Animaux

Des poissons zèbres ont été maintenus à 28,5 °C sur un cycle de lumière ALLUMÉ/ÉTEINT de 14 heures dans une solution de Danieau. Le mutant cristallin combinatoire (albb4/b4; nacrew2/w2; roya9/a9) a été généré par croisement séquentiel de trois souches mutantes uniques différentes, à savoir nacrew2/w2 (réf. 9), roya9/a9 (réf. 4) et albb4/b4 (réf. 18) mutants. Fait important, les larves et les poissons zèbres cristallins adultes sont viables et ne présentent pas d’anomalies morphologiques, fonctionnelles ou comportementales visibles autres que le phénotype de pigmentation. Le mutant casper a été obtenu en croisant les mutants nacrew2/w2 et roya9/a9, comme décrit précédemment 4. La lignée AB a été utilisée pour obtenir du poisson zèbre de type sauvage. Les lignées transgéniques utilisées dans cette étude comprennent le Tg (elavl3: GCaMP5G) 21 et le Tg (elavl3: GCaMP6f) 28. Des expériences d’imagerie fonctionnelle confocale ont été réalisées chez le mutant nacré. Des expériences d’imagerie en feuille de lumière ont été réalisées sur des mutants de nacre, de casper et de cristal. Des expériences d’imagerie fonctionnelle à deux photons ont été réalisées sur des larves de cristaux. Pour traiter les larves de poisson zèbre avec du PTU, nous avons suivi des procédures normales8, en particulier les larves ont été élevées en PTU (Sigma) de 200 µM dans une solution de Danieau 24 heures après la fécondation (hpf). Les larves de Tg (elavl3: GCaMP5G) utilisées pour l’imagerie fonctionnelle confocale de l’activité neuronale évoquée visuellement dans le tectum optique ont été traitées avec une PTU de 200 µM de 24 hpf à 3 dpf et imagées à 4 dpf. Ce travail a été approuvé par l’Organisme local de Contrôle du Bien-être Animal et de l’Éthique (King’s College de Londres) et a été effectué conformément à la Loi de 1986 sur les Animaux (Procédures scientifiques), sous licence du Ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni (PPL70/8057).

Imagerie

Microscopie in vivo d’animaux entiers

Des images d’animaux entiers de poissons zèbres adultes ont été prises avec un appareil photo reflex numérique Nikon D7000 équipé d’un objectif macro Sigma 150 mm. Les poissons zèbres adultes ont été anesthésiés avec 0.2% de tricaïne (MS222, Sigma) dans de l’eau d’installation de poisson et placée dans une boîte de pétri de 90 mm contenant de l’eau d’installation de poisson. L’imagerie des larves a été réalisée à l’aide d’un microscope Axioskop ZEISS connecté à des caméras CCD bleues EXi (Retiga) et à un logiciel d’acquisition de Volocity (PerkinElmer). Des poissons-zèbres larvaires ont été anesthésiés avec de la tricaïne à 0,02% dans une solution de Danieau et immobilisés dans de l’agarose à bas point de fusion (Sigma) à 1% sur des lames de verre.

Imagerie confocale du calcium

L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal ZEISS LSM 710 équipé d’une tête de balayage de détection spectrale et d’un 20X/1.0 NA objectif d’immersion dans l’eau (Carl Zeiss). Des séries chronologiques fonctionnelles de réponses calciques évoquées visuellement dans des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) ont été acquises à une vitesse de 4,1 Hz et une résolution de 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 pixels) et une ouverture de trou d’épingle de 1 UA. La lumière d’excitation est fournie par un laser multiligne de 488 nm. Les larves de Tg non anesthésiées (elavl3: GCaMP5G) ont été immobilisées dans de l’agarose à bas point de fusion (Sigma) à 2% préparé dans une solution de Danieau et montées sur la face dorsale sur une plate-forme en verre surélevée placée dans une chambre remplie de Danieau sur mesure. L’agarose était suffisant pour retenir les larves de sorte qu’une anesthésie n’était pas nécessaire. L’imagerie a été réalisée dans l’après-midi (13h à 20h).

Imagerie en feuille lumineuse

L’imagerie en feuille lumineuse du cerveau entier a été réalisée à l’aide d’un microscope ZEISS Lightsheet Z.1 équipé de deux objectifs d’éclairage 10X / 0,2 NA et d’un objectif de détection par immersion dans l’eau 20X/1,0 NA (Carl Zeiss). une lumière d’excitation laser de 488 nm a été utilisée pour obtenir la fluorescence GCaMP6f et un filtre de 505 à 545 PB a été utilisé pour la détection de la lumière émise. Le scanner à pivot (Carl Zeiss) a été utilisé pour fournir un éclairage homogène et, par conséquent, éviter les ombres le long de l’axe d’éclairage. L’épaisseur de la feuille lumineuse était de 5,39 µm au centre et de 10,8 µm aux bords du champ de vision. Le temps d’exposition était de 29,97 ms. La taille des images volumétriques était de 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixels) avec une résolution de 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. les larves de nacre, de casper et de cristal Tg (elavl3: GCaMP6f) 4 dpf ont d’abord été paralysées pendant 10 à 15 minutes dans de l’α-bungarotoxine (1 mg/ml; Biotium) préparée dans une solution de Danieau. Par la suite, les larves ont été immobilisées dans de l’agarose à bas point de fusion à 2% (Sigma) et placées à l’intérieur d’un capillaire en verre (volume de 20 µl, 701904; Marque). Nous avons ensuite extrudé la section du cylindre d’agarose contenant la tête de la larve à partir du capillaire, et orienté les larves de sorte que la face dorsale de la tête soit tournée vers l’objectif de détection et que les yeux soient tournés vers les deux objectifs d’illumination. L’imagerie par feuille lumineuse du cerveau entier des larves mutantes de casper a été réalisée à l’aide d’un microscope à feuille lumineuse sur mesure construit par le Dr Martin Meyer (King’s College London) et équipé d’un objectif de détection XLUMPlanFLN à immersion dans l’eau 20X / 1,0 NA (Olympus).

Imagerie calcique à deux photons

L’imagerie fonctionnelle à deux photons dans la rétine a été réalisée à l’aide d’un microscope Nikon A1R MP équipé d’un NDD GaAsP à 4 canaux et d’un objectif à immersion dans l’eau Apochromat 25X/1,1 NA (Nikon). L’excitation a été fournie par un laser titane-saphir Caméléon Ultra II verrouillé en mode (Cohérent) réglé à 930 nm. Des séries chronologiques de réponses calciques évoquées visuellement ont été acquises à une vitesse de 4 Hz et une résolution de 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 pixels). Suite à l’activation du balayage laser, nous avons attendu 60 secondes avant de commencer la stimulation visuelle pour nous assurer que la rétine était adaptée au niveau de lumière de fond provoqué par le laser multi-photons. les larves du cristal Tg 4 dpf (elavl3: GCaMP6f) ont d’abord été paralysées pendant 10 à 15 minutes dans de l’α-bungarotoxine (1 mg/ml; Biotium) préparée dans une solution de Danieau. Par la suite, les larves ont été immobilisées dans de l’agarose à faible point de fusion (Sigma) à 2% et montées sur une plate-forme en verre surélevée sur mesure, la face dorsale vers le haut (inclinaison d’angle de 45 °) et un œil face à un écran LCD (voir stimulation visuelle) placé sous une chambre remplie de Danieau sur mesure. L’imagerie a été réalisée dans l’après-midi (13h à 20h).

Stimulation visuelle

Barres mobiles en préparation confocale

Des stimuli de barres mobiles ont été générés comme précédemment décrit22,33. Un filtre de diffusion (3026, Rosco) a été collé sur un côté de la chambre pour servir d’écran de projection. L’agarose devant l’œil faisant face à l’écran de projection a été retirée, permettant une vue dégagée de l’image projetée sur le côté de la chambre. Les larves ont été placées à 3 cm de l’écran et l’image projetée a rempli un champ visuel d’environ 97° × 63°. Les stimuli visuels consistaient en des barres claires (56 cd/m2) ou sombres (8 cd/m2) (respectivement 175 % et 25% de la luminance moyenne) sur un fond gris moyen (32 cd/m2). Comme aucune différence qualitative entre les barres claires et foncées n’a été notée, les données obtenues à l’aide des deux stimuli ont été combinées. Chaque barre avait une largeur de 10° et se déplaçait à une vitesse de 20°/s et était séparée de la barre précédente de 30°, ce qui permettait d’afficher plus d’une barre à la fois sur l’écran. Les grands axes des barres étaient orthogonaux à la direction du mouvement. Chacune des 12 directions de mouvement a été présentée une fois (3 secondes) dans un ordre pseudo-aléatoire unique à chaque tranche de chaque animal imagé. Chaque intervalle inter-époques était de 10 secondes pour permettre aux signaux GCaMP5G de revenir à la ligne de base. Une condition nulle d’écran vide de 2 secondes a également été entrelacée. Les expériences visuelles ont été générées et contrôlées à l’aide de codes Labview et MATLAB écrits sur mesure (MathWorks), implémentés sur un présentateur de stimulus ViSaGe (Cambridge Research Systems) et livrés via un projecteur Pico DLP (Optoma).

Réseaux mobiles dans la préparation à deux photons

Réseaux mobiles les stimuli dans la préparation à deux photons ont été générés et contrôlés à l’aide de PsychoPy39, et transmis par un écran LCD (SKD5VA-3, technologie GoodWell) placé sous une chambre de perspex sur mesure. Un filtre en verre rouge passe-long (FGL610, Thorlabs) a été placé entre l’écran LCD et la chambre pour permettre une imagerie et une stimulation visuelle simultanées. Les larves ont été positionnées à 2 cm de l’écran et l’image sur l’écran LCD a rempli un champ visuel de ~ 140° × 100° (luminance moyenne de fond de 30,4 cd/m2). Les stimuli visuels étaient constitués de réseaux d’ondes carrées (contraste de 100%, fréquence spatiale de 1,66 cycle/ cm, fréquence temporelle de 1 cycle/s). Chaque barre de réseau avait une largeur de 8,5 ° et les grands axes des barres étaient orthogonaux à la direction du mouvement. Chacune des 12 directions de mouvement a été présentée une fois (6 secondes) avec un intervalle inter-époques de 10 secondes pour permettre aux signaux GCaMP6f de revenir à la ligne de base. Une condition nulle d’écran vide de 6 secondes a également été entrelacée. Déclencheurs TTL (0-5-0 Volts) pour enregistrer les événements temporels de l’époque générés via un périphérique USB DAQ LabJack (U3-LV, LabJack Corporation). Suite à l’activation du balayage laser, nous avons attendu 60 secondes avant de commencer la stimulation visuelle pour nous assurer que la rétine était adaptée au niveau de lumière de fond provoqué par le laser multi-photons.

Test de réponse optomotrice

Des larves individuelles de 5 dpf ont été placées dans une boîte de pétri de 35 mm contenant une solution de Danieau. L’écran LCD d’un iPhone 5 (Apple) contrôlé par un MacBook Pro (Apple) via Duet Display (Kairos Technologies) a été utilisé pour afficher des réseaux d’ondes carrées noir et blanc (contraste de 85%, fréquence spatiale 0,33 cycles / mm, fréquence temporelle 3,5 cycles / s) se déplaçant dans 4 directions (distance angulaire de 90 °) au fond de la boîte de pétri. Des stimuli visuels ont été générés dans Keynote (Apple). Chaque larve a été testée 5 fois au total (chaque essai a duré 6 s suivi de 10 s de grilles statiques) et notée en fonction des essais auxquels elle a répondu (c.-à-d. que le poisson tourne et nage dans la direction des grilles mobiles). Le comportement des larves a été contrôlé visuellement à l’aide d’un stéréomicroscope M165 FC (Leica).

Analyse

Analyses fonctionnelles

Les données d’imagerie calcique in vivo ont été analysées comme précédemment décrit22,33. En résumé, les séries chronologiques fonctionnelles ont été traitées avant analyse comme suit: les images de séries chronologiques de chaque expérience ont été corrigées pour le mouvement avec un algorithme à corps rigide (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), filtrées médianes avec une taille de noyau de 1 voxel pour éliminer le bruit sombre et le bruit de tir, et lissées spatialement avec un noyau gaussien 2D = 2 voxels pour améliorer le rapport signal-bruit. Une ligne de base (B) qui corrige les dérives à basse fréquence a été déterminée à l’aide d’un algorithme de spline cubique extrapolant entre les nœuds moyennés à partir de 5 s des données d’intervalle inter-époques. Les deux changements relatifs d’intensité du signal (ΔF = F-B; où F = fluorescence brute) et les changements normalisés d’intensité du signal ont été calculés à chaque voxel. ΔF a été utilisé pour les données fonctionnelles de la population (analyse des voxels), tandis que %ΔF/F0 a été utilisé pour les régions d’intérêt définies manuellement (ROI). Pour chaque voxel ou ROI, la réponse intégrale sur l’intervalle d’époque a été calculée pour fournir une mesure de réponse unique de chaque direction de mouvement de stimulus présentée. L’intégrale dans chaque fenêtre d’époque est une métrique récapitulative plus résistante aux effets de saturation de la sonde calcique que la variation maximale du signal. Un seuil pour chaque voxel au sein d’une séquence d’images d’acquisition a été déterminé à partir de la variance des changements de ΔF pendant les intervalles inter-époques et de la condition nulle, seuil = 5 × SDs. Tous les voxels qui étaient au-dessus du seuil dans au moins deux époques de présentation visuelle ont été considérés comme sensibles visuellement et soumis à une caractérisation plus poussée.

Pour analyser la sélectivité en direction et en orientation des voxels visuellement réactifs, des indices sélectifs en direction et en orientation (DSI et OSI)40, basés sur des profils de von-Mises ajustés ou gaussiens41, ont été calculés avec une estimation de leur bon ajustement, R2. Le DSI a été défini comme (Rpref-Rnull) / (Rpref + Rnull), où Rpref, la réponse à la direction préférée, était la réponse intégrale sur l’intervalle d’époque de la direction préférée. Rnull a été calculé de la même manière que la réponse intégrale évoquée par la direction opposée à la direction préférée. L’OSI a été défini comme (Rpref-Rorth) / (Rpref + Rorth), où Rpref, la réponse à l’orientation préférée, était la réponse intégrale sur l’intervalle d’époque d’orientation préférée. Rorth a été calculé de la même manière que la réponse intégrale évoquée par l’orientation orthogonale. Une approche rigoureuse a été adoptée afin de minimiser les interactions et les ajustements excessifs associés aux métriques DSI et OSI. Pour qu’un voxel soit considéré comme sélectif de direction (DS) ou sélectif d’orientation (OS), des critères mutuellement exclusifs ont été utilisés : DS if DSI > 0.5 et OSI <0.5; et OS si OSI > 0.5 et DSI < 0.5. Dans les deux cas, la qualité de l’ajustement (R2) pour DSI et OSI, respectivement, devait être > 0,8 ; ainsi, les courbes ajustées expliquaient au moins 80% des réponses intégrales. Une distribution de von-Mises unique a été utilisée pour ajuster les réponses des voxels DS et estimer leur angle de mouvement préféré à partir du centre de la courbe ajustée. La somme de deux von-Mises (distance angulaire de 180°) a été utilisée pour ajuster les réponses des voxels OS et estimer leur orientation préférée des angles de mouvement à partir des centres des courbes ajustées. La variance circulaire a également été calculée à des fins de comparaison en tant que mesure alternative de la sélectivité de l’orientation (variance circulaire < 0,4)41.

Analyses morphologiques

Pour déterminer le volume cérébral imagé dans la nacre 4 dpf, le casper et le cristal Tg (elavl3:GCaMP6f), nous avons calculé le nombre de voxels GCaMP6f+ dans chaque image volumétrique en appliquant la fonction de seuil ajuster > suivie de la commande de liste analyser >histogramme > dans ImageJ42. Par la suite, les valeurs obtenues ont été multipliées par le volume d’un seul voxel (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

Analyses statistiques

Les résultats des tests statistiques sont présentés sous forme de figures et de légendes de figures. Des analyses et tests statistiques ont été réalisés à l’aide de Prism 6 (GraphPad) ou MATLAB R2014b (MathWorks). Avant d’effectuer des tests statistiques, des statistiques descriptives (par exemple, des tests de normalité pour voir si les valeurs proviennent d’une distribution gaussienne ou d’un test F pour comparer les variances) ont été utilisées pour choisir le test statistique approprié (rapporté dans les légendes de figures avec les résultats des tests). Le critère de signification statistique a été fixé à p< 0,05.