: Découverte d’inhibiteurs des canaux sodiques à déclenchement voltage
Afin d’illustrer les problèmes liés à la découverte de médicaments à déclenchement ionique décrits ci-dessus, le reste de cet article décrira une étude de cas axée sur l’identification d’inhibiteurs des canaux sodiques à déclenchement voltage pour traiter la douleur neuropathique chronique. Le traitement de la douleur est un problème médical grave et l’industrie pharmaceutique déploie des efforts considérables pour développer de nouveaux traitements contre cette maladie. En particulier, le traitement de la douleur neuropathique, définie comme « douleur chronique résultant d’une lésion primaire ou d’un dysfonctionnement du système nerveux périphérique » par l’Association Internationale pour l’Étude de la douleur (IASP), reste un besoin médical majeur non satisfait.
Il est clair que les canaux sodiques à régulation de tension (Nav1) jouent un rôle clé dans l’origine et la propagation des potentiels d’action des nerfs sensoriels nécessaires à la signalisation de la douleur. Les applications locales de bloqueurs des canaux sodiques non sélectifs, tels que la novocaïne, procurent un soulagement complet de la douleur grâce au bloc de conduction. Cependant, cette approche du soulagement de la douleur est limitée à très peu d’applications, telles que les procédures dentaires, car les canaux sodiques sont également vitaux pour la conduction dans le cœur, le SNC, le muscle squelettique et les neurones sensoriels non narcotiques. La super famille Nav1 est composée de 10 membres (Yu et Catterall, 2004). Sept de ces sous-types, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 et Nav1.9, sont présents dans le système nerveux périphérique (SNP). Parmi ceux-ci, Nav1.7, Nav1.8 et Nav1.9 sont exprimés principalement dans les neurones nociceptifs et Nav1.3 est principalement embryonnaire, mais est régulé dans le SNP adulte après une blessure. Ce modèle d’expression limité fait de ces sous-types des cibles attrayantes pour le développement de nouveaux agents analgésiques. Cependant, leur contribution relative à la signalisation de la douleur, et en particulier à la signalisation de la douleur neuropathique, n’est pas claire et peut varier selon les étiologies et les qualités sensorielles de la douleur.
En l’absence de sélectivité moléculaire pour un sous–type Nav1, il est possible de cibler spécifiquement les canaux Nav1 dans un état conformationnel donné tout en préservant la conduction impulsionnelle dépendante des canaux sodiques. Ce type d’inhibition dépendante de l’état est à la base de la fenêtre thérapeutique observée avec les anticonvulsivants bloquant les canaux sodiques et les antiarythmiques, tels que la lamotrigine et la lidocaïne. Ces médicaments ont une affinité plus élevée pour les canaux à l’état ouvert et / ou inactivé que pour les canaux fermés au repos. Ce mécanisme d’inhibition favorise la liaison dans les tissus à combustion rapide ou partiellement dépolarisés. La douleur neuropathique doit être sensible à ce mécanisme inhibiteur, car on pense qu’elle provient de zones de dépolarisations induites par les blessures, une hypothèse qui est étayée par l’efficacité clinique de la lidocaïne administrée de manière systémique à des doses sous anesthésiques. De plus, un bloc non sélectif et dépendant de l’état peut offrir la plus grande efficacité, car le ko individuel de Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 ou Nav1.9 n’a fourni aucune preuve convaincante d’un rôle dominant de l’un de ces canaux dans la signalisation de la douleur neuropathique.
Sur la base de cette justification, il a été décidé de rechercher initialement des inhibiteurs de Nav1 sélectifs non sous-types et dépendants de l’état, tout en surveillant la sélectivité moléculaire en testant des composés d’intérêt sur Nav1.7, Nav1.5 (le canal sodique cardiaque primaire) et Nav1.8 en parallèle.
Un test basé sur le potentiel membranaire a été utilisé pour cribler 200 000 compounds de composés sur Nav1.8 exprimés de manière stable dans une lignée cellulaire recombinante. Ce test HTS était basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) entre deux membres d’une paire de colorants sensibles au potentiel membranaire développée par Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Les canaux Nav1.8 ont été préincubés avec le composé d’essai et l’agoniste chimique deltaméthrine en l’absence de sodium extracellulaire. L’ajout ultérieur de sodium a entraîné une dépolarisation membranaire et le bloc Nav1 a été quantifié comme une interférence avec ce processus de dépolarisation cellulaire.
Bien que l’écran initial sur Nav1.8 a donné une variété de résultats, un seul composé a été considéré comme une piste viable pour les efforts de chimie médicinale. Avant d’engager des ressources dans cette sonde, le composé, un succinimide disubstitué appelé BPBTS (N-{méthyl}-N’-(2,2′-bithien-5-yl méthyl) succinimide), a été examiné en détail par pince de tension manuelle pour cellules entières. On a constaté que le BPBTS inhibait tous les sous-types de Nav1 ayant une puissance similaire, et l’inhibition dépendait du potentiel membranaire et de la fréquence de stimulation. Ce mécanisme inhibiteur était compatible avec une affinité plus élevée du composé pour les canaux à l’état ouvert et inactivé, par rapport aux canaux à l’état de repos. De plus, le BPBTS était deux ordres de grandeur plus puissant que les anticonvulsivants et antiarythmiques utilisés en clinique, les bloqueurs Nav1, inhibant l’état inactivé de Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 et Nav1.2, avec des valeurs de Ki de 0,09, 0,15, 0,08 et 0,14 µM et l’état au repos avec des valeurs de Kr de 1,5, 1,3, 0,3 et 1,2 µM, respectivement (Priest et al., 2004).
En tant que tel, BPBTS était une piste intéressante pour la chimie médicinale; son principal passif étant un profil pharmacocinétique médiocre. Au cours du profilage des analogues des BPBT, ainsi que des inhibiteurs de Nav1 publiés, en utilisant le test de criblage fluorescent basé sur le potentiel membranaire, des divergences structurales entre les puissances déterminées dans le test fluorescent et par électrophysiologie ont été notées pour quelques composés. Ces écarts ont été attribués à une interaction entre ces composés et l’agoniste vératridine utilisé pour ouvrir les canaux Nav1.7. Par la suite, le dosage fluorescent a été modifié de telle sorte que les canaux Nav1 ont été préincubés avec le composé d’essai à des concentrations physiologiques extracellulaires de sodium et que la dépolarisation dépendante de Nav1 a été initiée par addition d’agonistes (Fig. 1). Les puissances inhibitrices des canaux mesurées dans ce test modifié sont très bien corrélées avec l’inhibition de l’état inactivé déterminée par électrophysiologie dans de nombreuses classes structurales d’inhibiteurs de Nav1 (Felix et al., 2004; Liu et coll., 2006).
Un test fonctionnel à base de fret à potentiel membranaire pour les canaux Nav1.7. En l’absence d’autres conductances ioniques pouvant hyperpolariser la cellule, l’expression hétérologue des canaux Nav1.7 fournit un système où, au potentiel de membrane de repos de la cellule, la plupart des canaux résideront dans l’état inactivé non conducteur. L’élimination de l’inactivation rapide par l’ajout de vératridine déplace l’équilibre du canal vers l’état conducteur et ouvert qui permet l’entrée de sodium menant à la dépolarisation cellulaire. Les changements de tension peuvent être surveillés avec une paire de colorants sensibles à la tension de FRET, la coumarine et l’oxonol. La dépolarisation cellulaire modifie la distribution de l’oxonol à travers la membrane, provoquant un changement du signal de FRET. En présence d’un inhibiteur de Nav1.7, l’équilibre des canaux se déplace vers la conformation inactivée liée au médicament, réduisant le nombre de canaux disponibles pour la modification de la vératridine et empêchant le signal de FRET induit par l’agoniste. La courbe dose-réponse pour le changement induit par la vératridine du signal de FRET est abrupte, ce qui suggère que la modification d’un petit nombre de canaux Nav1.7 est suffisante pour provoquer une dépolarisation cellulaire.
Bien que les analogues des BPBT n’aient pas réussi à surpasser la puissance initiale, la chimie médicinale a réussi à améliorer le profil pharmacocinétique, générant finalement le trans-N-{méthyl}-N-méthyl-N’-cyclopentane-1,2-dicarboxamide (CDA54) avec une biodisponibilité orale de 44%, une demi-vie d’une heure et un taux de clairance de 14 ml / min / kg, qui a été largement profilé in vivo (Brochu et al., 2006). Dans deux modèles de douleur neuropathique chez le rat, CDA54 (10 mg / kg, administré par voie orale) a considérablement réduit l’hypersensibilité comportementale induite par les lésions nerveuses de 44 à 67%. La même dose / concentration plasmatique de CDA54 n’a pas affecté la nociception aiguë (test de plaque chauffante chez le rat), la coordination motrice (test de rotorod chez le rat) ou la conduction cardiaque (paramètres électrophysiologiques mesurés chez le chien cardiovasculaire). Ces propriétés contrastent avec celles des bloqueurs actuels des canaux sodiques utilisés en clinique, qui provoquent une altération de la coordination motrice chez le rat et des effets secondaires du SNC chez l’homme à toutes les doses efficaces. Fait intéressant, lors de l’administration orale, le rapport cerveau / plasma pour CDA54 était de 0,03. En revanche, les bloqueurs Nav1 utilisés en clinique s’accumulent dans le SNC, avec un rapport cerveau / plasma supérieur à 10 pour la mexilétine. Ces données obtenues avec CDA54 suggèrent fortement que l’inhibition des canaux sodiques du SNP seul est efficace dans les modèles animaux de douleur neuropathique, et que la limitation de l’exposition au SNC des inhibiteurs de Nav1 est une approche viable pour développer des inhibiteurs de Nav1 avec un indice thérapeutique amélioré.
Une campagne UHTS, utilisant l’essai basé sur le potentiel membranaire décrit pour dépister les inhibiteurs de Nav1.7, a découvert les nouveaux inhibiteurs de la 1-benzazépine-2-one channel (Hoyt et al., 2007; Williams et coll., 2007). Cette classe d’inhibiteurs a démontré une relation structure–activité définie et, lorsqu’ils ont été évalués in vivo, les membres de cette série étaient efficaces par voie orale dans les modèles de douleur neuropathique et d’épilepsie chez les rongeurs. Fait important, certains membres de cette classe ont montré une sélectivité moléculaire pour les canaux Nav1.7 (Williams et al., 2007). Par example, le composé 2 de la Fig. 2 était fortement dépendant de l’état et ∼10 fois sélectif pour Nav1.7 par rapport à Nav1.8 et Nav1.5. Le membre le plus puissant, bien que non sélectif de sous-type, de cette classe d’inhibiteurs de Nav1.7 (composé 1, BNZA; Fig. 2) a été tritié. BNZA se lie avec une affinité élevée (Kd de 1,6 nM) aux canaux Nav1.7 recombinants. Il s’agit de la première démonstration de liaison de ligand de haute affinité à Nav1.7 et fournit un outil de criblage précieux pour rechercher des composés sélectifs de Nav1.7. Les données obtenues avec la série structurale 1-benzazépine-2-one suggèrent que Nav1.7- des analogues sélectifs peuvent être identifiés, et avec les propriétés pharmacocinétiques et métaboliques appropriées, de tels composés pourraient être développés comme agents analgésiques, présentant potentiellement une tolérance améliorée par rapport aux médicaments existants utilisés pour traiter la douleur neuropathique. Le rapport récent d’un agent sélectif Nav1.8 à haute affinité, administré par voie intrapéritonéale, s’est révélé efficace dans un large éventail de modèles de douleur chez les rongeurs (Jarvis et al., 2007).
Inhibiteurs de la 1-benzazépine-2-one Nav1. Les structures de deux inhibiteurs de la 1-benzazépine-2-one Nav1 sont illustrées ainsi que leurs puissances pour les canaux hNav1.5, hNav1.7 et hNav1.8 tels que déterminés dans des tests de potentiel membranaire fonctionnel basés sur FRET. Les puissances estimées de ces composés pour l’état inactivé des canaux hNav1.5 et hNav1.7, telles que déterminées à partir d’enregistrements électrophysiologiques, sont également présentées. Notez que seul le composé 2 affiche la sélectivité pour le canal hNav1.7. Les deux composés sont des inhibiteurs plus faibles du canal hNav1.8.
Une approche alternative potentielle pour rechercher des inhibiteurs sélectifs des canaux sodiques de sous-type serait de rechercher des composés qui ciblent les mécanismes de déclenchement des canaux. Il a été montré précédemment que plusieurs peptides modifiaient le gating des canaux sodiques, mais peu de petites molécules, en particulier des inhibiteurs, ont été décrites pour fonctionner de cette manière. Un de ces agents est le ProTx-II, un peptide de 30 acides aminés purifié à partir du venin de tarentule; ce peptide bloque les canaux sodiques et montre une sélectivité pour Nav1.7 (Smith et al., 2007). ProTx-II se lie à l’état de repos des canaux sodiques et déplace la dépendance en tension de l’activation des canaux vers des potentiels plus dépolarisés. De fortes dépolarisations surmontent l’inhibition des canaux, qui est une caractéristique de ce type de peptide modificateur de déclenchement. Une stratégie possible pour identifier les mimétiques de petites molécules d’un peptide modificateur de déclenchement consiste à radiolabel ProTx-II sous forme biologiquement active, et à développer un dosage de liaison avec des canaux Nav1.7 exprimés de manière hétérologue dans une lignée cellulaire. Le dépistage de petites molécules qui modulent la liaison ProTx-II pourrait révéler de nouvelles classes d’inhibiteurs de canaux qui se divisent dans la membrane et interfèrent avec le mouvement de la palette de déclenchement, empêchant ainsi l’ouverture du canal. Un avantage supplémentaire de ce type d’UHT est que des concentrations élevées de composés d’essai pourraient être utilisées, une situation qui est exclue dans le criblage à base de colorants en raison de l’interférence de fluorescence qui se produit généralement avec des concentrations élevées de nombreuses petites molécules organiques. Étant donné que certains peptides modificateurs de déclenchement se lient à des régions uniques à des canaux spécifiques au sein d’une super famille, des inhibiteurs sélectifs de sous-type pourraient être identifiés à l’aide d’une telle stratégie.
