Hôte fongique

Les champignons filamenteux peuvent servir d’hôtes à une usine microbienne de cellules d’acide carminique, car ils ont la capacité de fournir un approvisionnement suffisant en blocs de construction acétyl-CoA et malonyl-CoA pour la synthèse de l’acide carminique. échafaudage en polykétide. Ils offrent également l’infrastructure cellulaire nécessaire pour accueillir la C-glucosyltransférase UGT28 liée à la membrane ER. Comme A. nidulans possède une boîte à outils de génie génétique bien développée, nous avons choisi cette espèce comme point de départ pour le développement d’une usine de cellules d’acide carminique fongique. Comme la plupart des champignons filamenteux, A. nidulans est capable de produire une pléthore de métabolites secondaires biosynthétiquement divers, y compris un nombre important de polykétides aromatiques. Chiang et coll. ont précédemment démontré que la délétion des groupes de gènes responsables de la formation des principaux produits endogènes de PKS chez A. nidulans11, améliorait le potentiel d’A. nidulans en tant qu’usine cellulaire pour la production hétérologue de polykétides. De cette manière, les pools de blocs constitutifs acétyl-CoA et malonyl-CoA sont augmentés et les analyses chimiques ultérieures pour la formation de nouveaux produits simplifiées. Comme première étape vers une usine de cellules fongiques pour la production d’acide carminique, nous avons donc éliminé les voies biosynthétiques des polykétides aromatiques dominants qui pourraient potentiellement interférer avec la production d’acide carminique et compliquer l’analyse et la purification en aval. Plus précisément, les groupes de gènes pour la production d’asperthécine, de monodictyphénone et de stérigmatocystine ont été éliminés ainsi que les gènes responsables de la formation de pigments de conidies vertes, wA et yA, ont été éliminés dans un fond déficient d’A. nidulans non homologue. Outre l’absence attendue de pigments conidiens, la souche résultante, NID2252, n’a pas montré d’effets visibles sur la morphologie et l’aptitude physique (Fichier supplémentaire, Fig. 1). Nous avons donc utilisé NID2252 comme souche de référence et comme base pour la construction d’une usine de cellules fongiques pour la production d’acide carminique.

Conception d’une voie semi-naturelle pour la formation d’anthrone d’acide flavokermésique

Le principal obstacle à la construction d’une usine microbienne de cellules d’acide carminique était l’absence d’un PKS naturel qui synthétise l’anthrone d’acide flavokermésique, le premier intermédiaire putatif de la voie. Pour contourner cette limitation, nous avons poursuivi une voie biosynthétique alternative pour la production de ce polykétide. L’anthrone de l’acide flavokermésique octakétide, avec son motif de cyclisation en C7-C12, C5-C14 et C2-C15, pourrait en théorie être formé en une seule étape par un PKS itératif fongique non réducteur de type I qui possède un domaine modèle de produit approprié (Fig. 1 à gauche). Cependant, de telles enzymes n’ont pas encore été décrites dans la littérature. Un autre mécanisme de formation de l’anthrone de l’acide flavokermésique est une réaction en deux étapes où un PKS synthétise une chaîne d’octakétide linéaire non réduite, qui est ensuite cyclisée dans la structure souhaitée par des cyclases / aromatases à action trans (Fig. 1 à droite). Des réactions de ce type existent dans la nature, par exemple dans la voie de l’actinorhodine (Act) chez Streptomyces coelicolor12. Dans ce cas, le squelette octakétide est synthétisé par un système PKS bactérien multi-sous-unités de type II, KSa, KSß et ACP (le PKS minimal act), qui est réduit par actKR en position C9 et ensuite plié par l’aromatase/cyclase, actARO/CYC et cyclase actCYC2, pour conduire au composé tricyclique 3,8-dihydroxy-1-méthylanthraquinone-2-acide carboxylique (DMAC) 7. Le DMAC présente le même pli que l’anthrone de l’acide flavokermésique, mais est réduit en position C9.

La cyclase de ZhuI et l’aromatase de ZhuJ de Streptomyces sp présentent un intérêt particulier pour la présente étude. R1128, qui catalysent deux réactions séquentielles de cyclisation de polykétides linéaires non réduits en plis similaires à ceux de l’acide flavokermésique an throne13. Plus précisément, la cyclase de ZhuI est responsable de la fermeture du premier anneau, C7-C12, et l’aromatase de ZhuJ pour la fermeture du deuxième anneau, C5-C14. Le troisième anneau, C2-C15, se forme spontanément. ZhuI et ZhuJ ont déjà été co-exprimés en S. le coelicolor avec l’octakétide formant le type II agit sur des PKS minimes, ce qui entraîne la formation d’acide flavokermésique, connu sous le nom d’acide 3,6,8-trihydroxy-1-méthylanthraquinone-2-carboxylique (TMAC) dans la littérature bactérienne14. Malheureusement, une stratégie identique peut être difficile à mettre en œuvre chez A. nidulans car les PKSS minimaux de type II n’ont pas été mis en œuvre avec succès chez des hôtes hétérologues en dehors du genre Streptomyces malgré plusieurs tentations15. Et en effet, nos tentatives de reconstitution des miniPKS act chez A. nidulans et Saccharomyces cerevisiae se sont également avérées infructueuses (données non présentées). Une autre façon de former l’octakétide non réduit requis consiste à s’appuyer sur des enzymes PKS de type III, qui ont été exprimées avec succès dans la levure, par exemple en relation avec la biosynthèse des flavonoides16. L’octakétide synthase d’Aloe arborescens (OKS), qui a été décrite pour produire des octakétides non réduits qui se replient spontanément en SEK4 et SEK4b dans vitro17, présente un intérêt particulier (Fig. 2 bis). Cependant, chez Aspergillus, il n’a pas été testé si les produits des PKSS de type III, qui sont des enzymes indépendantes de l’ACP qui libèrent des acides carboxyliques, peuvent être repliés par la cyclase de type ZhuI qui a été décrite pour agir sur des substrats liés à l’ACP. Dans la présente étude, nous avons donc entrepris de tester la compatibilité de la plante de type III OKS avec celle des cyclases / aromatases des systèmes bactériens de type II PKS, dans le but de développer une voie biosynthétique artificielle de novo pour la formation du précurseur anthrone de l’acide flavokermésique pour la formation de l’acide carminique.

Production de précurseurs de polykétides pour la production d’acide carminique chez A. nidulans

Pour tester les performances in vivo des OKS chez un hôte fongique, nous avons inséré des OKS contrôlés par le promoteur gpdA d’A. nidulans en une seule copie dans un locus défini (site d’intégration 5, IS5) dans l’A. le génome des nidulans18. Deux souches ont été construites, l’une exprimant la séquence codante native d’OKS et l’autre exprimant une version optimisée en codon pour l’expression chez A. nidulans. Après sept jours d’incubation sur un milieu de croissance solide, voir la section Méthodes pour plus de détails, les deux souches présentaient une forte coloration rouge-brun du mycélium (Fig. 2b). Le profilage métabolique par HPLC-HRMS des souches n’a révélé aucune trace d’octakétide non réduit, mais plutôt les SEK4 et SEK4b attendus ainsi que l’acide flavokermésique et trois autres composés abondants d’identité inconnue (Fig. 2c), qui n’étaient pas présentes dans la souche de référence NID2252. SEK4 et SEK4b ont été identifiés sur la base d’une analyse approfondie HPLC-SGRH/MS (Fichier supplémentaire, Fig. 2) et était conforme aux valeurs précédemment rapportées19 tandis que l’acide flavokermésique a été comparé à une référence authentique isolée de D. coccus9 (Fichier supplémentaire, Fig. 3). Le métabolite éluant à 13,0 min. avait un ion pseudomoléculaire + de m/z 303.0867, correspondent à une formule moléculaire de C16H14O6, compatible avec le produit de shunt d’octakétide connu, la mutactine, précédemment décrit dans des expériences basées sur des Streptomyces avec le groupe de gènes Act 7. Cette identification a été confirmée par une analyse détaillée du spectre UV, et étayée par le temps de rétention relatif à SEK4 et SEK4b (Fichier supplémentaire, Fig. 4). Les deux métabolites supplémentaires avec des formules moléculaires de C16H12O6 (-m/z 299,0566) indiquaient des produits octakétides mais ne correspondaient cependant pas à un produit de shunt commun (Fichier supplémentaire, Fig. 5). Par conséquent, les métabolites ont été isolés et l’élucidation de la structure basée sur des expériences de RMN 1D et 2D les a identifiés comme déshydro-SEK4 (également connu sous le nom de B26 dans la littérature bactérienne) et déshydro-SEK4b20 (Fichier supplémentaire, Figs 6-11). La formation des six nouveaux polykétides observés dans la souche OKS peut s’expliquer par trois réactions spontanées différentes de fermeture du premier cycle : C7-C12 (SEK4, déshydro-SEK4 et acide flavokermésique), C10-C15 (SEK4b et déshydro-SEK4b) et C7-C12 après réduction cétonique en C9 (mutactine) (Fig. 2a et Dossier supplémentaire, Fig. 12). Parmi ceux-ci, seul le premier type de fermeture annulaire (C7-C12) permet la formation ultérieure de l’anthrone d’acide flavokermésique souhaité via une deuxième fermeture annulaire en C5-C14 et une troisième fermeture annulaire en C2-C15. Il a déjà été rapporté que SEK4 et SEK4b se déshydrataient spontanément pour former des sek4 et des SEK4b, respectivement, tandis que la formation de mutactine dépend de la réduction enzymatique de la position en C9 de la chaîne de polykétides avant le repliement21. La formation d’acide flavokermésique, un intermédiaire connu dans la voie de l’acide carminique (Fig. 1), était inattendu car il n’a pas été rapporté que ce métabolite se forme spontanément à partir de chaînes d’octakétide non réduites. Cela suggère que A. nidulans produit naturellement un certain nombre de cyclases / aromatases qui favorisent le motif de pliage souhaité. Le profilage des métabolites des deux souches exprimant l’OKS n’a pas montré de différences substantielles dans les niveaux de production et nous avons décidé de nous concentrer sur la souche exprimant la version native de l’OKS comme base pour les développements ultérieurs d’une usine de cellules fongiques pour la production d’acide carminique.

Ingénierie de la voie de repliement des octakétides non réduits

Le repli promiscuité de l’octakétide non réduit réduit le rendement en acide flavokermésique souhaitable. Nous avons donc envisagé d’augmenter la production d’acide flavokermésique en rationalisant le processus de pliage dans la direction souhaitée en exprimant des versions optimisées en codon de ZhuI et ZhuJ. Pour examiner si ZhuI et ZhuJ interfèrent avec le métabolisme natif d’A. nidulans, nous avons d’abord construit des souches exprimant ZhuI et ZhuJ individuellement et en combinaison à partir de locus génomiques définis (IS6 et IS7) dans le A. souche de référence nidulans NID2252. Le profilage métabolique par HPLC-HRMS des trois souches n’a révélé aucune différence métabolique détectable (Fig. 3b). Nous avons ensuite construit une souche co-exprimant OKS avec ZhuI, qui code les cyclases qui catalysent la formation du premier anneau de fermeture en C7-C12 (Fig. 3 bis). Par rapport à la souche exprimant uniquement OKS, cette souche a montré des augmentations de 2,5, 2,2 et 2,1 fois des niveaux d’acide flavokermésique, de SEK4 et de SEK4 déshydro, respectivement. En accord avec le repliement guidé par ZhuI dans la direction souhaitée, ces changements métaboliques se sont accompagnés de niveaux réduits de métabolites contenant les premiers plis annulaires indésirables (Fig. 3b et tableau 1). Une souche co-exprimant OKS et ZhuJ, qui code pour les aromatases qui catalysent la deuxième fermeture du cycle C5-C14 (Fig. 3a), a produit une augmentation de 2,7 fois des taux d’acide flavokermésique. Cette augmentation s’est accompagnée d’une réduction des niveaux de métabolites avec un premier pli en C7-C12 (SEK4 et dehydro-SEK4), alors que, comme prévu, le niveau de métabolites avec le premier pli en C10-C15 indésirable (SEK4b et dehydro-SEK4b) n’a pas été affecté (Fig. 3b et tableau 1). Enfin, l’analyse de la souche exprimant ZhuI, ZhuJ et OKS a montré une augmentation de 4,1 fois de la production d’acide flavokermésique par rapport à l’expression d’OKS seule. De plus, cette augmentation est supérieure de 60 % à ce qui a été observé avec les souches exprimant OKS en association avec ZhuI ou ZhuJ, respectivement (tableau 1). Ce résultat indique que la cyclase et l’aromatase, de manière additive, sont capables d’augmenter le flux dans la voie artificielle de novo vers le produit désiré, l’acide flavokermésique (Fig. 3b).

Étonnamment, et très encourageante, une analyse métabolique plus poussée de la souche co-exprimant OKS, ZhuI et ZhuJ a révélé que l’augmentation de la formation d’acide flavokermésique s’accompagnait de la production d’acide kermésique (Fig. 4). Par conséquent, A. nidulans fournit la monooxygénase nécessaire à la conversion de l’acide flavokermésique en acide kermésique, qui peut servir d’intermédiaire final dans la voie de l’acide carminique (Fig. 1).

Production d’acide carminique dans A. nidulans

La dernière étape de la formation d’acide carminique implique la C-glucosylation de l’acide kermésique (Fig. 5 bis). L’enzyme responsable de cette étape dans la voie de biosynthèse de l’acide carminique a déjà été identifiée chez D. coccus et caractérisée par une expression hétérologue chez S. cerevisiae8. Nous avons donc inséré le gène codant UGT2, optimisé pour l’expression chez A. nidulans, dans le locus IS4 de la souche de référence NID2252, et pour compléter la voie de biosynthèse semi-naturelle de l’acide carminique chez A. nidulans, dans le même locus de la souche co-exprimant ZhuI, ZhuJ et OKS. L’expression de l’UGT2 seule dans la souche de référence n’a pas affecté l’apparence de la couleur du milieu de croissance ni le profil métabolique d’A. nidulans par rapport à la souche de référence NID2252 (Fig. 5b, c). En revanche, la co-expression d’OKS, de ZhuI, de ZhuJ et d’UGT2 a donné lieu à une coloration rouge du milieu, ce qui suggère qu’un ou des colorants plus solubles dans l’eau se sont formés (Fig. 5b). L’analyse ciblée de la LC-HRMS de cette souche a confirmé la formation d’acide carminique22 (Fichier supplémentaire, Fig. 13), ainsi que dcII9, 23 et un isomère dcII (Fichier supplémentaire, Fig. 14), montrant que UGT2 était fonctionnel en A. nidulans et pourrait compléter avec succès la voie biosynthétique (Fig. 5c). L’identification positive de l’acide carminique et du dcII a été basée sur des temps de rétention similaires, des spectres UV, des modèles de fragmentation MS et MS/ MS pour les étalons purs des deux composés. Trois isomères de l’acide carminique ont été décrits dans la littérature (acide carminique, DCIV et DCVII) par Stathopoulou et al.23, les trois montrent des temps de rétention différents dans l’analyse basée sur LC-MS / MS. Dans notre analyse, nous n’avons détecté que de l’acide carminique et non du DCIV et du DCVII sur la base du temps de rétention et du modèle de fragmentation de l’étalon d’acide carminique authentique isolé de D. coccus (fichier supplémentaire, Fig. 13). Ensemble, nos données démontrent fermement qu’il est possible de produire de l’acide carminique chez A. nidulans sur la base d’une voie semi-naturelle.