Lorsqu’il s’agit de solubiliser et de dénaturer les protéines avant la focalisation isoélectrique et l’électrophorèse sur gel 2D, la plupart des chercheurs choisissent l’urée. Ce n’est pas surprenant car cet agent chaotrope doux peut complètement perturber les interactions entre les molécules de protéines et augmenter l’efficacité de l’activité protéase dans la digestion des protéines tout en empêchant efficacement les protéines de s’agréger et / ou de précipiter. De plus, l’urée est également utilisée pour renaturer des protéines à partir d’échantillons préalablement dénaturés.

Malgré sa popularité en tant que dénaturant protéique efficace, l’utilisation d’une solution d’urée dans la digestion des protéines présente un défi particulier: elle augmente le risque de carbamylation. Pourquoi cela devrait-il vous concerner? Voici quelques raisons pour lesquelles la carbamylation peut nuire à votre expérience et pourquoi elle doit être évitée à tout prix.

1. En plus de bloquer les extrémités N-terminales des molécules protéiques, la carbamylation interfère avec la caractérisation des protéines et les rend indisponibles pour une utilisation ultérieure.
2. Il attaque agressivement les chaînes latérales des résidus d’arginine et de lysine et rend la protéine impropre à la digestion enzymatique.
3. Il entrave la digestion enzymatique des protéines et affecte négativement l’identification et la quantification des protéines dans l’analyse de la SEP.
4. Il confond les résultats obtenus à partir de peptides avec des temps de rétention inattendus et augmente la complexité de l’échantillon.
5. Il réduit l’efficacité de l’ionisation et affecte négativement l’intensité du signal des pics détectés.
6. Il induit une modification du point isoélectrique des protéines et conduit à des résultats artificiels.
7. Il peut affecter les résultats des études de carbamylation in vivo.

Quelles sont les Causes de la carbamylation?

Par définition, la carbamylation désigne la modification post-traductionnelle qui modifie les propriétés structurelles et fonctionnelles des protéines. Ceci est provoqué par la réaction non enzymatique entre l’acide isocyanique et les groupes amino libres.

Dans les solutions aqueuses, l’urée existe en équilibre avec le cyanate d’ammonium. Il est important de noter que (1) l’urée en solution se dissocie spontanément en produisant des ions cyanate et ammonium, (2) elle se dégrade en acide isocyanique (CNOH), la forme qui réagit activement avec les groupes aminés protéiques et induit la carbamylation, et (3) la vitesse à laquelle l’urée se dissocie et l’étendue de la carbamylation dépend de la température, du pH et du temps d’incubation.

Prévenir la carbamylation:Quelques conseils utiles à considérer

Rien ne peut changer le fait que l’urée en présence de chaleur et de protéines conduira toujours à la carbamylation. Vous pouvez utiliser l’urée de la plus haute qualité disponible et courir toujours le risque de carbamylation.

Heureusement, il existe plusieurs façons de protéger les peptides de la carbamylation. Voici quelques stratégies efficaces qui peuvent être utilisées pour atteindre cet objectif.

• Utilisez toujours des réactifs à base d’urée fraîchement préparés lors des procédures protéomiques. Utilisez des tampons pré-mélangés et prêts à l’emploi à base d’urée sèche de haute qualité provenant de sources crédibles et faites preuve d’une extrême prudence lors de la préparation de vos échantillons. Remarque: Conservez les matériaux solides à température ambiante et maintenez la manipulation au minimum.
• Retirer l’urée de l’échantillon de protéines avant la digestion en utilisant la dialyse et/ou la chromatographie en phase inversée rapide ou en utilisant des colonnes de spin.
• Maintenir l’échantillon à une température relativement basse pour diminuer la vitesse à laquelle l’urée se décompose. Évitez de chauffer des tampons contenant de l’urée au-dessus de 37oC pour réduire le risque de carbamylation.
• Déioniser la solution d’urée à l’aide d’une résine échangeuse d’ions pour réduire la concentration de cyanate.
• Acidifier la solution d’urée (HCl 100 mM) pour empêcher la formation d’acide isocyanique.
• Utilisez des réactifs tels que l’éthanolamine, l’éthylènediamine, la méthylamine et le Tris-HCl pour minimiser la carbamylation des protéines / peptides. Ces réactifs aident en piégeant les molécules de cyanate, les rendant ainsi indisponibles pour les peptides.

Certes, ces stratégies ont leurs propres inconvénients (i.e., nécessitent un temps de manipulation prolongé, induisent la précipitation de protéines facilement dénaturées et peuvent ne pas convenir à de nombreuses techniques de digestion enzymatique), mais comme les digestions enzymatiques sont effectuées à des températures élevées sur une longue période, vous n’avez d’autre choix que d’éliminer l’urée du mélange digéré. Sinon, vous courrez toujours le risque de carbamylation. C’est un risque que vous ne voudriez pas prendre.