Le champignon Candida guilliermondii est largement répandu dans la nature, y compris dans le microbiote humain de la peau et des surfaces muqueuses.22 Bien que cette espèce présente une virulence réduite par rapport aux autres espèces de Candida3, elle est actuellement considérée comme un agent pathogène émergent, avec une incidence majeure en Amérique latine.18 QUATER. guilliermondii a été reconnu comme l’agent étiologique d’une grande variété d’infections cliniques, y compris celles disséminées principalement chez les patients immunodéprimés22 et les épidémies nosocomiales chez les patients chirurgicaux avec des dispositifs intravasculaires.13 Actuellement, le traitement recommandé pour la candidose invasive chez les patients neutropéniques comprend la caspofungine (CFG) ou la micafungine (MFG) comme traitements de première intention, l’amphotéricine B liposomale (LAMB) et l’anidulafungine (AFG) étant des alternatives, tandis que le fluconazole (FLC) n’est recommandé que lorsque la sensibilité à ce médicament est confirmée.23 Cependant, plusieurs études ont montré que C. guilliermondii présente une sensibilité réduite aux FLC8, 15, 19, et des échecs thérapeutiques associés à des isolats à fortes concentrations inhibitrices minimales d’amphotéricine B (AMB) ont été rapportés.9,12,24 Bien que près de 90 % des isolats présentent des CMI d’échinocandines égales ou inférieures aux points d’arrêt cliniques (CBP) de sensibilité (2µg/ml),17 similaires à d’autres espèces de Candida, telles que C. parapsilosis, certains isolats de C. guilliermondii présentent des CMI considérablement élevées.8,15 Les données disponibles concernant l’efficacité de l’AFG dans la candidose invasive sont limitées et le rôle potentiel de ce médicament dans la pratique clinique est mal connu.23 Dans ce contexte, les études animales peuvent jouer un rôle important pour une meilleure compréhension de la corrélation in vitro–in vivo.11 Par conséquent, notre objectif principal était d’évaluer les activités in vitro et in vivo de l’AFG par rapport à différents isolats de C. guilliermondii, en comparant les résultats avec ceux de l’AMB et du FLC.
Matériaux et méthodesisolats fongiques
Quatre isolats cliniques de C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 et UTHSC 10-3207) ont été utilisés dans l’étude in vitro et deux d’entre eux (UTHSC 11-685 et UTHSC 11-142) ont été sélectionnés pour le modèle murin sur la base de leurs différentes susceptibilités in vitro. Les isolats ont été identifiés en séquençant la région d’espaceur transcrit interne (ITS) et les domaines D1–D2 de l’ARNr, en comparant les séquences avec celles de la souche type de cette espèce.
Études in vitro
La sensibilité in vitro des quatre souches à l’AMB, au FLC et à l’AFG a été évaluée à l’aide d’une méthode de microdilution de bouillon de référence, 6Candida parapsilosis ATCC 22019 et Candida krusei ATCC 6258 étant incluses comme contrôles de qualité.
Des courbes temporelles ont été développées pour toutes les souches selon des études antérieures.5,20 En bref, une solution mère de chaque antifongique a été préparée, AMB (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, États-Unis) et AFG (Pfizer Inc., Madrid, Espagne) ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde et du FLC (Pfizer Inc., Madrid, Espagne) dans de l’eau distillée. De plus, des dilutions de médicament ont été préparées dans 9 ml de milieu RPMI 1640 standard pour obtenir des concentrations de 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 et 32µg/ml de chaque médicament. Les isolats ont été repiqués à 35°C pendant 24h sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA). Des cultures de C. guilliermondii ont été mises en suspension dans une solution saline stérile et les suspensions résultantes ont été ajustées à 5×106 unités formant colonie (UFC)/ml par comptage hémocytométrique et par électrodéposition en série sur PDA pour confirmer la viabilité. Des dilutions et des témoins (sans médicament) ont été inoculés avec 1 ml des suspensions fongiques, ce qui a donné un inoculum de départ de 5 × 105CFU / ml, et incubés à 35 ° C. Une aliquote de 100 µl de chaque tube a été collectée à 0, 2, 4, 6, 8, 24, et 48h après inoculation et dilué dans de l’eau distillée; 30 µl d’entre eux ont été cultivés sur des plaques de PDA et incubés à 35°C pendant 48h pour la détermination de l’UFC /ml. Une diminution de l’UFC ≥99,9 % ou 3 unités log10 par rapport à l’inoculum initial a été considérée comme fongicide, tandis qu’une réduction de l’unité
log10 a été considérée comme fongistatique. La limite de détection était de 50CFU/ml. Toutes les études de courbe de destruction de temps ont été effectuées en duplicate.In des études vivo
Des souris mâles de -1 (Charles River; Criffa SA, Barcelone, Espagne) d’un poids moyen de 30g ont été utilisées dans l’expérience. Les souris étaient logées dans des boîtes standard avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Toutes les procédures sur les animaux ont été supervisées et approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de l’Université Rovira i Virgili.
Des souris ont été rendues neutropéniques un jour avant l’infection par une injection intrapéritonéale (i.p.) de 200 mg/kg de cyclophosphamide (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelone, Espagne) plus une injection intraveineuse (i.v.) injection de 5-fluorouracile (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelone, Espagne) à 150 mg/ kg.10,14 Le jour de l’infection, des souris ont été défiées i.v. avec 1×108CFU/animal de chacune des deux souches de C. guilliermondii, UTHSC 11-685 et UTHSC 11-142, dans 0,2 ml de solution saline stérile dans la veine latérale de la queue.3,4
Des groupes de huit animaux ont été établis au hasard pour chaque souche et chaque médicament. Les groupes ont été traités comme suit: désoxycholate d’amphotéricine B (AMBd) (Pharmacie Xalabarder, Barcelone, Espagne) à des doses de 0,8 mg/ kg i.v. une fois par jour (QD); amphotéricine B liposomale (LAMB) (Gilead Sciences S.A., Madrid, Espagne) à 10 mg/kg i.v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Espagne) à 25 mg/kg par voie orale (p.o.) par gavage, deux fois par jour (BID); et AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Royaume-Uni) à 10 mg / kg de poids corporel / dose i.p., QD. Tous les traitements ont commencé 24h après le défi et ont duré 7 jours. Les témoins n’ont reçu aucun traitement. Pour prévenir les infections bactériennes, toutes les souris ont reçu 5 mg / kg de ceftazidime par jour par voie sous-cutanée des jours 1 à 7 après l’infection. Des souris ont été contrôlées quotidiennement et ont été euthanasiées au jour 8 après l’infection par anoxie au CO2. L’efficacité de chaque médicament a été évaluée par une réduction de la charge tissulaire et des études histopathologiques. Les reins ont été retirés de manière aseptique et l’un d’eux a été pesé et homogénéisé dans 2 ml de solution saline stérile. Des dilutions en série de 10 fois des homogénats ont été plaquées sur du PDA et incubées pendant 48h à 35°C pour le calcul de l’UFC/g. Pour l’étude histopathologique, le rein restant a été fixé avec du formol tamponné à 10%, déshydraté, incorporé à la paraffine et découpé en sections de 2 µm, qui ont été colorées avec de l’hématoxyline–éosine (H-E) et une tache périodique d’acide-Schiff (PAS) pour examen par microscopie optique.
Statistiques
Les dénombrements de colonies de tissus ont été analysés à l’aide du test U de Mann–Whitney, à l’aide de Graph Pad Prism 4.0 pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Lorsque les valeurs de P étaient inférieures à 0,05, les différences étaient considérées comme statistiquement significatives.
Résultats Des études in vitro
Les CMI de l’AMB étaient de 0,25 à 1 µg/ml, de 0,06 à 0,25 µg/ml pour l’AFG et de 0,5 à 1 µg/ml pour le FLC. À la suite des seuils de sensibilité à l’AMB, au FLC et à l’AFG contre C. guilliermondii16, tous les isolats étaient sensibles aux trois médicaments. Les susceptibilités des souches de contrôle de la qualité se situaient dans les plages acceptées.6
La cinétique de destruction de l’AMB a montré une activité fongicide rapide qui a augmenté avec la concentration du médicament. À des concentrations équivalentes à la CMI, ce médicament a montré un effet fongicide contre trois des quatre isolats testés (Fig. 1). Cette activité a commencé immédiatement après l’inoculation à des concentrations supérieures à 1µg/ml, le paramètre fongicide étant atteint après 4h à 32µg/ml. L’AFG à des concentrations supérieures à 0,5 µg/ml a montré une activité fongicide à partir de 4h d’incubation. Le paramètre fongicide a été atteint après 12-24h d’incubation à 32µg/ml (Fig. 2). Le FLC a montré une activité fongistatique contre les quatre isolats (Fig. 3).
Essais cinétiques de destruction temporelle de l’AMB contre quatre souches de C. guilliermondii. (■) 0,03 µg / ml, (▴) 0,12 µg / ml, (□) 0,5 µg / ml, (○) 1 µg / ml, (Δ) 2 µg / ml, (▿) 8 µg/ ml, (♦) 32 µg/ ml, (●) contrôle. Les lignes pointillées représentent une diminution de la croissance de l’UFC de 3 unités log10 par rapport à l’inoculum initial (activité fongicide), les lignes pointillées indiquent la limite de quantification du test.
Essais cinétiques de destruction temporelle de l’AFG contre quatre souches de C. guilliermondii. (■) 0,03 µg / ml, (▴) 0,12 µg / ml, (□) 0,5 µg / ml, (○) 1 µg / ml, (Δ) 2 µg / ml, (▿) 8 µg/ ml, (♦) 32 µg/ ml, (●) contrôle. Les lignes pointillées représentent une diminution de la croissance de l’UFC de 3 log10 unités par rapport à l’inoculum initial (activité fongicide), les lignes pointillées indiquent la limite de quantification du test.
Essais cinétiques de destruction temporelle de FLC contre quatre souches de C. guilliermondii. (■) 0,03 µg / ml, (Δ) 0,12 µg / ml, (□) 0,5 µg / ml, (●) 1 µg / ml, (Δ) 2 µg / ml, (▿) 8 µg/ ml, (♦) 32 µg/ ml, (●) contrôle. Les lignes pointillées représentent une diminution de la croissance de l’UFC de 3 unités log10 par rapport à l’inoculum initial (activité fongicide), les lignes pointillées indiquent la limite de quantification du test.
Études in vivo
L’AGNEAU à 10 mg / kg était le seul médicament capable de réduire la charge fongique dans les reins de souris infectées par chacune des deux souches, étant la réduction significativement plus élevée que celle des autres thérapies (P≤0,04). L’AMBd et la FLC n’ont pu réduire la charge tissulaire que chez les souris infectées par la souche présentant les CMI les plus faibles pour ces deux médicaments, soit 0,25 µg/ml pour l’AMB et 0,5 µg/ml pour la FLC (P≤0,008). Dans le cas de l’AFG, la réduction de la charge fongique était modeste et inférieure à celle de l’AMBd, et elle réduisait de manière significative la charge tissulaire dans le rein uniquement par rapport au groupe témoin de la souche UTHSC 11-685 (P = 0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 et FLC 50; cP0.05 contre AFG 10 et FLC 50.
L’étude histologique a montré une infiltration focale de cellules fongiques dans les reins d’animaux non traités et chez des souris traitées par AMBd, FLC ou AFG. Les reins de souris traitées avec de l’AGNEAU n’ont montré qu’une légère invasion fongique. Des signes de nécrose, de réponse inflammatoire ou d’altérations du parenchyme n’ont pas été observés chez les témoins ni chez les animaux traités (Fig. 5).
Présence d’infiltration fongique (flèche noire) dans la section rénale d’une souris témoin infectée par C. guilliermondii, 8 jours après l’infection (coloration périodique de Schiff acide, grossissement 1000×). Barre = 10 µm.
Discussion
Les études in vitro n’ont pas révélé de diminution de la sensibilité des isolats de C. guilliermondii au FLC ou à l’AFG. En accord avec les études précédentes, les courbes de destruction temporelle de l’AMB ont montré une activité fongicide dépendante de la concentration contre tous les isolats, 4, 5, 7 et FLC ont montré un effet fongistatique quelle que soit la concentration testée.7 Il est connu que l’AMBd présente une efficacité supérieure à sa formulation lipidique, en particulier dans le rein, lorsqu’il est administré les deux aux mêmes doses.1 Cependant, des études pharmacocinétiques ont montré qu’après l’administration de 0,75 mg/kg d’AMBd, la Cmax d’AMB atteinte dans le sérum de souris était de 0,30µg/ml.25 Cependant, l’AMBIC de l’un des deux isolats testés est supérieur à cette valeur; par conséquent, nous avons utilisé une dose élevée d’AGNEAU afin d’atteindre des concentrations plus élevées.1 En effet, l’administration d’AGNEAU à 10 mg/kg s’est avérée efficace pour réduire la charge fongique des deux souches. Ce fait est corrélé avec les courbes de mise à mort, où l’AMB a atteint son activité fongicide contre les deux isolats testés in vivo, à des concentrations de 1µg/ml. À notre connaissance, il s’agit de la première étude qui a tenté d’établir une relation entre la cinétique de destruction et l’efficacité expérimentale in vivo de l’AFG et du FLC contre les isolats cliniques de C. guilliermondii. Seule une étude antérieure sur les échinocandines existe, en particulier sur la caspofungine (CFG) dans l’infection disséminée par C. guilliermondii. La CFG à 1mg/ kg s’est avérée efficace pour réduire la charge fongique rénale chez les souris infectées par une souche de C. guilliermondii avec une CMI de 8µg /ml, tandis que la destruction temporelle a révélé qu’aucune activité fongicide n’était atteinte à des concentrations de 64µg/ml.4 Inversement, notre étude a montré une activité dépendante de la concentration de l’AFG, qui à 32µg/ml exerçait une activité fongicide, comme indiqué précédemment, 17 à 24h et à 8µg/ml. Des études antérieures ont rapporté des concentrations d’AFG dans le sérum et les reins d’environ 13 µg / ml après 7 jours de traitement à des doses de 10 mg / kg.21 Ici, l’AFG n’a pu réduire que modestement la charge fongique dans les reins de souris neutropéniques infectées par l’une des deux souches testées, ce qui ne semble pas être lié à la faible différence de MIC d’AFG entre les deux souches testées (1 dilution), suggérant que la réponse au traitement par AFG est dépendante de la souche. De même, le FLC n’a également pu réduire que légèrement la charge fongique dans les reins de souris défiées par l’une des deux souches malgré la dose administrée qui atteint des concentrations sériques supérieures aux MICS2, ce qui n’était pas surprenant non plus en raison de son activité fongistatique.
En conclusion, notre étude a montré une activité et une efficacité plus élevées de l’AGNEAU contre les deux souches de C. guilliermondii, contrairement au faible effet de la FLC et de l’AFG. Cependant, d’autres études portant sur un plus grand nombre d’isolats de C. guilliermondii représentant un plus large éventail de CMI AFG devraient être menées pour évaluer s’il existe une relation entre les valeurs de CMI et l’efficacité de l’AFG.
Conflit d’intérêts
Aucun à déclarer.
