TEXTE
Le traitement du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) a été compliqué par l’augmentation des taux de résistance aux antibiotiques. Les souches de SARM expriment la protéine de liaison à la pénicilline 2a (PBP2a), codée par la mecA, qui fournit une résistance aux β-lactames en protégeant la sérine réactive dans une fente étroite et inaccessible, permettant à la synthèse de la paroi cellulaire de se poursuivre en présence d’antibiotique (1, 2). Le ceftobiprole et la ceftaroline sont des céphalosporines anti-SARM qui inhibent le PBP2a à des concentrations thérapeutiquement utiles. Le groupe R2 du ceftobiprole s’étend dans la fente étroite de PBP2a pour accéder au site actif, tandis que la liaison à la ceftaroline provoque un changement allostérique de PBP2a, révélant le site actif pour la liaison par une deuxième molécule (3, 4). Le Ceftobiprole a été évalué dans des essais cliniques et la ceftaroline est approuvée par la FDA pour le traitement des infections de la peau et de la structure de la peau, y compris celles causées par le SARM (5-10).
Des études antérieures de notre groupe ont montré que le passage de la souche COL dans le ceftobiprole sélectionne des mutants résistants avec des mutations dans PBP2a (11). Cette étude examine si le passage de la ceftaroline sélectionne également des mutations similaires. Des expériences de passage ont été menées avec deux milieux différents de SARM: COL, un isolat archaïque de résistance homogène de 1961, et SF8300, une souche contemporaine de SARM USA300 de résistance hétérogène. COLnex et SF8300ex, souches dérivées mécA négatives de COLn et SF8300, ont été obtenues par (12) excision du chromosome cassette staphylococcique chromosomique mec (SCCmec) (13). Le mecA de type sauvage a été réintroduit sur le plasmide pYK20 (dérivé du plasmide pAW8 et contenant du mecA de type sauvage cloné à partir du COL) dans le COLnex et le SF8300ex pour des études de passage. Si la mecA était médiatrice de la résistance, le durcissement d’un mutant résistant du plasmide ou son introduction dans un milieu sensible devraient entraîner une perte ou un gain de phénotype, respectivement, permettant de déterminer la contribution de la mecA à la résistance. Les souches et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés dans les tableaux 1 et 2. COLnex (pYK20) et SF8300ex (pYK20) ont été passés en série dans un bouillon de soja tryptique contenant des concentrations croissantes de ceftaroline (Laboratoires forestiers) comme décrit précédemment (11).
- Voir en ligne
- Voir la fenêtre contextuelle
Liste des souches parentales et mutantes utilisées dans les études de passage mécA-positif
- Vue en ligne
- Vue contextuelle
Plasmides utilisés dans les études de passage MÉC positif
Après 28 jours, COLnex (pYK20) et SF8300ex (pYK20) passés dans la ceftaroline ont donné deux mutants, COLnexpT (pYK20COLT*) et SF8300expT (pYK208300T*) (un astérisque indique un plasmide généré lors de la sélection de la ceftobiprole ou de la ceftaroline dans un contexte COL ou SF8300) (tableau 1). Les CMI à la ceftaroline, au ceftobiprole et à d’autres β-lactames (Sigma-Aldrich) ont été déterminées par la méthode de dilution en bouillon selon les normes CLSI (tableau 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT *) a exprimé une résistance élevée à la ceftaroline et au ceftobiprole, avec des CMI de 64 µg/ml et 32 µg/ml, respectivement. SF8300expT (pYK208300T *) a exprimé une résistance de faible niveau au jour de passage 4, avec une CMI de 4 µg/ml, qui est restée inchangée malgré 24 passages supplémentaires (tableau 3 et Fig. 1). Le mutant passé au ceftobiprole précédemment décrit de COLnex (pYK20) (11), COLnexpB (pYK20COLB *), a montré une résistance élevée à la fois au ceftobiprole et à la ceftaroline, avec une CMI de 64 µg/ml pour chacun.
- Vue en ligne
- Vue contextuelle
CMI de médicaments pour les souches mères et mutantes passées MÉC-positives
Émergence de mutants mecA positifs à la ceftobiprole et à la ceftaroline. La résistance au ceftobiprole (BPR) et à la ceftaroline (CPT) a été générée par le passage de souches à des concentrations subinhibitoires de chaque antibiotique dans un bouillon. La concentration de médicament la plus élevée dans laquelle les souches ont augmenté chaque jour est indiquée sur l’axe des ordonnées.
Le plasmide mecA a été séquencé pour des mutations dans des souches passées. Les PBP étant la cible des β-lactames, les pbp1, -2, -3 et -4 ont également été séquencés. Enfin, le GDP et l’acrB ont été séquencés, car des mutations de ces gènes avaient été identifiées chez un mutant résistant au ceftobiprole mécA-négatif du COL(16). Le plasmide pYK208300T* (pYK20 de SF8300ex passé dans la ceftaroline) présentait une mutation ponctuelle unique (de G à A à la position 1339 de la séquence codante) dans la mecA, entraînant un changement d’acide aminé non synonymique, E447K. Aucune mutation n’était présente dans d’autres gènes de PBP, acrB ou GDP (tableau 4).
- Voir en ligne
- Voir la fenêtre contextuelle
Mutations dans des souches mutantes mecA-positives passées avec du ceftobiprole et de la ceftaroline
Plasmide pYK20COLT* (pYK20 de COLnex passé dans la ceftaroline) n’avait pas de mutations dans la mecA. Une mutation ponctuelle (C à T à la position CDS 1327) introduisant la mutation H443Y dans le GDP, une mutation ponctuelle (G à A à la position CDS 466) introduisant la mutation D156N dans le PBP2 et deux mutations ponctuelles (A à G à la position CDS 601 et C à G à la position CDS 723) introduisant des mutations T201A et F241L dans le PBP4 ont été trouvées (tableau 4). Il est à noter que le passage de ceftaroline de COL contenant de la mecA dans son emplacement chromosomique naturel a également entraîné un mutant présentant une résistance élevée mais dépourvu de mutations dans la mecA (données non montrées). L’analyse de séquence de ce mutant passé a révélé une mutation ponctuelle dans pbp2 (G à A à la position CDS 1891), entraînant le changement d’acide aminé G631S, et une dans pbp4 (T à A à la position CDS 414), introduisant une mutation N138K. Ces données indiquent que, même en présence de mecA, la ceftaroline peut sélectionner des mutations dans d’autres gènes, ce qui entraîne une résistance.
Le durcissement de COLnexpB (pYK20COLB*) et SF8300expT (pYK208300T*) de leurs plasmides, chacun présentant des mutations mecA, a diminué les CMI pour tous les β-lactames testés (tableaux 5 et 6). Le durcissement de COLnexpT (pYK20COLT*) de son plasmide, dépourvu de mutations mecA, n’a eu aucun effet sur les CMI (tableau 5). La transformation de pYK20COLB*, qui contient 6 mutations de substitution dans la mecA, en un parent Colnex sensible, donnant le transformateur COLnex (pYK20COLB*), a entraîné une résistance élevée à la ceftaroline et au ceftobiprole. La transformation de pYK208300T *, qui contient la mutation unique E447K dans la mecA, en COLnex, donnant le transformateur COLnex (pYK208300T *), a entraîné une résistance élevée au ceftobiprole (CMI de 64 µg /ml) mais seulement une résistance faible à la ceftaroline (CMI de 4 µg /ml) (tableau 5). La transformation du pYK20COLB* en SF8300ex, donnant le transformateur SF8300ex (pYK20COLB*), a entraîné une résistance élevée à la ceftaroline et au ceftobiprole (CMI de 32 µg/ml pour chacun) (tableau 6). Plusieurs tentatives de transformation de SF8300ex avec pYK208300T * ont échoué.
- Vue en ligne
- Vue contextuelle
CMI de médicaments pour les souches mutantes passées MÉC-positives guéries de plasmides et de souches parentales transduites avec des plasmides de souches passées en arrière-plan COL
- Vue en ligne
- Vue contextuelle
CMI de médicaments pour des souches mutantes passées positives au mecA guéries de plasmides et de souches parentales transduites avec des plasmides de souches passées dans la souche USA300 SF8300 contexte
Un seul changement d’acide aminé à E447 dans le mecA semble jouer un rôle clé rôle dans la résistance. Elle est présente dans le COL transmis par le ceftobiprole (entre autres mutations) (11), c’est la seule mutation mecA dans le SF8300 transmis par la ceftaroline et elle a été rapportée dans des isolats cliniques (17, 18). Structurellement, E447 réside dans le domaine de liaison à la pénicilline de PBP2a et interagit avec le groupe R2 du ceftobiprole et d’autres β-lactames (3, 19). L’E447K a conféré une résistance élevée au ceftobiprole et une résistance faible à la ceftaroline dans le contexte du COLnex, probablement en raison de différences structurelles entre les deux composés. Des mutations multiples dans la mecA entraînent une résistance élevée aux deux antibiotiques (20). Le contexte génétique joue également un rôle. Le SF8300 hétérogène passé dans la ceftaroline a développé une faible résistance au ceftobiprole et à la ceftaroline avec E447K (MIC 4 µg / ml). Cette mutation a été associée à une faible résistance à la ceftaroline dans les isolats cliniques (17).
En conclusion, le passage dans la ceftaroline ou le ceftobiprole sélectionne une mutation E447K dans PBP2a, une mutation trouvée dans des isolats cliniques résistants à la ceftaroline, soulignant son importance dans la médiation du phénotype de résistance (17, 18). Bien que le séquençage du génome entier n’ait pas été effectué, ce qui est une limitation de cette étude, des gènes autres que mecA jouent un rôle car le niveau de résistance différait entre les milieux COL et SF8300 lors de l’introduction de la mutation E447K et le mutant COL passé hautement résistant ne présentait aucune mutation mecA. Bien qu’il en existe probablement d’autres, des mutations dans les gènes codant pour PBP4 et GDP semblent particulièrement importantes, car elles ont été identifiées à plusieurs reprises chez des mutants transmis par le ceftobiprole et la ceftaroline. Le rôle de ces gènes et d’autres est à l’étude active.
