d’ubiquitination in vivo ont montré que l’ubiquitination du GLUL diminuait en présence de TD-158 (Fig. 4C). Nous avons également étudié si le traitement TD-165 confère une résistance cellulaire à l’IMiD. Deux lignées cellulaires sensibles aux imides, WSU-DLCL2 et RPMI8226, ont été prétraitées avec du TD-165 ou du DMSO pendant 24 h, puis traitées avec du pomalidomide, du TD-165, ou les deux pendant 3 jours. Le prétraitement avec du TD-165 a réduit les effets anti-prolifératifs du pomalidomide dans les deux lignées cellulaires (Fig. 4D, E). Prises ensemble, ces données indiquent que la dégradation du CRBN par PROTACs hétérodimérisant VHL-CRBN résume un déficit en CRBN.

Pour étudier les effets in vivo des PROTACs hétérodimérisants du VHL-CRBN, nous avons tenté de déterminer si le TD-165 pouvait induire une dégradation du CRBN chez des modèles animaux. Bien que les résidus d’acides aminés dans le CRBN de souris (mCRBN) importants pour la tératogénicité ne soient pas conservés, le mCRBN a été nettement dégradé, quoique dans une moindre mesure, par le TD-165 dans les fibroblastes embryonnaires de souris (Fig. supplémentaire. S4A). Nous avons ensuite administré du TD-165 par voie intrapéritonéale à des souris pour déterminer si le TD-165 induit une dégradation du CRBN in vivo. Cependant, les taux de CRBN n’ont pas été modifiés dans la rate, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ou le foie (Fig. S4B). Étant donné que la pharmacocinétique du TD-165 est raisonnable (Tableau supplémentaire S2), cette absence d’effet pourrait être attribuable à la forte liaison aux protéines plasmatiques (99,9 %) du TD-165 (Tableau supplémentaire S3).

Le CRBN tronqué N-terminal n’est pas dégradé par des PROTACs hétérodimérisants du VHL-CRBN

Pour déterminer quel domaine du CRBN est important pour la dégradation du CRBN médiée par le TD-165, nous avons généré une série de mutants de délétion du CRBN (D1–D4), comme illustré à la Fig. 5A. Les cellules exprimant du CRBN intégral ou des mutants de délétion individuels ont été traitées avec du DMSO ou du TD-165, et les lysats cellulaires ont été examinés pour la dégradation après le traitement au TD-165. Étonnamment, aucun des quatre mutants de délétion du CRBN n’a été dégradé par TD-165, alors que le CRBN sur toute sa longueur a été efficacement dégradé (Fig. 5B). Notamment, les taux de VHL étaient légèrement élevés probablement en raison de la stabilisation de l’interaction chimique-protéine en présence de TD-165, mais non altérés par l’expression de mutants CRBN tronqués en présence de TD-165 (Fig. 5B). Une explication possible à cela serait l’incapacité des mutants de délétion à former un complexe ternaire. Cependant, le mutant D1 a formé un complexe ternaire avec TD-165 et VHL (Fig. 5C), et l’ubiquitination de D1 a augmenté en présence de TD-165 (Fig. 5D). Nous avons ensuite émis l’hypothèse que des résidus de lysine amino-terminaux du CRBN sont nécessaires à l’ubiquitination. Pour tester cette idée, nous avons substitué les trois résidus de lysine à l’extrémité N du CRBN (a.a. 1-80) par de l’arginine, individuellement et en combinaison, puis examiné les lysats cellulaires pour la dégradation du CRBN. TD-158 a dégradé efficacement tous les mutants dans la même mesure que le CRBN de type sauvage (Fig. 5E), indiquant que les trois résidus de lysine à l’extrémité N du CRBN ne sont pas nécessaires à la dégradation induite par l’hétérodimérisation des PROTACs VHL-CRBN.

La région désordonnée de la protéine ciblée est nécessaire pour une dégradation efficace induite par le PROTAC

Nous avons ensuite cherché à déterminer les différences structurelles entre le CRBN intégral et le mutant de délétion CRBN D1. On a prédit que l’extrémité N du CRBN (a.a. 1-80) contiendrait une région dépliée ou intrinsèquement désordonnée, sur la base d’une analyse IUPred2A (fig. supplémentaire. S5A). Cette région désordonnée (a.a. 1-48) était en effet indiscernable dans la structure cristalline CRL4CRBN en raison de sa flexibilité (entrée PDB; 6BN7). Il a été démontré que la région intrinsèquement désordonnée est l’un des principaux composants du degron protéasomal et qu’elle agit comme initiateur de la protéolyse protéasomale25. Alternativement, dans le cas de protéines globulaires sans région désordonnée, le complexe p97/protéine contenant de la valosine (p97/VCP) peut déplier la structure secondaire, facilitant la dégradation protéasomique des protéines. Pour examiner la relation entre la dégradation des protéines induite par le PROTAC et le complexe p97/VCP, nous avons testé l’effet de la N2, N4-dibenzylquinazoline-2,4-diamine (DBeQ), un inhibiteur de la p97/VCP, sur la dégradation du CRBN induite par la TD-165. Ces expériences ont montré que la dégradation du CRBN n’était pas influencée par le traitement par DBeQ (Fig. 6 BIS). Les taux de transcription inductible des dommages à l’ADN 3 (DDIT-3; CHOP) et de LC-3II lipidée, utilisés comme témoins positifs, ont été élevés lors du traitement par DBeQ. Le knockdown de p97 par le traitement siRNA ou DBeQ a altéré les voies ERAD et autophagique, conduisant respectivement à une régulation positive de CHOP, un marqueur UPR bien établi, et à une accumulation de LC-3II, un marqueur d’autophagie représentatif (Fig. 6 BIS) 42. Par conséquent, pour déterminer si la région désordonnée du CRBN facilite la dégradation protéasomale induite par le PROTAC, nous avons attaché la région désordonnée (a.a. 1-80) du CRBN aux mutants D2, D3 et D4 et avons examiné les protéines chimériques pour la dégradation. Toutes les protéines chimériques, en particulier la chimère D4, ont été dégradées par TD-165 de manière dépendante de la concentration (Fig. 6B). Cependant, l’introduction d’une région désordonnée du CRBN à l’extrémité N ou C de la VHL n’a pas induit de dégradation de la protéine de fusion (Fig. 6C), indiquant que la fixation de la région désordonnée n’est pas suffisante pour toutes les protéines ciblées. Pour étendre cette idée à la dégradation induite par d’autres PROTACs, nous avons testé ARCC4, un PROTAC43 du récepteur des androgènes (AR) précédemment rapporté, car l’AR abrite également une région dépliée à l’extrémité N (a.a. 1-330), tel que déterminé à l’aide de l’outil d’analyse IUPred2A (Fig. S5B). Lors du traitement par ARCC4, AR sans la région désordonnée N-terminale (ΔN330) a été dégradé moins efficacement que l’AR pleine longueur. Curieusement, la fixation de la région désordonnée CRBN (a.a. 1-80) à AR ΔN330 a augmenté l’efficacité de dégradation (Fig. 6D et Fig. supplémentaires. S5C). En conséquence, la fixation de la région désordonnée AR (a.a. 1-170) au mutant CRBN D1 a également favorisé la protéolyse par TD-165 (Fig. 6E et Fig. S5D).

Pour renforcer encore ces résultats, nous avons sélectionné des PROTACs à haute puissance (DC50 < 1 µM) sur la base d’une recherche documentaire, puis nous les avons analysés pour une région intrinsèquement désordonnée à l’aide de l’outil IUPred2A. Il est intéressant de noter que les deux tiers des protéines ciblées par PROTAC sélectionnées possèdent une région désordonnée de plus de 40 acides aminés, soit à l’une de leurs terminaisons, soit à l’interne (tableau 1)44, bien que la prédiction basée sur la séquence des acides aminés de régions désordonnées ou non structurées ne prenne pas en considération d’autres facteurs, tels que l’interaction protéine-protéine ou les modifications post-traductionnelles,44,45,46. En conséquence, il a été démontré que VHL-Homo-PROTAC induit une dégradation de la forme longue VHL, qui abrite une région désordonnée à son extrémité N, mais pas la forme courte VHL47. Ainsi, cela soutient notre idée que la région désordonnée des protéines ciblées est nécessaire à une dégradation efficace par les PROTACs.