Préparation de composants protéiques en vue de la reconstitution

Des composants de l’appareil de traduction d’E. coli, y compris des facteurs de traduction et des AAR, ont été préparés comme précédemment décrit46. La préparation des composants de l’ARnseP, de l’ARN M1 et de la protéine C5 a également été préparée comme décrit précédemment 29. Nous avons modifié le protocole de la protéine C5 en la précipitant avec du sulfate d’ammonium saturé à 80% et en la dissolvant par dialyse contre le tampon A (acétate de sodium 50 mM pH 6,5, EDTA 5 mM, NaCl 0,25 M et 2-mercaptoéthanol 7 mm). Le précipité obtenu a été récupéré par centrifugation et dissous par dialyse contre le tampon B comprenant 50 mm d’HEPES-KOH pH 7,6, 100 mm de NH4Cl, 6 M d’urée et 10 mm de dithiothréitol (DTT). Les protéines dissoutes ont été appliquées sur une colonne HiTrap SP HP de 5 mL (#17115101, GE Healthcare, USA), lavées avec du tampon B contenant 7 mm de 2-mercaptoéthanol en remplacement de 10 mm de DTT, et éluées avec un gradient linéaire de 100 mM à 2 M de NH4Cl dans le tampon B. Des fractions contenant de la protéine C5 ont été analysées par SDS-PAGE, récupérées, dialysées contre le tampon D (50 mm HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 MM MgCl2 , 2 M d’urée, 7 mm de 2-mercaptoéthanol), puis encore dialysé contre le tampon D sans urée. Les solutions résultantes ont été concentrées à l’aide d’un Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) et dialysées contre le tampon D sans urée contenant 50% de glycérol. La protéine C5 purifiée a été stockée à -30 °C. On note que l’on peut partager l’ensemble des plasmides sur demande.

Préparation d’enzymes de modification pour les IVTTRNA

Les enzymes de modification pour les IVTTRNA ont été préparées comme suit. Les gènes d’E. coli de TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE et GidA ont été amplifiés à partir du génome d’E. coli A19 à l’aide d’amorces appropriées (Données supplémentaires 5). Les gènes amplifiés de TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE et GidA ont été clonés dans pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) en tant que petites protéines de fusion de protéines modificatrices de type ubiquitine (SUMO) où les enzymes His-tag, SUMO protein et modification étaient disposées en tandem. Les gènes de TsaB et de TrmD ont été clonés dans pET15b en tant que protéine de fusion His-tag. Tous les gènes ont été clonés avec la technique d’assemblage Gibson (#E2611, New England Biolabs, USA). Les plasmides résultants ont été transformés en une souche d’E. coli BL21 (DE3) et cultivés dans un milieu de 1 L LB jusqu’à un OD660 de 0,6–1,0 à 37 °C. La surexpression a été induite par l’addition d’IPTG à une concentration finale de 1 mM pour TsaB, TsaC, TsaD, TsaE et TrmD, ou de 0,1 mM pour GlyA, MnmC, MnmE et GidA. Après 3 h de culture à 37°C, les cellules ont été récoltées. Les cellules surexprimées TsaB, TsaC, TsaE, TrmD et MnmE ont été remises en suspension dans 40 mL de tampon de lyse (Hepes-KOH de 50 mM, pH 7,6, NH4Cl de 1 M, MgCl2 de 10 mM et mercaptoéthanol-2 de 7 mm) et perturbées par sonication. Le lysat résultant a été centrifugé et le surnageant a été récupéré et mélangé avec 5 mL de résine de purification complète His-tag (#05893801001, Roche, Suisse) pendant 1 h avec rotateur. La résine a été lavée avec 100 mL de tampon de Lyse puis la protéine a été éluée avec 25 mL de tampon d’élution (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mm KCl, 10 mm MgCl2, 400 mm imidazole et 7 mm 2-mercaptoéthanol). TsaB et TrmD ont été concentrés par Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) puis dialysés contre du tampon stock (Hepes-KOH 50 mM, pH 7.6 500 mm de KCl, 10 mm de MgCl2, 7 mm de 2-mercaptoéthanol et 30% de glycérol). Ils ont été surgelés à l’azote liquide et stockés à -80 °C. Pour TsaC, TsaE et MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) a été ajouté aux fractions récupérées à une concentration finale de 23 µg/ml pour éliminer la protéine SUMO marquée His. Les fractions ont été dialysées contre du tampon de clivage (Hepes-KOH 50 mM, pH 7,6, 100 mm KCl et 7 mm 2-mercaptoéthanol) pendant une nuit tandis que le tampon de clivage contenait 500 mM KCl pour la préparation du MnmE. Les échantillons dialysés ont de nouveau été mélangés avec 5 mL de résine de purification complète His-tag avec rotateur. Ensuite, les fractions de passage contenant des enzymes de modification ont été collectées. Les échantillons récupérés ont été concentrés par Amicon Ultra 3 kDa pour TsaE ou Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) pour TsaC et MnmE. Ils ont été dialysés contre du tampon Stock, surgelés à l’azote liquide et stockés à -80 ° C. Pour la préparation de GlyA, tout le tampon contenait 10% de glycérol et les autres procédures étaient les mêmes que la préparation de MnmE. Le TsaD s’est avéré insoluble après sonication. Par conséquent, la protéine a été granulée par centrifugation à 20 400 ×g à 4 ° C pendant 45 min et elle a été remise en suspension dans du tampon de lyse additionné de Triton X-100 à 4%. La suspension est à nouveau granulée par centrifugation à 20 400 × g pendant 45 min. Le culot est dissous avec du tampon de lyse additionné d’urée 6 M. L’autre procédure était la même que la préparation MnmE sauf que tous les tampons contenaient 2 M d’urée. Pour la préparation de MnmC, toutes les étapes jusqu’à l’élimination de la protéine SUMO marquée par His étaient les mêmes que pour la préparation de GlyA. Comme le MnmC est lié de manière non spécifique à la résine de purification His-tag, la purification par chromatographie échangeuse d’anions a été choisie. La solution après traitement Ulp1 a été dialysée contre du tampon IEX (Hepes-KOH 50 mM, pH 7,6, 100 mm KCl, 10 mm MgCl2 et 7 mm 2-mercaptoéthanol) puis appliquée sur une colonne HiTrap Q HP de 5 mL (#17115401, GE Healthcare, USA). La colonne a été lavée avec 25 mL de tampon IEX puis MnmC a été éluée avec un gradient de liner de 100 mM à 1 M KCl en tampon IEX. Les fractions contenant du MnmC ont été concentrées par Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dialysées contre tampon Stock, surgelées à l’azote liquide, et stockées à -80°C. Nous notons que nous pouvons partager l’ensemble des plasmides sur demande.

Préparation des gènes de l’iVTtRNA

pour chaque iVTtRNA (Données supplémentaires 1) ont été clonés dans le vecteur pGEMEX-1 (#P2211, Promega, USA) entre les sites de restriction XbaI et BamHI. En utilisant les plasmides résultants comme modèles, les modèles d’ADN pour la transcription in vitro ont été amplifiés par PCR en utilisant une amorce promotrice T7 comme amorce directe et des amorces inverses appropriées pour chaque iVTtRNA (Données supplémentaires 1). Chaque amorce inverse contenait une modification de 2′-méthoxy au niveau du deuxième nucléotide à partir de l’extrémité 5′ pour empêcher l’ajout indépendant de la matrice d’un nucléotide supplementaire28. Les produits ont été purifiés par extraction phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24:1), suivie d’une précipitation à l’éthanol, et les précipitants ont été dissous dans l’eau. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Des composants de la RNase P composés de protéine C5 et d’ARN M1 ont ensuite été ajoutés aux mélanges réactionnels à 150 nM pour l’élimination des 27 nucléotides supplémentaires, et les réactions ont été incubées pendant 1 h à 37 ° C. Les IVTTRNA transcrits ont ensuite été traités par extraction au phénol acide suivie d’une extraction chloroforme / alcool isoamylique (10:1), puis purification par chromatographie échangeuse d’anions. Des échantillons contenant des IVTTRNA ont été chargés sur des colonnes HiTrap Q HP de 10 mL (#17115401, GE Healthcare, USA) et lavés avec du tampon Q (HEPES-KOH pH 7,6 de 20 mM et KCl de 200 mM). Les IVTTRNA ont été élués avec un gradient linéaire de 200 mM à 1 M KCl dans le tampon Q. Les fractions contenant des IVTTRNA cibles, déterminées par urée-PAGE, ont été récupérées par précipitation à l’isopropanol, et les IVTTRNA précipités ont été dissous dans l’eau et stockés à -80 ° C jusqu’à utilisation. Nous notons que nous pouvons partager tous les plasmides sur demande.

Modification de l’iVTtRNA

La modification t6A37 a été effectuée dans le mélange réactionnel contenant 50 mm d’Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mm pyridoxal-5′-phosphate, 1 mm Ser, 1 Mm Gly, 36,4 µM SAM, 0,1 unité / µL inhibiteur de RNase recombinante (#2313 A, TaKaRa, Japon), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2,5 µM MnmC, 6 A260 unité / mL tRNAGluUUC ou tRNAGluCUC. Après incubation à 37°C pendant 2 h pour la modification t6A37 et m1G37 ou 4 h pour la modification mnm5U34, les ARNT ont été traités par extraction au phénol acide suivie d’une extraction chloroforme/alcool isoamylique (10:1) et récupérés par précipitation à l’isopropanol. Les ARNT précipités ont été dissous dans l’eau et stockés à -80 °C. Pour la modification mnm5U34, la réaction a de nouveau été effectuée avec des ARNT récupérés. Ils ont été traités avec une extraction au phénol acide suivie d’une extraction au chloroforme / alcool isoamylique (10: 1), dessalés par des colonnes MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, USA) et récupérés par précipitation à l’isopropanol. Les ARNT précipités ont été dissous dans l’eau et stockés à -80 °C. Pour quantifier l’efficacité de modification, on a utilisé 57,1 µM Thr au lieu de 1 mm Thr et le mélange sans TsaD a été utilisé comme témoin pour la modification du t6A37. 36.4 µM de S-adénosyl-Méthionine ont été utilisés et le mélange sans TrmD a été utilisé comme témoin pour la modification de m1G et sans GidA a été utilisé comme témoin pour la modification de mnm5U34. Après incubation à 37 °C, des aliquotes (10 µL) ont été prélevées et repérées sur des disques filtrants Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Les disques filtrants ont été lavés deux fois avec du TCA à 10%, puis de l’éthanol, suivi d’une mesure de la radioactivité par un compteur à scintillation liquide. Pour la quantification de la modification mnm5U, les ARNT ont été purifiés comme ci-dessus, puis 0,02 unité A260 a été repérée sur les disques filtrants à la place.

Aminoacylation

Des expériences d’aminoacylation ont été réalisées selon un rapport précédent47. Les mélanges réactionnels (10 µL) contenaient 100 mm HEPES-KOH pH 7,6, 15 mm MgCl2, 40 mm KCl, 1 mm DTT, 4 mm ATP, 1 unité/µL inhibiteur de RNase recombinante (#2313 A, TaKaRa, Japon), 50 nM ou 1,5 µM aaRS correspondent à chaque acide aminé, 20 µM-acide aminé ou 68 µM Asn pour l’aminoacylation de l’asparagine, et 2 A260 unité/mL d’ARNt. Pour mesurer la méthylation, on utilise à la place un mélange de 0,6 µM Met et de 3,4 µM de L-méthionine froide. La Cys a été obtenue par réduction de la cystine avec 50 mM de DTT à 37 °C pendant 15 min. Pour mesurer la cystéinylation, la concentration de DTT était de 5 mM. Lorsque des mélanges d’ARNt natifs ont été utilisés, 40 mélanges d’ARNt A260 unitaires / mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) ont été ajoutés à la place. Après incubation à 37°C pendant 30 min, des aliquotes (8 µL) ont été prélevées et repérées sur des disques filtrants Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Les disques filtrants ont été lavés deux fois avec du TCA à 10%, puis avec de l’éthanol, suivi d’une mesure de la radioactivité par un compteur à scintillation liquide.

La synthèse d’octapeptides avec le système PUR

Des modèles d’ADN codant pour les octapeptides ont été amplifiés par PCR avec des amorces appropriées (Données supplémentaires 2) en utilisant le vecteur pURE1 (#PUREV001, Biocomer, Japon) contenant une séquence promotrice T7 et le site de liaison du ribosome (séquence Shine-Dalgarno) comme modèle. Des modèles d’ADN amplifiés ont été purifiés à l’aide d’un kit de purification par PCR QIAquick (#28104, QIAGEN, Allemagne). Les réactions de synthèse d’octapeptides contenaient 50 mm d’HEPES-KOH pH 7.glutamate de potassium de 6, 100 mM, acétate de magnésium de 13 mM, spermidine de 2 mM, TNT de 1 mM, ATP de 2 mM, GTP de 2 mM, UTP de 1 mM, CTP de 1 mM, phosphate de créatine de 20 mM, acide 10-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de 10 µg / mL, ribosome de 0,2 µM, matrice d’ADN de 4 nM, composants protéiques du système PUR, y compris les facteurs de traduction et les enzymes, les acides aminés et les ARNT. Les concentrations de composants protéiques du système PUR étaient celles décrites dans un protocole précédent46. Nous notons que les 20 AAR ont tous été inclus dans cette expérience, quels que soient les modèles d’ADN et les codons de test. La composition et la concentration des acides aminés, qui dépendent des codons d’essai, sont énumérées dans les Données supplémentaires 2. La composition des IVTTRNA dépend du modèle, et les réactions ont été effectuées en utilisant des IVTTRNA basaux (Données supplémentaires 2) en présence ou en l’absence d’IVTTRNA de test (Données supplémentaires 2). La concentration de chaque iVTtRNA a été fixée à 6 µM. Lorsque des mélanges d’ARNt natifs ont été utilisés, 56 mélanges d’ARNt A260 unitaires / mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) ont été ajoutés à la place. Des réactions ont été effectuées pendant 60 min à 37 °C et des aliquotes ont été prélevées, repérées sur des papiers filtres Whatman 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, USA), bouillies dans du TCA à 10% à 90 °C pendant 30 min pour désacyler des aminoacyl-ARN. La radioactivité dans la fraction insoluble de 10% de TCA a été mesurée avec un compteur de scintillation liquide.

Synthèse de protéines avec le système PURE

Des expériences de synthèse de protéines ont été réalisées avec un kit PUREfrex 2.0 (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japon) sans mélanges d’ARNt en Solution I (mélange tampon). Nous avons également ajouté 0.2 µM Met, matrice d’ADN amplifiée par PCR à 4 nM pour l’expression de DHFR ou de sfGFP (Données supplémentaires 3), et une quantité spécifiée de mélange d’iVTtRNA ou de mélange d’ARNt natif. Des réactions ont été effectuées à 30 ou 37 °C pendant 12 h, et des protéines synthétisées ont été analysées.

Analyse de protéines synthétisées

Le DHFR et le sfGFP synthétisés contenant du Met radioactif ont été analysés par une PAGE SDS à 15%, et l’image du gel a été visualisée à l’aide d’un analyseur de bio-imagerie BAS-5000 (GE Healthcare, USA). L’analyse temporelle de l’expression du sfGFP a été réalisée en mesurant la fluorescence du sfGFP toutes les 3 min à l’aide d’un système StepOne qRT-PCR (#4376373, Applied Biosystems, USA). Des images de fluorescence du sfGFP synthétisé dans des mélanges réactionnels ont été obtenues à l’aide d’un instrument LAS-4000 (GE Healthcare, États-Unis). L’activité du DHFR synthétisé a été mesurée comme décrit précédemment 44. Les mélanges réactionnels (2 mL) contenaient 50 mm MES-KOH pH 7,0, 25 mm TRIS-HCl pH 7,0, 25 mm éthanolamine, 100 mm NaCl, 10 mm 2-mercaptoéthanol, 0.1 mm d’EDTA, 100 µM d’acide dihydrofolique et une aliquote de 10 µL du mélange réactionnel PUR, et ils ont été incubés à 37°C pendant 15 min. Ensuite, 20 mm de NADPH ont été ajoutés à une concentration finale de 200 µM, et la diminution de l’absorbance à 340 nm a été mesurée sur une période de 10 min avec un spectrophotomètre V-550 (Jasco, Japon). Une unité de DHFR a été définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour traiter 1 µmol d’acide dihydrofolique en 1 min à 37 °C.

L’analyse LC-MS des protéines synthétisées

DHFR avec la séquence FLAG à son terminus (Données supplémentaires 3) a été synthétisée avec un PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japon) sans mélanges d’ARNt en Solution I (mélange tampon). Nous avons également ajouté un modèle d’ADN amplifié par PCR à 4 nM pour le DHFR marqué avec une séquence de DRAPEAU à son extrémité C (Données supplémentaires 3) et une quantité spécifiée de mélange d’iVTtRNA ou de mélange d’ARNt natif. Les réactions ont été effectuées à 30 °C pendant 12 h. Le DHFR synthétisé a été purifié avec des billes magnétiques Anti-DRAPEAU M2 (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Des aliquotes (55 µL) des mélanges réactionnels ont été mélangées à 245 µL du tampon de lavage de DRAPEAU (Hepes-KOH 50 mM, pH 7.6, NaCl de 150 mm, Mg 20 Mm (OAc) 2), puis mélangé avec des billes de 30 µL pendant 1 h. Les billes ont été lavées avec 210 µL du tampon de lavage de DRAPEAU suivi d’un lavage avec le tampon sans Mg (OAc) 2 deux fois (210 µL et 180 µL). Ensuite, le DHFR a été élué avec 50 µL du tampon FLAG wash sans Mg (OAc) 2 mais complété par 100 µg / mL de peptide 3xFLAG (#F4799, Sigma-aldrich, USA) après mélange doux pendant 1 h. La préparation des échantillons pour l’analyse LC-MS a été effectuée selon un protocole assisté par un surfactant à transfert de phase (PTS) 48. Les 4 µL d’un tampon PTS dense (100 mm de désoxycholate de sodium, 100 mm de N-lauroylsarcosinate de sodium et 500 mm de NH4HCO3) ont été ajoutés à 40 µl des échantillons élués. Ils ont été réduits avec du TCEP de 10 mM à 37 °C pendant 30 min, alkylés avec de l’iodoacétamide de 20 mM à 37 °C pendant 30 min et trempés avec du Cys de 20 mM. Chaque solution réactionnelle a été divisée en deux parties. Une a été digérée par 10 ng/µl de Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) et 10 ng/µl de trypsine (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) à 37 °C pendant la nuit. L’autre a été digéré par 10 ng/µl d’Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) à 37 °C pendant la nuit. Après digestion, de l’acide trifluoroacétique (TFA) à 10% a été ajouté à une concentration finale de 1%, et les solutions réactionnelles ont été centrifugées à 15 000 × g pendant 5 min pour précipiter les détergents. Les surnageants ont été dessalés à l’aide de pointes d’étape auto-préparées 49 et séchés avec SpeedVac. L’analyse LC-MS a été réalisée à l’aide d’un spectromètre de masse Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) équipé d’une source d’ions nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) et d’un système nano-LC (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). Les mélanges peptidiques séchés ont été dissous dans une solution contenant 5% d’acétonitrile et 0,1% de TFA, et chaque échantillon a été appliqué sur le système nano-LC. Les peptides ont été concentrés à l’aide d’une colonne piège (#164535,0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) puis séparés à l’aide d’une colonne nano capillaire (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japon) utilisant deux phases mobiles A (acide formique à 0,1%) et B (acétonitrile et acide formique à 0,1%) avec un gradient (5% B pendant 5 min, 5-45% B en 45 min, 45-90% B en 1 min et 90% B en 4 min) à un débit de 500 nL/min. L’élution a été directement électroluminescente (2,2 kV) dans le MS (mode positif, plage de balayage de 200-1500 m/z, résolution de 60 000 FWHM) 50.