Résumé
La transcription du VIH-1 est régulée par CDK9/cycline T1 qui, contrairement à une kinase typique dépendante du cycle cellulaire, est régulée en s’associant à un petit complexe de protéines ribonucléaires nucléaires 7SK (snRNP). Bien que les composants protéiques de ce complexe soient bien étudiés, le mécanisme de la formation du complexe n’est toujours pas entièrement compris. L’association de CDK9/cycline T1 avec le snRNP 7SK est, en partie, régulée par une phosphorylation réversible de CDK9. Ici, nous présentons un examen complet des kinases et des phosphatases impliquées dans la phosphorylation de CDK9 et discutons de leur rôle dans la régulation de la réplication du VIH-1 et du potentiel d’être ciblé pour le développement de médicaments. Nous proposons une nouvelle voie de régulation de la transcription du VIH-1 via la phosphorylation de CDK9 Ser-90 par CDK2 et la déphosphorylation de CDK9 Ser-175 par la protéine phosphatase-1.
1. Introduction
L’éradication complète de l’infection par le VIH-1 nécessite de nouvelles approches pour induire un provirus VIH-1 intégré qui n’est pas affecté par les médicaments antirétroviraux existants et qui rebondit à la fin du traitement antirétroviral. La latence du VIH-1 peut être le résultat de plusieurs facteurs tels que la carence en protéine activatrice transcriptionnelle du VIH-1 (Tat) ou en activateurs transcriptionnels cellulaires, l’interférence transcriptionnelle avec les promoteurs cellulaires, le site d’intégration défavorable, l’épigénétique et probablement d’autres facteurs. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes d’activation de la transcription du VIH-1 est importante pour la conception de nouvelles thérapies visant à l’induction ainsi qu’à l’inhibition de la transcription du VIH-1. Ici, nous passons en revue les kinases et les phosphatases impliquées dans l’activation de CDK9 / cycline T1 et discutons de la manière dont ces enzymes peuvent être potentiellement utilisées pour inhiber ou activer le VIH-1 pour le développement de futures interventions thérapeutiques pour le traitement des infections à VIH-1.
2. Activation de la transcription du VIH-1 par P-TEFb
La transcription du VIH-1 est activée par la protéine Tat du VIH-1 qui se lie au renflement de l’ARN de GOUDRON, une structure en boucle en épingle à cheveux située à l’extrémité 5′ de tous les transcrits naissants du VIH-1, et recrute CDK9/ cycline T1, un composant du facteur d’élongation positif de la transcription b (P-TEFb) au promoteur du VIH-1 (examiné en détail dans; voir également l’illustration de la Figure 1). Au cours de l’initiation de la transcription, CDK7/cycline H associée à TFIIH phosphoryle Ser-5 dans la séquence heptapeptidique 1YSPTSPS7 répétée 52 fois dans le domaine C-terminal (CTD) de RNAPII. Le RNAPII phosphorylé Ser-5 s’accumule à 20-40 nucléotides (nt) en aval du site de début de transcription, en partie grâce aux actions du complexe de facteur d’élongation à action négative, NELF, et du complexe induisant la sensibilité à la DRB, DSIF. Récemment, il a été démontré que CDK7 associé à TFIIH phosphorylise également des résidus CTD Ser-7, ce qui peut amorcer la phosphorylation de Ser-2 par P-TEFb. Le recrutement de P-TEFb sur le promoteur VIH-1 situé dans la région U3-R-U5 du LTR 5′ est facilité par Tat qui cible CDK9 / cycline T1 sur l’ARN de GOUDRON où la cycline T1 se lie à la boucle riche en G de l’ARN de GOUDRON. Le recrutement de CDK9/ cycline T1 favorise l’élongation de la transcription par l’ARN polymérase II (RNAPII) qui est autrement mise en pause après la synthèse de l’ARN de GOUDRON. La libération de RNAPII de la pause par le complexe P-TEFb s’accompagne d’un capsulage de l’ARNm et d’une perte de NELF. La P-TEFb déclenche l’élongation de la transcription de l’ARN polymérase II (RNAPII) en phosphorylant le facteur d’élongation négatif (NELF) et le complexe induisant la sensibilité à la DRB (DSIF / Spt4 / Spt5), favorisant ainsi la libération de NELF et également la phosphorylation des résidus Ser-2 dans la CTD RNAPII (revue en). Lors de la dissociation de la NELF, le DSIF devient un facteur d’élongation positif et augmente la processivité RNAPII. Bien que la P-TEFb voyage avec le complexe d’élongation, son activité de kinase CTD n’est plus nécessaire une fois que le complexe est libéré de la pause.
Représentation schématique de la régulation de la transcription du VIH-1 par phosphorylation et déphosphorylation CDK9. La figure représente un réseau de facteurs de cellules hôtes interagissant avec Tat qui affectent la phosphorylation de CDK9. Les flèches indiquent la phosphorylation (violet), la déphosphorylation (orange) et la transition des complexes P-TEF et de transcription (noir). CDK2 phosphoryle CDK9 Ser-90. Les chélateurs du fer réduisent l’activité cellulaire de CDK2/ cycline E et inhibent la transcription du VIH-1 (indiquée par la ligne rouge). CDK7 phosphoryle CDK9 Thr-186. La déphosphorylation de Thr-186 par PPM1A ou PP1 facilite la dissociation de CDK9/ cycline T1 du grand complexe P-TEFb et le recrutement de CDK9/ cycline T1 par Tat ou BRD4. BRD4 se lie préférentiellement au CDK9 phosphorylé Ser-175. La déphosphorylation de Ser-175 par PP1 active l’activité de la kinase CDK9 et active la transcription du VIH-1. Le recrutement de CDK9/ cycline T1 par Tat sur l’ARN du GOUDRON conduit à la phosphorylation de NELF qui se dissocie ainsi qu’à la phosphorylation des résidus Ser-2 CTD DSIF et RNAPII, facilitée par la phosphorylation CTD Ser-7. CDK7 dans le cadre de TFIIH phosphoryle les résidus CTD Ser-5 et éventuellement Ser-7. CDK7 phosphoryle également CDK9 Thr-186 et maintient la phosphorylation CDK9 Thr-186 pendant l’allongement de la transcription.
En raison de l’importance du P-TEFb, la régulation doit être maintenue pour assurer le bon fonctionnement. La phosphorylation et la déphosphorylation de sites spécifiques sur CDK9 doivent avoir lieu tout au long du processus de transcription et doivent être étroitement contrôlées. Cette revue se concentre sur la régulation du CDK9 par des modifications de phosphorylation.
3. Composition de la P-TEFb et Son rôle dans l’Activation de la transcription du VIH-1
La P-TEFb est un hétérodimère constitué de la kinase cycline-dépendante 9 (CDK9) et de l’une des cyclines de type C T1, T2a ou T2b dont la cycline T1 est le partenaire le plus abondant. La cycline K, qui était à l’origine considérée comme une cycline mineure de CDK9, est maintenant reconnue comme partenaire de la cycline pour CDK12 et CDK13. Seule la protéine cycline T1 forme efficacement un complexe avec le Tat du VIH-1 lié à l’ARN du GOUDRON. Ceci est dû à la présence d’un résidu de cystéine dans la cycline T1 en position 261 plutôt qu’à une asparagine trouvée dans les protéines de la cycline T2a et T2b. La cycline T1 avec Cys-261 muté se lie au Tat mais est incapable de recruter du Tat sur l’ARN du GOUDRON. L’interaction du Tat avec l’ARN du GOUDRON et la cycline T1 dépend des ions zinc, ce qui nécessite à nouveau la présence de Cys-261.
Il existe deux isoformes fonctionnelles de CDK9: une forme de 42 kDa principalement exprimée dans la rate, le thymus et le testicule et une forme de 55 kDa exprimée dans divers tissus mais à des niveaux significativement plus bas qui est l’isoforme de 42 Kd. Toutes les cyclines s’associent aux deux isoformes de CDK9 et présentent une activité kinase vers la CTD dans RNAPII. Environ la moitié de la P-TEFb se trouve dans un grand complexe inactif lié par l’arNSN 7SK et plusieurs protéines supplémentaires, y compris la protéine 1 inductible par le bisacétamide hexaméthylène (HEXIM1), la protéine LARP7 liée à La et l’enzyme de capsulage de la méthylphosphatase MePCE. La forme de poids moléculaire inférieur de P-TEFb se compose de CDK9 et de cycline T1 et est enzymatiquement active. Le P-TEFb de haut poids moléculaire est inactif en raison de l’HEXIM1 qui introduit sa séquence inhibitrice de PYNT dans le site actif de CDK9.
Le complexe P-TEFb de haut poids moléculaire sert de source de CDK9/cycline T1 pour le recrutement par le Tat VIH-1. Dans les cellules induites par le stress, le complexe CDK9 / cycline T1 se dissocie de la protéine 7 SK ARN / HEXIM1, puis se lie à BRD4 et forme un petit complexe transcriptionnellement actif qui est recruté par divers promoteurs cellulaires. Malgré l’inactivité du grand complexe P-TEFb in vitro, le grand complexe, et non le petit complexe, est important pour l’activation de la transcription du VIH-1 en tant que VIH-1. Tat est en concurrence avec HEXIM1 pour la liaison à la cycline T1 favorisant la dissociation du P-TEFb du grand complexe. Il a également été démontré que la protéine Tat du VIH-1 recrutait un grand complexe P-TEFb sur le promoteur du VIH-1 où l’ARN de GOUDRON était capable de déplacer l’ARN 7 SK et d’activer le P-TEFb.
Tat facilite également la formation d’un complexe de super élongation (SEC) contenant du P-TEFb actif et des facteurs d’élongation supplémentaires et des coactivateurs de transcription. Ces facteurs comprennent AFF4, ENL, AF9 et le facteur d’élongation ELL2. La protéine AFF4 apparaît comme l’échafaudage central qui recrute d’autres facteurs par des interactions directes. AFF4 lie la cycline T1, ELL2 et ENL ou AF9 agissant comme un pont qui relie ce complexe à P-TEFb. Grâce aux fonctions de pontage de Tat et AFF4, P-TEFb et ELL2 se combinent pour former un complexe d’élongation bifonctionnel qui active considérablement la transcription du VIH-1. Sans Tat, AFF4 peut médier l’interaction ELL2-P-TEFb, quoique de manière inefficace. Tat surmonte cette limitation en apportant plus d’ELL2 à P-TEFb et en stabilisant ELL2 dans un processus qui nécessite une P-TEFb active.
4. Phosphorylation CDK9
L’activité de la P-TEFb dépend de la phosphorylation de plusieurs résidus de sérine et de thréonine et nous en discuterons ci-dessous et qui sont illustrés dans le modèle CDK9/ cycline T1/Tat de la figure 2.
Structure du complexe CDK9/cycline T1/Tat (modèle basé sur l’APB 3MIA). La représentation dorsale des résidus CDK9 présents dans la structure originale de l’APB est représentée en vert, la cycline T1 — en violet et la Tat — en rouge. La position du cluster Ser/Thr Thr-29, Ser-175, Thr-186 et C-terminal est indiquée. On a également montré le site de liaison à l’ATP et les ions Zn qui facilitent l’interaction Tat-cycline T1.
4.1. Phosphorylation CDK9 C-Terminale
Un groupe de résidus C-terminaux de CDK9 (Ser-347, Ser-353 et Ser-357; Thr-350 et Thr-354) est autophosphorylé et cette phosphorylation est importante pour la liaison de CDK9/cycline T1 à l’ARN du GOUDRON. Ceci a été mis en évidence par l’incapacité de CDK9 tronqué C-terminal actif enzymatiquement à lier l’ARN du GOUDRON. La CDK9/cycline T1 recombinante autophosphorylée in vitro a été déphoshorylée efficacement par la protéine phosphatase 2A (PP2A) mais pas la protéine phosphatase-1 (PP1). Le traitement par PP2A a également empêché la liaison de CDK9/ cycline T1 à l’ARN Tat et au GOUDRON in vitro. Ces observations ont suggéré que PP2A pourrait cibler l’extrémité C de CDK9 et potentiellement contrôler l’interaction de P-TEFb avec l’ARN du GOUDRON. L’autophosphorylation de CDK9 associée au complexe de préinitiation in vitro a été inhibée par TFIIH. Le PP2A s’est avéré plus tard essentiel pour la transcription basale du VIH-1 in vitro, car la déplétion du PP2A inhibait la transcription basale du VIH-1 et l’ajout de PP2A aux extraits appauvris restaurait la transcription. On pensait que la cible PP2A était Thr-29 (voir ci-dessous), mais cela n’a pas été prouvé avec certitude et l’effet n’a pas été reproduit in vivo. Dans une étude précoce, nous avons observé une légère induction de la transcription du VIH-1 basale mais non induite par le Tat par de faibles concentrations inhibitrices de PP2A d’acide okadaïque. Nous avons également observé une induction de la transcription basale et non de la transcription du VIH-1 activée par le Tat avec la surexpression de la protéine LIS1 qui, in vitro, se lie et inhibe PP2A et interagit avec la protéine Tat du VIH-1. Collectivement, ces études indiquent que PP2A peut réguler la transcription basale du VIH-1 et également contrôler l’interaction du P-TEFb avec l’ARN du GOUDRON par déphosphorylation de l’extrémité C de CDK9.
4.2. Phosphorylation N-terminale Thr-29
La phosphorylation du Thr-29 de CDK9 s’est avérée induite par la protéine Tax HTLV-1. La CDK9/cycline T1 est recrutée sur la LTR chromatinisée du VIH-1 et d’autres promoteurs par BRD4. Ce recrutement de BRD4 était lié à la phosphorylation de CDK9 Thr-29 et à la nécessité d’une déphosphorylation de PP2A par le groupe de John Brady. Cependant, le groupe de Qiang Zhou a rapporté que CDK9 doit être phosphorylé sur Ser-175 pour se lier à BRD4, ce qui a récemment été confirmé par le groupe de Jonathan Karn (voir la discussion détaillée ci-dessous). Le Thr-29 de CDK9 est homologue au Thr-15 sur CDK2, dans lequel la phosphorylation inhibe l’activité de CDK2. En effet, la phosphorylation du Thr-29 inhibe l’activité CDK9 et la transcription du VIH-1. Cependant, nous n’avons pas réussi à détecter la phosphorylation CDK9 Thr-29 dans des cellules traitées avec de l’acide okadaïque qui inhibait à la fois PP2A et PP1 en utilisant une combinaison d’électrophorèse en couche mince Hunter 2D et de spectrométrie de masse à haute résolution qui n’a montré que la phosphorylation du cluster Ser / Thr C-terminal et du Ser-175 dont seule la phosphorylation du Ser-175 a été induite par l’acide okadaïque. Ainsi, la phosphorylation de CDK9 Thr-29 peut ne pas être contrôlée par PP2A et doit être validée davantage pour clarifier son rôle lors de la transcription du VIH-1.
4.3. La boucle T de CDK9 Thr-186 Phosphorylation
La boucle T de CDK9 contient plusieurs sites de phosphorylation, dont Ser-175 et Thr-186 (Figure 2). La phosphorylation du Thr-186 conservé est nécessaire à l’activité enzymatique de CDK9. De plus, l’association de CDK9 / cycline T1 avec l’ARN 7SK snRNP nécessite la phosphorylation Thr-186 de CDK9. Dans les CDK, la phosphorylation de la boucle en T déclenche des changements conformationnels majeurs qui ouvrent une poche de liaison à l’ATP et un site de liaison au substrat rendant les CDK pleinement actifs en tant que kinase.
Récemment, une analyse chimico-génétique utilisant l’inhibition chimique sélective de CDK7 a montré qu’il est seul responsable de la phosphorylation de CDK9 Thr-186 et de la phosphorylation de la CTD Ser-2 dépendante de la P-TEFb et de l’ubiquitylation de l’histone H2B in vivo. Ainsi, CDK7 / cycline H qui a été précédemment identifiée comme kinase activatrice de CDK (CAK) pour les CDK impliqués dans le cycle cellulaire tels que CDK1, 2 et 4 fonctionne également comme CAK pour les CDK impliqués dans la régulation de la transcription qui incluent CDK8, 9, 12 et 13 (examiné dans). L’analyse globale des kinases susceptibles de phosphoryler la boucle T CDK9 à l’aide d’un ARNsi a identifié la kinase Ca(2+)/calmoduline dépendante 1D (CaMK1D) abattue par l’ARNsi a diminué la phosphorylation de Thr-186. En conséquence, l’inhibition par de petites molécules de la voie de signalisation du Ca (2+) a diminué la phosphorylation du Thr-186 et inhibé la transcription du VIH-1 induite par le Tat, mais pas la transcription du HTLV-1 à médiation fiscale. Étant donné que la transcription à médiation fiscale est pilotée par P-TEFb, il reste à étudier plus avant pourquoi seule la transcription du VIH-1 a été affectée.
La phosphorylation du CDK9 Thr-186 peut également être contrôlée par des phosphatases cellulaires. Nos études de la dernière décennie se sont concentrées sur PP1 que nous avons initialement observé pour stimuler la transcription du VIH-1 dépendant du Tat in vitro. Lorsque nous avons surexprimé l’une des principales sous-unités de régulation nucléaire de PP1, NIPP1 (inhibiteur nucléaire de PP1), nous avons observé une inhibition spécifique de PP1 de la transcription du VIH-1 et de la réplication virale. Nous avons remarqué que Tat contient une séquence similaire à un motif RVxF de liaison PP1 conservé et avons montré que ce motif médie la liaison Tat à PP1 in vitro et in vivo et que la mutation des résidus dans le motif de liaison PP1 (V36A et F38A) empêchait Tat d’induire la transcription du VIH-1. Le CDK9 phosphorylé dans des cellules cultivées dopées avec de l’orthophosphate (32P) et traité avec de l’acide okadaïque a été déphophosphorylé efficacement in vitro par PP1 mais pas PP2A contrairement au CDK9 autophosphorylé in vitro qui a été déphosphorylé par PP2A et non par PP1. Ces résultats suggèrent que PP1 peut contrôler la phosphorylation de CDK9 pendant la transcription du VIH-1. En effet, il a été démontré que la sous-unité catalytique alpha de PP1, PP1a, agit de manière coopérative et séquentielle avec la (Ca2+)-calmoduline-protéine phosphatase 2B (PP2B) dans des cellules irradiées aux UV ou traitées à l’hexaméthylène bisacétamide (HMBA) dans lesquelles la P-TEFb est libérée du complexe snRNP 7SK. Alors que PP2B induit un changement de conformation dans le snRNP 7SK, PP1a déphosphoryle le CDK9 Thr-186 et facilite les libérations de P-TEFb à partir du snRNP 7SK. CDK9 est resté déphosphorylé alors qu’il était associé à BRD4 et a été recruté dans le complexe de préinitiation, où il peut être réactivé par CDK7 associé à TFIIH. Conformément à cette étude, nous avons observé une augmentation de la phosphorylation de CDK9 Thr-186 dans les cellules qui exprimaient de manière stable un peptide inhibiteur de PP1, le domaine central de NIPP1, et avons également observé une association accrue de CDK9 / cycline T1 avec l’ARN 7SK. L’expression stable de cdNIPP1 a perturbé l’interaction entre Tat et PP1 et inhibé la transcription du VIH-1, suggérant qu’un équilibre doit être maintenu entre la phosphorylation et la déphosphorylation de CDK9 Thr-186 et que le déplacement de cet équilibre vers la phosphorylation est inhibiteur pour la transcription du VIH-1. L’expression de cdNIPP1 d’une manière physiologiquement pertinente dans le cadre du génome du VIH-1 au lieu de la nef a inhibé la réplication du VIH-1 de manière puissante, suggérant en outre que des inhibiteurs ciblés par PP1 peuvent être utiles comme traitement anti-VIH-1 potentiel. Alors que PP1 est un candidat à la déphosphorylation du Thr-186, nous avons également constaté qu’il déphosphorylait le CDK9 Ser-175 (voir ci-dessous). Une phosphatase CDK9 Thr-186 supplémentaire, la protéine phosphatase 1A (anciennement 2C) dépendante du magnésium (PPM1A) a été identifiée à l’aide d’une banque d’expression de phosphatase et d’anticorps Thr-186-phosphospécifiques. La surexpression de PPM1A a diminué la phosphorylation de Thr-186 et la déplétion médiée par le siRNA l’a augmentée, et P-TEFb et PPM1A ont également coprécipité ensemble, suggérant que CDK9 peut être un substrat physiologique pour PPM1A. Une étude plus récente a montré que la phosphorylation Thr-186 de CDK9 est diminuée dans les cellules T CD4 (+) au repos qui ne sont pas permissives pour la réplication du VIH-1 et que cette diminution est corrélée à l’abondance de PPM1A et au recrutement limité de CDK9 dans le grand complexe P-TEFb. Cette découverte confirme en outre la nécessité du grand complexe pour la transcription du VIH-1 et le rôle critique de PPM1A dans la suppression du VIH-1 chez les lymphocytes T au repos. Étant donné que l’expression de PPM1A n’a pas été modifiée lors de l’activation des lymphocytes T, des facteurs de régulation inconnus peuvent être impliqués dans la régulation de l’activité de PPM1A.
4.4. Phosphorylation de la boucle T de CDK9 Ser-175
Une fois que CDK9/cycline T1 se dissocie du grand complexe P-TEFb, CDK9 peut devenir phosphorylé sur Ser-175. Alors que la déphosphorylation de la Thr-186 inhibait totalement l’activité de la kinase CDK9/cycline T1, aucune différence n’a été trouvée dans les activités kinases des mutants CDK9 S175A et CDK9 S175D par David Price et ses collègues. En revanche, Qiang Zhou et son groupe ont montré que le mutant CDK9 S175A était inactif, tandis que le mutant CDK9 S175D était actif sous forme de kinase. Ils ont également montré que la phosphorylation de Ser-175 favorise la liaison de CDK9/ cycline T1 à Brd4. Il a été suggéré que la phosphorylation de Ser-175 pourrait provoquer un changement de conformation de CDK9, permettant à BRD4 de se lier à la cycline T1. Dans notre étude récente, nous avons constaté que l’inhibition dynamique de PP1 conduisait à une phosphorylation exclusive de CDK9 Ser-175, déterminée par une combinaison de cartographie peptidique Hunter 2D et d’analyse LC-MS in vivo. L’inhibition de PP1 a conduit à l’inhibition de l’activité CDK9 et à la réduction de la phosphorylation de RNAPII in vitro et in vivo. Nous avons constaté que le mutant CDK9 S175A était actif enzymatiquement et induisait la transcription du VIH-1. Fait intéressant, alors que le mutant CDK9 S175D était moins actif en tant que kinase, il formait plus facilement un petit complexe P-TEFb, en particulier lorsque PP1 était inhibé. Ainsi, nous avons conclu que PP1 active la transcription du VIH-1 en déphosphorylant le résidu CDK9 Ser-175. Nous avons également remarqué que l’activité de phosphorylation de Ser-175 était beaucoup plus abondante que l’activité de Thr-186 dans les extraits cellulaires, ce qui suggère que l’activité de CDK9 peut être naturellement supprimée par la surphosphorylation de Ser-175. Une étude récente du groupe de Jonathan Karn a montré que l’activation des lymphocytes T par le récepteur des lymphocytes T (TCR) ou l’ester de phorbol (PMA) a fortement induit la phosphorylation du CDK9 Ser-175. Sur la base de la modélisation moléculaire, ils ont proposé que le Ser-175 phosphorylé forme une liaison hydrogène avec le Tat Lys-14 renforçant la liaison du Tat au CDK9 / cycline T1 et favorisant l’activation de la transcription du VIH-1. Toujours selon les premières observations, la mutation CDK9 S175A a été trouvée pour abolir la liaison à BRD4. De plus, en accord avec nos observations, le mutant CDK9 S175A a provoqué une réactivation latente du VIH-1 dépendant du Tat, ce que Jonathan Karn et ses collègues ont attribué à l’incapacité de ce mutant de se lier à BRD4 tout en étant capable de se lier au Tat. Ils ont également trouvé que CDK9 phosphorylé au Ser-175 est exclu du complexe RNP 7SK, ce qui est parallèle à notre observation antérieure selon laquelle le mutant phosphomimétique CDK9 S175D a été trouvé dans un petit complexe P-TEFb. Ainsi, cette dernière étude indique que Ser-175 est une cible importante pour la réactivation du VIH-1 et le développement potentiel de thérapies à petites molécules.
Nous avons récemment développé de petites molécules ciblées par PP1 qui ont été modélisées pour s’adapter à la cavité logeant RVxF sur PP1. Nous avons examiné pratiquement environ 300 000 composés, puis nous avons examiné physiquement environ 1 000 composés et identifié un composé hit, le 1H4, qui inhibait la transcription et la réplication du VIH-1 à des concentrations non cytotoxiques. 1H4 a empêché la déphosphorylation médiée par PP1 d’un peptide substrat contenant une séquence RVxF in vitro, a perturbé l’association de PP1 avec Tat dans les cellules cultivées et a empêché la translocation de PP1 vers le noyau. Nous sommes actuellement en train d’affiner le composé hit et de développer également des composés ciblés par PP1 pour l’activation du provirus latent.
4.5. La phosphorylation Ser-90 de CDK9
Nous et d’autres avons montré précédemment que la transcription du VIH-1 est activée par le Tat dans la phase G1, mais pas dans la phase G2. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que Tat pourrait engager une kinase régulatrice du cycle cellulaire, que nous avons montré être CDK2 / cycline E. Le VIH-1 est inhibé dans les cellules de knockdown CDK2 et également dans la différenciation des macrophages à partir de cellules souches pluripotentes induites avec knockdown CDK2, suggérant en outre que CDK2 est important pour la transcription et la réplication du VIH-1. Le lien fonctionnel entre CDK2 et CDK9 a été trouvé lorsque nous avons analysé l’inhibition du VIH-1 par des chélateurs du fer. La transcription du VIH-1 a été inhibée dans les cellules T traitées avec des chélateurs de fer 311 et ICL670 qui ont également inhibé l’activité cellulaire de CDK2 et CDK9. Des chélateurs de fer tridentés à base de di-2-pyridylcétone thiosémicarbazone plus puissants ont inhibé la transcription du VIH-1 et la réplication du virus à des concentrations beaucoup plus faibles que 311 ou ILC670 et ont également inhibé l’activité CDK2 et CDK9. Bien que le mécanisme d’inhibition de CDK2 ne soit pas encore clarifié, il est probable qu’il inclura l’induction de p21 par la régulation à la hausse du facteur 1 induit par l’hypoxie (HIF-1), car l’épuisement du fer élimine le fer de la prolyl hydroxylase et augmente les niveaux de protéines HIF-1 et HIF-2 imitant l’effet de l’hypoxie. Nous avons analysé la phosphorylation de CDK9 par CDK2 in vitro et identifié un motif (90SPYNR94) qui représentait un site de phosphorylation consensuel de CDK2 et qui a été efficacement phosphorylé. La phosphorylation de CDK9 sur Ser-90 a été détectée avec des anticorps phosphospécifiques et elle a été réduite après l’élimination de CDK2. L’association du mutant CDK9 S90A avec le grand complexe P-TEFb a été réduite et sa surexpression a inhibé la transcription du VIH-1. En revanche, le mutant CDK9 S90D a montré une association inchangée avec de grands et petits complexes P-TEFb et induit une transcription du VIH-1 dépendante du Tat. Cependant, le phosphomimétique S90 a montré une diminution globale de l’expression de CDK9 suggérant qu’un équilibre phosphorylation/déphosphorylation doit être maintenu pour former les grands et petits complexes P-TEFb. La modélisation moléculaire a montré que le Ser-90 de CDK9 était situé sur une boucle flexible exposée au solvant, suggérant qu’il pourrait subir une phosphorylation (également visible sur la figure 2). Ainsi, nos études récentes ont identifié un nouveau site de phosphorylation régulatrice sur CDK9 qui pourrait être ciblé pour l’activation ou l’inhibition de la transcription du VIH-1.
5. Conclusion
La phosphorylation et la déphosphorylation de sites spécifiques sur CDK9 se produisent tout au long du processus de transcription et doivent être étroitement contrôlées. Les modifications apportées à certains résidus thréonine/sérine déterminent si CDK9 s’associe à un grand complexe P-TEFb pour devenir disponible au recrutement et si la dissociation du grand complexe se produira efficacement. La phosphorylation de Thr-186 dans la boucle T de CDK9 et de Ser-90 qui se trouve à l’extérieur de la boucle T détermine si CDK9 reste séquestré dans le grand complexe inactif et si la kinase est active enzymatiquement une fois dissociée du snRNP 7SK. La déphosphorylation à l’un ou l’autre de ces sites conduit à la déstabilisation du grand complexe et à la libération de CDK9/Cycline T1, limitant ainsi le recrutement de Tat à la LTR du VIH-1. Les modifications de l’extrémité C du CDK9 permettent la liaison de la cycline T1 : la liaison du GOUDRON et la déphosphorylation à ces sites empêchent la liaison de l’ARN toTAR. En revanche, la phosphorylation au niveau des résidus Thr-29 ou Ser-175 inhibe CDK9. Ainsi, l’image émergente de la régulation du CDK9 par phosphorylation semble être complexe et en partie parallèle à ce qui est connu pour d’autres CDK. Les kinases ciblant CDK9 récemment identifiées, CDK7, CDK2 et les phosphatases, PP1 et PPM1A, apparaîtront probablement comme de nouvelles cibles pour les thérapies anti-VIH-1 et anticancéreuses.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Remerciements
Ce projet a été soutenu par le Centre de Développement du District de Columbia pour la Recherche sur le sida (P30AI087714), le RCMI-NIH 2G12RR003048 du Programme des Centres de Recherche dans les Institutions Minoritaires (RCMI) (Division des Infrastructures de Recherche, Centre National des Ressources de Recherche, NIH), la Fondation Russe pour la Recherche Fondamentale (no. 12-04-91444-NIZ) et le Ministère Russe de l’Éducation et des Sciences (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Les auteurs souhaitent également remercier les membres du Nekhai lab pour leurs suggestions et s’excuser pour ceux dont le travail n’a pas été cité en raison du manque d’espace.
