Inhibiteurs d’ALDH1A1 a récemment été décrit30. Des inhibiteurs de la LDHA ont été précédemment décrits dans Rai et al.29. Les inhibiteurs de l’IDH1 ont été précédemment décrits dans Urban et al. et Davis et coll.24,36. Les autres composés utilisés dans l’étude étaient le Méthotrexate (MedChem Express, HY-14519), le Panobinostat (Selleck Chem, S1030), l’AG-221 (MedChem Express HY-18690), l’Isofagomine (Toronto Research Chemicals #I816010), le Lumacaftor (BioVision #2857) et le LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Pour les QHT, les composés de la plaque d’interrogation du mécanisme (MIPE) ont été testés en 11 points (intraplate, facteur de dilution 1: 3). La collection d’inhibiteurs de kinase contenant 977 inhibiteurs de kinase a été testée en doses de 7 points (interplaque, facteur de dilution 1: 5). Dans tous les cas, le DMSO a été utilisé comme véhicule.

Clonage

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Des Trames de lecture ouvertes (ORF) des gènes d’intérêt ont été clonées dans les dorsales acceptrices en utilisant des sites BamHI/EcoRI (N-terminal) ou NheI/BamHI (C-terminal) par PCR amplifiant la région codante avec des oligonucléotides compatibles avec la perfusion, définis en détail dans le Tableau complémentaire S1. Les constructions IDH1, LDHA, DHFR, GC et ALDH1A1 ont été préparées par synthèse du gène GeneArt (ThermoFisher) dans pcDNA3.1 (+). Pour le clonage de passerelle (constructions IDH2 uniquement), un vecteur de destination contenant la balise 86b a été créé en remplaçant la balise V5 dans pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes « LPTFLYKVVDLEGPR » prior to the 86b tag.Des cellules HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468 et HT-29 ont été obtenues à partir de cellules ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 et HTB-38, respectivement). HuCC-T1 et CC-LP-1 étaient un don aimable du Dr N. Bardeesy (Hôpital général du Massachusetts, Boston). Des cellules HEK293T ont été cultivées dans du DMEM (4,5 g /L de glucose) avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 6 mM de L-glutamine, 1 mm de pyruvate de sodium, 50 U /mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine. Les cellules LN18, HT-29, CC-LP-1 et HeLa ont été cultivées dans le milieu ci-dessus, sans pyruvate de sodium. Les cellules OV-90 ont été cultivées dans un mélange 1:1 de milieu MCDB 105 (Cell Applications Inc.) et du milieu M199 (HyClone, GE), additionné de 15% de FBS, de 1% de pénicilline-Streptomycine (Life Technologies) et d’une concentration finale de 1,85 g /L de bicarbonate de sodium (HyClone, GE). Les cellules 22RV1, HuCC-T1 et MDA-MB-468 ont été cultivées dans RPMI 1640 additionnées de 10% de FBS, de 6 mM de L-glutamine, de 100 unités / mL de pénicilline, de 100 µg / mL de streptomycine. Toutes les cellules ont été cultivées à 37 °C dans un incubateur humidifié maintenu à 5% de CO2 et testées négatives pour les mycoplasmes à l’aide d’un kit de détection MycoAlert (Lonza).

Production et purification de protéines et de peptides recombinants

Les protéines 11S et 86b ont été produites par GenScript. Pour le fragment 11S recombinant, la séquence d’ADN codante a été fusionnée à une étiquette His 6x pour faciliter la purification en aval et la séquence a été sous-clonée dans un vecteur d’expression d’E. coli. Les cellules de l’étoile BL21 (DE3) ont été transformées avec des plasmides recombinants et une seule colonie a été inoculée dans un milieu LB contenant de l’IPTG pour l’induction de l’expression des protéines. Des analyses de PAGES SDD et de Western blot ont été utilisées pour surveiller l’expression et sélectionner le moment optimal de la récolte. Les cellules ont été récoltées par centrifugation et les pastilles ont été lysées par sonication. Après purification de l’étiquette His, les fractions ont été stérilisées à travers un filtre de 0,22 µm. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide de protocoles standard et d’un mAb anti-His de souris (GenScript, Cat. No. A00186). La concentration de protéines purifiées a été déterminée à l’aide d’un test de protéines de Bradford avec BSA comme standard. La protéine a été stockée dans 1X PBS, 10% de glycérol, pH 7,4, et la pureté était d’environ 90%, comme estimé par analyse densitométrique du gel SDS-PAGE coloré en bleu de Coomassie dans des conditions réductrices. Le peptide de 15 acides aminés 86b a été stocké dans du DH2O ultrapure et était pur à 99,9% par CLHP.

Test de complémentation CETSA à faible débit (plaques ou bandes de PCR à 96 puits)

Des cellules ont été transfectées dans des boîtes à 6 puits en utilisant une procédure de transfection inverse, où 1,25 ml de complexes (6,25 µL de lipofectamine 2000 et 3 µg d’ADN par puits) a été combiné avec 1,25 ml de suspension de cellules HEK293T (1 × 106 / mL, 1,25 × 106 cellules au total). Pour CDK9, on a utilisé 2 µg d’ADN par puits. Après 24 h (48 h pour CDK9), les cellules ont été récoltées par trypsinisation et remises en suspension à 1 × 106 cellules / mL (sauf indication contraire) dans un tampon CETSA contenant des DPBS (avec CaCl2 et MgCl2) plus 1 g /L de glucose, 1X cocktail inhibiteur de protéase Halt (ThermoFisher) et 0,5% de DMSO (le DMSO n’a pas été ajouté pour les expériences qui ont reçu un traitement ultérieur composé et véhicule). Pour les expériences de plage de température (sans composé ni dose unique), les échantillons ont été aliquotés sur des bandes de PCR à 30 µL par tube. Le composé a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 1 h. Les échantillons ont ensuite été chauffés pendant 3.5 min à l’aide d’un thermocycleur préchauffé, on laisse s’équilibrer à température ambiante et on ajoute 6 µL de NP40 à 6% dans chaque puits. Pour les expériences de gel-dégel, des tubes ont été placés dans un bloc PCR en aluminium sur un bain de glace carbonique/éthanol pendant 3 min, puis incubés à 37 ° C pendant 3 min, vortexés pendant 3 s et répétés trois fois supplémentaires. 11S (GenScript) et substrat de furimazine (du système de dosage de la Luciférase Nano-Glo, Promega) ont été ajoutés, à des concentrations finales de 100 nM et 0.5X, respectivement, et des échantillons ont été analysés pour l’intensité de la luminescence à l’aide d’un imageur CCD à haut débit ViewLux (Perkin Elmer) équipé de filtres transparents.

Test CETSA à 384 puits

Des cellules ont été transfectées dans des flacons T75 en utilisant une procédure de transfection inverse, où 9 mL de complexes (45 µL de Lipofectamine 2000 et 22,5 µg d’ADN) ont été combinés avec 10 mL de suspension de cellules HEK293T (1 × 106 cellules / mL, 10 millions de cellules au total). Après 24 h, les cellules ont été récoltées par trypsinisation, remises en suspension à 1 × 106 cellules/ml comme décrit ci-dessus et distribuées (15 µL de cellules/puits) dans des plaques PCR à 384 puits (Roche) à l’aide d’un Combi Multidrop (ThermoFisher). Les composés (63 nL) ou la commande de véhicule DMSO (63 nL) ont ensuite été épinglés à l’aide d’un outil à broche (GNF) et incubés pendant 1 h à 37 ° C. Les plaques ont été scellées et chauffées à la température indiquée pendant 3,5 min et refroidies à 25 ° C à l’aide de la machine AB qPCR (Roche) en utilisant une vitesse de rampe de 1,5 ° C / s pour la phase de chauffage et une vitesse de rampe maximale pour la phase de refroidissement. Trois µL de NP40 à 6% ont été ajoutés par puits et incubés pendant 30 min pour permettre une lyse cellulaire suivie d’une addition de substrat 11S et de furimazine (à des concentrations finales de 100 nM et 0,5X, respectivement). L’intensité de luminescence des échantillons a été analysée à l’aide d’un lecteur ViewLux.

Test CETSA à 1 536 puits

Les cellules ont été transfectées et récoltées comme ci-dessus (protocole à 384 puits). Les cellules ont été distribuées (cellule de 5 µL / puits) dans des plaques blanches de 1 536 puits (Aurora, polymère d’oléfine cyclique, cat # EWB041000A) à l’aide d’un Combi Multidrop. Les composés (23 nL) ont ensuite été épinglés à l’aide d’un outil à broche (Wako Automation) et incubés pendant 1 h à 37 °C. Des plaques ont été chauffées à la température et au temps indiqués à l’aide d’un bloc chauffant (voir ci-dessous) et refroidies à 25 °C. Un µL de NP40 à 6% a été ajouté par puits et des plaques ont été incubées pendant 30 min pour permettre une lyse cellulaire suivie de l’ajout de 3 µL 11S (concentration finale 100 nM) et d’un substrat de furimazine. Les plaques ont été centrifugées et analysées pour l’intensité de luminescence à l’aide d’un lecteur ViewLux. Pour les écrans LDHA et CDK9, une concentration finale de 0,5X et 0.La furimazine 25X a été utilisée, respectivement. Les contrôles de normalisation comprennent des échantillons traités au DMSO et au GSK2837808A ou des échantillons non chauffés pour la LDHA et la CDK9, respectivement. Le contre-écran CDK9 a été réalisé comme ci-dessus avec les différences suivantes: 5 µL de cellules HEK293T non transfectées (1 × 106 / mL dans un tampon CETSA) ont été distribués dans des plaques à 1536 puits suivies d’une addition de composé, d’une incubation à 37 ° C, d’un chauffage et d’étapes de lyse comme ci-dessus. Par la suite, 500 pM (final) de 86b ont été ajoutés aux puits, suivis d’un ajout de substrat de 100 nM 11S et de 0,25X de furimazine (final).

Le bloc d’aluminium pour chauffer une plaque de 1 536 puits a été conçu en mesurant une plaque pour déterminer les dimensions de la zone bordée par des nervures de renforcement moulées en X et Y, et la face inférieure du puits et la face inférieure de la bride en Z. Ensuite, un bloc à usiner à partir d’une plaque d’aluminium 6061 T6 a été moulé, ce qui constituerait un ajustement libre avec un jeu d’environ 0,5 mm pour la plaque dans tous les axes. Le bloc a été usiné à l’aide d’une fraiseuse verticale manuelle, de fraises en bout et d’un laminoir. Pour les expériences de chauffage au four, les plaques ont été placées dans la grille centrale du four de laboratoire à convection (thermofisseuse) et recouvertes de couvercles métalliques pour minimiser l’évaporation.

Les cellules CETSA dans les lysats cellulaires

ont été collectées dans du tampon CETSA à 1,0 × 106 cellules / mL (comme indiqué ci-dessus) et du NP40 a été ajouté à une concentration finale de 0,4%. Après avoir fait tourner les échantillons bout à bout pendant 30 min (température ambiante), les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 20 000 × g pendant 10 min (4 oC). Un cofacteur (par exemple NAD+) a été ajouté au lysat clarifié. Pour les expériences de réponse en température, 25 µL de lysat ont été transférés dans des tubes de PCR et chauffés pendant 3,5 min à différentes températures. Pour les expériences dose-réponse isothermes, 5 µL de lysat clarifié ont été distribués dans des plaques de 1536 puits à l’aide d’un poste de travail BioRAPTR FRD et les échantillons ont été chauffés sur un bloc d’aluminium. On laisse les échantillons s’équilibrer à température ambiante et on ajoute du substrat (concentration finale : 100 nM 11S, 0,5X furimazine). La luminescence a été capturée à l’aide d’un imageur ViewLux comme indiqué ci-dessus.

Western blots

Les échantillons ont été traités comme indiqué dans la section Analyse de complémentation à faible débit, en utilisant des cycles de gel-dégel pour la lyse. Les lysats ont été centrifugés à 15 200 ×g pendant 20 min à 4 °C. Les échantillons ont été exécutés sur un gel NuPAGE Bis-Tris (ThermoFisher) à 4-12% à l’aide d’un tampon MOPS et transférés sur une membrane PVDF à l’aide d’un système de transfert iBlot 2 à 25 V pendant 7 min. Les membranes ont été bloquées avec une solution laitière à 5% (Tris HCl 50 mM, pH6; NaCl 150 mM; Tween-20 0,1%) et les anticorps primaires ont été incubés pendant une nuit à 4 °C dans une solution de blocage. Les anticorps étaient: anti-IDH1 (, Signalisation cellulaire #8137, 1:500), anti-IDH1 (R132H) (Millipore # MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Signalisation cellulaire #3582, 1:1000). L’anti-HRP lapin/souris (lapin = Signalisation cellulaire 7074; souris = Signalisation cellulaire #7076) a été ajouté à 1:2500 et incubé pendant 1 h à température ambiante. Un signal chimiluminescent a été généré avec une solution de dura ouest supersignale (ThermoFisher) et capturé à l’aide d’un système Biorad Chemidoc. L’analyse densitométrique a été réalisée à l’aide du logiciel Photoshop (Adobe).

Dosage du 2-HG

Les cellules HEK293T sont transfectées à l’inverse dans des boîtes à 24 puits en ajoutant 2.5 × 105 cellules sur des complexes de transfection (0,75 µg d’ADN plasmidique, 1,5 µL de Lipofectamine 2000 par puits). Le milieu de culture cellulaire a été recueilli après 72 h et 15 µL ont été transférés sur une plaque opaque à 384 puits. 1,5 µL d’HCl de 660 mm a été ajouté à chaque puits et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 10 min. 1,5 µL de base Tris-HCl de 720 mm a été ajouté à chaque puits. Puis, 52 µL de solution de détection de 2-HG (HEPES 100 mM (pH 8,0), NAD + 100 µM, D-2-Hydroxyglutarate déshydrogénase recombinante active 1 µg/mL (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), résazurine 5 µM, diaphorase 0,03 mg/mL (Sigma, Cat: D5540) a été ajouté et la plaque a été incubée à température ambiante. Une courbe étalon de 2 HG a été préparée dans des HEPES de 100 mM (pH 8,0). La fluorescence a été mesurée sur un lecteur ViewLux à l’aide de filtres Ex:525, Em:598/25.

Essais biochimiques

L’essai biochimique de la LDHA a été réalisé comme décrit précédemment 29. Brièvement, 3 µL de lactate déshydrogénase 5 humaine (2 nM final) (no. A38558H, Meridian Sciences de la vie, Inc.) dans un tampon de dosage LDH (Tris HCl 200 mM, pH 7,4, EDTA 100 µM et Tween-20 0,01%) a été ajouté à une plaque de dosage à fond solide noir à 1536 puits (Greiner Bio-One). Après transfert du composé pin (23 nL), 1 µL de solution de substrat contenant du NADH (0,06 mM final) et du pyruvate de sodium (0,2 mM final) (Sigma-Aldrich) dans du tampon de dosage LDH a été distribué pour initier la réaction. Après 5 min d’incubation à température ambiante, 1 µL de réactif de détection a été ajouté dans chaque puits. Les plaques ont été immédiatement transférées sur un lecteur ViewLux et toute fluorescence de résorufine résultante a été mesurée (ex 540 nm, em 590 nm) à 0 et 10 min. La fluorescence a été normalisée à l’aide de puits témoins sans enzyme et traités au DMSO sur chaque plaque.

L’essai biochimique ALDH1A1 utilisant une protéine non étiquetée a été réalisé comme décrit précédemment 31,37. Brièvement, 3 µL d’ALDH1A1 humain purifié à 20 nM dans un tampon de dosage (HEPES 100 mM pH 7,5 avec 0,01% de Tween 20) ont été distribués dans une plaque noire à fond solide de 1 536 puits (Greiner Bio One). Vingt-trois NL de composés ou baie de contrôle 11-7085 ont été transférés via un outil à broches (automatisation Wako). Les échantillons ont été incubés (température ambiante, à l’abri de la lumière) pendant 15 min suivi d’un ajout de substrat de 1 µL de NAD+ et de Propionaldéhyde (concentrations finales de 1 mM et 80 µM, respectivement). Les plaques ont été centrifugées et lues en mode cinétique sur un imageur ViewLux équipé de filtres d’excitation 340 nm, d’émission 450 nm pendant 5 min. Le changement d’intensité de fluorescence au cours des 5 minutes a été normalisé à l’aide de puits témoins sans enzyme et traités au DMSO sur chaque plaque.

Le test de liaison à la kinase TR-FRET Lanthascreen Eu pour CDK9/ cycline K a été acheté auprès de ThermoFisher et effectué conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, 4 µL d’un mélange maître contenant 4 nM de CDK9/ Cycline K (Invitrogen #PV4335), 2 nM d’Anti-His Ab de Biotine, 2 nM d’Eu-Streptavidine et une Solution de Traceur Kinase 236 à 10 nM dans un Tampon Kinase 1X ont été distribués dans des plaques de liaison moyennes blanches à 1 536 puits Greiner à l’aide d’un poste de travail BioRAPTR FRD. Vingt-trois nL de composés et de témoins (DMSO et LY2857785 à une concentration finale de 6 µM) ont été immédiatement acheminés vers les plaques de dosage par transfert d’outils à broches. Les plaques ont été laissées à incuber pendant 1 h à température ambiante, et la fluorescence TR-FRET a ensuite été mesurée avec un lecteur de plaques multicouches PerkinElmer EnVision (Ex: 317/20; Em 1:620/12 ; Em 2:665/12; Temps de latence 100 µs ; Temps d’intégration 200 µs).

Test de production de lactate

Les cellules HEK293T ont été cultivées comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été rincées avec du PBS, trypsinisées et remises en suspension dans du DMEM sans rouge phénol (Life Technologies) sans suppléments. Les cellules ont été immédiatement plaquées sur des plaques de fond transparentes noires de 1536 puits (Corning) à 250 cellules par puits dans un volume de 4 µL. Un composé ou un contrôle de véhicule a été ajouté aux puits par transfert d’outils à broches et les cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h. Deux µL de mélange réactionnel de lactate (Biovision K607-100) ont été ajoutés à chaque puits et des plaques ont été recouvertes et incubées à température ambiante pendant 30 min. La fluorescence a été mesurée à l’aide d’un imageur de microplaques ViewLux équipé de filtres Ex/Em 528/598 nm.

Essai d’aldéfluor

Pour la détermination initiale de l’activité ALDH1A1 marquée au 86b, les cellules ont été transfectées par une procédure de transfection inverse, où 1 mL de complexes (6 µL de lipofectamine 2000 et 3 µg d’ADN) a été combiné avec 1 mL de suspension cellulaire LN18 (5 × 105 / mL) et 100 µL / puits de mélange ont été distribués dans des plaques noires à fond clair à 96 puits (Corning). Après 24 h, le milieu a été retiré et remplacé par 100 µL/puits de tampon Aldéfluor (STEMCELL Technologies) contenant le substrat BAAA et Hoechst 33342 (Thermofisseuse, concentrations finales de 500 nM et 0,5 nM, respectivement). Du DMSO ou DEAB de véhicule (1 µM final) a ensuite été ajouté et des plaques ont été incubées pendant 30 min à 37 °C pour permettre la conversion de BAAA en BAA. Les cellules ont été lavées et 100 µL/puits de tampon aldéfluor avant imagerie sur une cellule IN 2200 (GE Healthcare). Pour les dosages à haut débit, les cellules LN18 ont été transfectées dans des flacons T75 en utilisant une procédure de transfection inverse telle que décrite ci-dessus pour les dosages CETSA HEK293T à haut débit. Après 16 h, les cellules ont été récoltées et plaquées (1000 cellules /puits / 5 µL) dans un fond transparent noir de qualité optique, traitées par TC à 1536 plaques de puits (microplaques Aurora) à l’aide d’un distributeur combiné Multidrop et incubées pendant une nuit à 37 °C. Le dosage d’aldéfluorés à haute teneur a ensuite été effectué sur des cellules LN18 transfectées ou OV-90 non transfectées comme décrit précédemment 31. Les images ont été analysées à l’aide de l’algorithme d’analyse Multi-cibles en boîte du logiciel d’analyse IN Cell Investigator v1.6.2 (GE Healthcare) comme décrit.

Test d’intégrité thermique membranaire

30 000 cellules HEK293T ont été préparées dans un tampon CETSA de 30 µL contenant 1 cocktail d’inhibiteur de protéase (ThermoFisher) additionné de 0,5% de DMSO (1,5% de DMSO total). Pour l’expérience de tolérance au DMSO, le DMSO a été ajouté au DPBS à 0, 1, 2 ou 3 %. Les suspensions de cellules ont été chauffées pendant 3,5 min à 42 à 74 ° C, à intervalles de 4 degrés, puis retirées dans un bloc d’aluminium sur de la glace humide. Des suspensions cellulaires ont été mélangées avec des parties égales de bleu de Trypan (LONZA) (= 0,2% de bleu de trypan) et comptées immédiatement à l’aide d’un hémocytomètre à puce C (iNCyto, Corée). Les Trypan positifs (perméabilisés) et négatifs (intacts) ont été comptés, avec n = 2 à chaque température. Pour des lignées cellulaires supplémentaires, un million de cellules ont été préparées dans 100 µL de DMEM sans rouge phénol contenant 1% de DMSO. Les cellules ont été chauffées pendant 3 min de 42 à 90 ° C à des intervalles de 4 degrés, puis retirées dans un bloc d’aluminium sur de la glace humide. L’intégrité de la membrane a été évaluée comme décrit ci-dessus.

PAMPA

La méthode de brassage à double évier PAMPA brevetée par pION Inc. (Billerica, MA) a été utilisé pour mesurer la perméabilité du composé tel que décrit précédemment 38. Les composés ont été dilués dans des solutions donneurs et accepteurs tamponnées à pH7,4 et la concentration en DMSO était de 0,5%. Les calculs de perméabilité ont été effectués à l’aide de Pion Inc. logiciel.

Analyse QHT

Les données de chaque essai ont été normalisées par rapport aux témoins correspondants, comme décrit précédemment 39. Les mêmes contrôles ont également été utilisés pour le calcul du facteur Z’ pour chaque essai. Le pourcentage d’activité a été calculé à l’aide d’un logiciel interne (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Toutes les courbes concentration-réponse ont été ajustées et AC50 ont été calculées avec le logiciel GraphPad Prism; les courbes ont été classées comme décrit précédemment 27. L’aire sous la courbe (ASC) a été calculée à l’aide de la règle trapézoïdale pour approximer l’aire entre la courbe de réponse et l’axe des abscisses dans la plage de concentration. Des plages de concentration équivalentes ont été utilisées pour tous les composés d’une expérience. Le seuil d’efficacité de 3 σ par rapport à la moyenne (du contrôle du véhicule) a été utilisé pour classer les composés actifs.