L’immunothérapie du cancer agoniste systémique induit une expansion différentielle des lymphocytes T CD4 et CD8 dans les organes lymphoïdes et périphériques

L’association d’anti-CD40 avec l’IL-2 a été démontrée pour induire une croissance et une régression retardées sur plusieurs modèles de tumeurs murines. Similaire aux données publiées utilisant des modèles de tumeurs de lignées cellulaires, le traitement du modèle d’excroissance de néoplasie intraépithéliale mammaire (MIN-O), une lignée de greffe de tissu, par immunothérapie anti-CD40 et IL-2 (IT) a conduit à des réponses antitumorales significatives (P = 0,0057), y compris une régression chez > 50% des souris traitées (fichier supplémentaire 1: Figure S1A). Des études antérieures ont montré que ces réponses anti-tumorales étaient dues aux lymphocytes T CD8, nous avons donc évalué le phénotype des lymphocytes T dans la rate ainsi que dans la tumeur et les poumons (un site métastatique commun pour de nombreux modèles tumoraux différents). Bien que nous ayons noté que la thérapie induisait généralement une expansion de CD8 dans tous les organes, nous avons noté certaines différences dans le phénotype de la mémoire des lymphocytes T CD8 entre les sites d’organes (fichier supplémentaire 1: Figure S1B-C).

Nous et d’autres avons déjà montré que des traitements immunostimulants puissants pour le cancer induisent une prolifération puissante des lymphocytes T CD4 et CD8 de la mémoire (CD44high) dans la rate et les ganglions lymphatiques. Il a également été observé que les lymphocytes T CD4, mais pas CD8, subissent également une mort cellulaire induite par l’activation d’une manière dépendante de l’interféron (IFN)-γ, ce qui entraîne une expansion globale insignifiante des lymphocytes T CD4 en nombre dans ces mêmes organes par rapport à l’inclusion. Ces données ont été générées à l’aide de lectures d’organes lymphoïdes. Cependant, à la lumière des phénotypes observés chez les souris traitées par immunothérapie, l’expansion, l’activation et l’apoptose des lymphocytes T activés peuvent être affectées de manière différentielle dans les tissus périphériques. Par conséquent, nous avons cherché à caractériser et à comparer davantage l’activation des lymphocytes T dans les organes périphériques (où peuvent résider la tumeur primaire et / ou les lésions métastatiques) et les organes lymphoïdes secondaires (qui sont souvent étudiés lors d’études immunothérapeutiques pour évaluer les mécanismes d’action). Nous avons évalué la fréquence, l’expansion et l’apoptose des lymphocytes T CD8 et CD4 (Foxp3neg) de manière systémique dans les organes lymphoïdes et périphériques. En accord avec les rapports précédents de notre groupe, sans modifier de manière significative leur fréquence globale (Fig. 1a), l’immunothérapie anti-CD40/IL-2 a entraîné une expansion significative du nombre total de lymphocytes T CD8 dans les spleens et les ganglions lymphatiques (Fig. 1b). Conformément à l’augmentation du nombre total de CD8, la fréquence des lymphocytes T CD8 incorporant de la bromodésoxyuridine (BrdU) in vivo a été considérablement augmentée et la proportion de cellules apoptotiques évaluée par l’expression extracellulaire de l’annexine V n’était pas significativement différente des témoins (Fig C-D). En revanche, la fréquence totale des lymphocytes T CD4 a diminué et les nombres n’ont pas changé de manière significative par rapport aux témoins au sein des mêmes organes (Fig. 1 bis-b). Alors que les lymphocytes T CD4 étaient en expansion comme évalué par incorporation de BrdU, une proportion significative d’entre eux traversaient également l’apoptose (Fig. 1c-d) entraînant une variation nette insignifiante du nombre total. Ces données étaient conformes à ce qui avait été observé précédemment. Lorsque nous avons évalué les organes non lymphoïdes, y compris les poumons et le foie, nous avons constaté des tendances similaires chez les lymphocytes T CD4 et CD8, à savoir que les lymphocytes T CD8 se développaient et survivaient dans tous les organes qui LES suivaient (Fig. 2a-b) alors que les lymphocytes T CD4 (Foxp3neg) étaient en expansion et passaient simultanément par l’apoptose dans une mesure similaire, entraînant des changements insignifiants à la fois de leurs fréquences et de leurs nombres (Fig. 2c-d) en périphérie.

Les phénotypes de mémoire des lymphocytes T varient entre les organes lymphoïdes secondaires et les tissus périphériques non lymphoïdes chez les lymphocytes T CD8 mais pas les lymphocytes T CD4 qui LES suivent

Chez la souris, les lymphocytes T CD4 et CD8 peuvent être classés en phénotypes de mémoire et naïfs basés sur CD62L (L-sélectine) et Expression de CD44 avec la population CD44lowCD62L+ considérée comme naïve (TN), la population CD44highCD62L+ considérée comme mémoire centrale (TCM) et la population CD44highCD62Lneg considérée comme mémoire effectrice et/ ou effectrice (TE/EM). On sait que les lymphocytes T CD4 et CD8 diffèrent dans leur distribution de ces sous-ensembles dans les organes lymphoïdes et périphériques. Alors que les fréquences naïves au sein des populations CD4 et CD8 restent relativement similaires, la population CD44high est plus asymétrique en mémoire centrale dans les lymphocytes T CD8 et en mémoire effectrice dans les lymphocytes T CD4 dans un organisme au repos. Cependant, dans les organes périphériques, les cellules T résidentes des tissus dans les sous-ensembles de cellules T CD4 et CD8 sont principalement du phénotype de la mémoire effectrice.

Des études antérieures ont montré que les cellules de phénotype de mémoire (CD44high) sont le principal type cellulaire en expansion après les immunothérapies stimulantes. Pour mieux comprendre la composition des lymphocytes T CD4 et CD8 dans différents organes, nous avons évalué leur statut de phénotype mémoire dans chaque organe qui LE suivait. Au repos, la population élevée de lymphocytes T CD44 dans les organes lymphoïdes était principalement constituée de MTC (> 90%) alors que dans les organes périphériques, il s’agissait d’une combinaison d’environ 60% de MTC (Fig. 3a, c, e, -f). En général, IL en résulte une expansion globale de la fréquence cd44haute dans tous les organes. Les fréquences de la MTC ont été soit inchangées, soit légèrement augmentées, tandis que les populations TE/EM se sont considérablement développées (Fig. 3e-f) de ~ 10% à 30% dans les organes lymphoïdes et, de manière impressionnante, de ~ 30-85% dans les organes périphériques.

Au sein de la population élevée de lymphocytes T CD44, les souris au repos étaient plus fortement inclinées vers le phénotype TE/EM avec environ 60-70% dans le lymphoïde et 75-95% dans les tissus périphériques (Fig. 3b, d). Comme cela s’est produit dans les lymphocytes T CD8, la proportion élevée de CD44 s’est ensuite étendue, mais en raison du fait qu’elle était si fortement biaisée par rapport au phénotype TE / EM dans tous les organes chez les souris au repos, les fréquences de CD4 TE / EM étaient largement cohérentes dans tous les organes chez les souris traitées (Fig. 3e). Les fréquences CD4 de la MTC sont restées relativement faibles et cohérentes dans tous les organes, avant et après l’IT (Fig. 3f).

L’expression des marqueurs d’activation dans les lymphocytes T CD4 et CD8 dépend de la localisation et du phénotype mémoire

En plus des différences de prolifération et d’apoptose, nous avons également remarqué régulièrement que les lymphocytes T CD4 et CD8 régulent différemment l’activation et les molécules inhibitrices qui LA suivent. L’exemple le plus notable de ceci étant PD-1 qui, sur la base d’études portant sur des organes lymphoïdes secondaires (rate et LN), a été préférentiellement régulé à la hausse sur les lymphocytes T CD4 et non CD8 et considéré comme probablement impliqué dans le processus préférentiel de l’AICD qui s’est produit dans les lymphocytes CD4 mais pas les lymphocytes T CD8 qui L’ont suivi. Un autre exemple serait la régulation positive préférentielle de NKG2D sur les lymphocytes T CD8 mais pas CD4 conférant une capacité lytique induite par le spectateur après une forte exposition de cytokines au sous-ensemble mémoire CD8. Les études précédentes de notre laboratoire ainsi que les données présentées à la Fig. 3 ont montré que parmi les lymphocytes T CD4 et CD8, les cellules primaires qui prolifèrent activement et y répondent sont les cellules de phénotype à haute mémoire CD44. Par conséquent, nous nous sommes ensuite concentrés sur cette population.

Dans la population CD44high, il a été montré que les cellules T CD8 proliférantes ne parviennent pas à réguler à la hausse les marqueurs compatibles avec l’activation par un stimulus spécifique à l’antigène tel que CD25 et PD-1, mais régulent à la hausse les marqueurs qui leur permettent d’acquérir un phénotype de spectateur, à savoir NKG2D, conférant la capacité d’agir davantage de manière NK-like, antigène sans restriction. À l’inverse, les lymphocytes T CD4 à haute prolifération (Foxp3neg) CD4 régulent de manière disproportionnée la PD-1 (contrairement aux lymphocytes T CD8 et Foxp3 +, lymphocytes T CD4 régulateurs) ce que nous avons suggéré leur permet d’être préférentiellement ciblés pour l’induction de l’apoptose. Conformément à ces rapports précédents, nous avons observé des phénotypes similaires chez les lymphocytes T CD44highCD8+ résidents des ganglions spléniques et lymphatiques traités par l’IT, qui ont régulé de manière significative NKG2D mais pas PD-1 (Fig. 4a, c), et les lymphocytes T CD44highCD4+, qui ont régulé de manière robuste PD-1, mais pas NKG2D (Fig. 4b, d). Lorsque nous avons évalué les mêmes marqueurs phénotypiques dans les populations de lymphocytes T résidant dans les organes périphériques non lymphoïdes, le phénotype des lymphocytes T CD44highCD8+ était considérablement différent de celui de ceux résidant dans les organes lymphoïdes secondaires. Alors que les lymphocytes T CD44highCD8+ résidant dans les poumons et le foie étaient encore NKG2D + CD25neg (Fig. 4a, c), la fréquence des cellules NKG2D+ dans cette population semblait passer de 20 à 30% dans les organes lymphoïdes à 40 à 50% dans les organes périphériques (Fig. 4 bis). De plus, contrairement aux organes lymphoïdes où l’expression de PD-1 était inchangée, l’expression de PD-1 a été augmentée de manière significative dans les poumons et le foie après CELLE-ci dans la population CD44highCD8+ (Fig. 4c). Inversement, le phénotype des lymphocytes T CD44highCD4 était remarquablement similaire aux lymphocytes T CD4 de la rate et des ganglions lymphatiques dans tous les organes (Fig. 4b, d) avec une expression comparable de PD-1 et une régulation à la hausse minimale de NKG2D. CD25 n’a été régulé à la hausse dans les cellules T CD4 ou CD8 à aucun site (données non présentées). C’était inattendu car nous avons précédemment suggéré que l’expression différentielle de la PD-1 était probablement le mécanisme sous-jacent de l’induction différentielle de l’apoptose entre les lymphocytes T CD4 et CD8 à la suite de schémas IT puissants et immunostimulants. Pourtant, dans les organes périphériques, les lymphocytes T CD4 continuent d’être affectés de manière disproportionnée par l’apoptose malgré le fait que l’expression de PD-1 soit comparable entre les lymphocytes T CD4 et CD8. Ce schéma apparu était également intéressant car l’expression accrue du marqueur d’activation en périphérie semblait directement corrélée à la prédominance TE/EM, en particulier dans le cas de PD-1.

Il a récemment été démontré que les cellules TE/EM en circulation expriment des niveaux élevés de PD – 1 chez les humains au repos. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les cellules TE / EM CD8+ peuvent exprimer préférentiellement ces marqueurs d’activation par rapport à la MTC CD8+, ce qui entraîne des fréquences différentielles des cellules T CD44highCD8+ exprimant des marqueurs d’activation dans les organes lymphoïdes secondaires et périphériques qui LES suivent. Par conséquent, nous avons évalué l’expression de NKG2D et de PD-1 sur des cellules TE/EM et TCM CD8+ CD44highCD25neg de tous les organes chez des souris au repos et traitées par l’informatique. Chez les souris témoins, les deux NKG2D (Fig. 5a) et PD-1 (Fig. 5c) ont été exprimés à une fréquence plus élevée sur le sous-ensemble TE/EM de la population CD8+CD44highCD25-. Cependant, la fréquence globale de la population TE/EM parmi les lymphocytes T CD8+ chez les souris au repos est relativement faible par rapport à la MTC (camemberts Fig. 5a), par conséquent, dans l’ensemble, l’expression de PD-1 et de NKG2D est principalement faible (Fig. 4) car la MTC constitue la majorité des lymphocytes T CD8 + au repos. Chez les souris traitées par immunothérapie, l’expression de NKG2D et de PD-1 a été augmentée dans tous les organes (Fig. 4). Encore une fois, les deux NKG2D (Fig. 5b) et PD-1 (Fig. 5d) ont été exprimés plus fortement sur les lymphocytes T TE/EM CD8+ que sur les lymphocytes T TCM CD8+. Dans les organes lymphoïdes, où la population TE / EM a augmenté par rapport au contrôle, elle était encore nettement inférieure à celle des cellules TCM CD8+ (camemberts, Fig. 5b) entraînant des agrandissements moins importants sur ces sites. Contrairement aux organes lymphoïdes, les cellules TE/EM CD8+ constituaient la majorité des organes périphériques analysés (camemberts, Fig. 5b) rendant ainsi l’expression globale de NKG2D et PD-1 significativement plus élevée à ces sites. Encore une fois, il est important de noter que dans les organes lymphoïdes des souris traitées par immunothérapie, l’expression globale des deux marqueurs d’activation était significativement plus faible que dans les organes périphériques en raison de l’inclinaison de la MTC dans les lymphatiques sur la périphérie de la population CD8. Les niveaux d’expression ne variaient pas beaucoup entre les TE / EM provenant de différents organes (il n’y avait pas de différences significatives entre les organes lymphoïdes et périphériques) au sein des mêmes groupes de traitement, mais augmentaient généralement chez les IT traités par rapport aux témoins, une tendance plus prononcée avec NKG2D que PD-1 (Fig. 5). En revanche, l’expression du marqueur d’activation de la MTC est restée relativement constante non seulement parmi les organes de souris au sein d’un groupe de traitement, mais également entre les groupes témoins et traités par l’informatique (Fig. 5 bis-b). Prises ensemble, ces données suggèrent que la constitution du pool mémoire / activé (TCM vs TE / EM) pèse fortement sur le phénotype de la population de lymphocytes T activés, en particulier avec les lymphocytes T CD8 car leur constitution varie considérablement entre les organes lymphoïdes et non lymphoïdes.

Évaluation des lymphocytes T de patients recevant un traitement immunostimulateur systémique à forte dose

Ensuite, nous voulions évaluer si ces résultats se traduisaient par des patients humains recevant des traitements immunostimulants contre le cancer. Il n’y a actuellement aucun essai évaluant l’association agoniste de l’anti-CD40 avec de l’IL-2 humaine recombinante, mais nous avons régulièrement comparé notre thérapie combinée à d’autres traitements immunostimulants systémiques, y compris les agonistes TLR à forte dose et les cytokines systémiques à forte dose, et montré des changements phénotypiques et fonctionnels similaires aux lymphocytes T observés dans notre modèle préclinique. Pour évaluer si les patients de la clinique présentaient des changements similaires dans l’expression des marqueurs de surface, nous avons collecté des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patients atteints de mélanome métastatique subissant un traitement systémique à forte dose d’IL-2. Les patients ont reçu 6×10^ 5 UI / Kg toutes les 8 h pour un total prévu de 14 doses. Des échantillons de PBMC ont été prélevés un jour avant le début du traitement (début du traitement) ou le 8e jour du premier cycle de traitement (8e jour) pour évaluer le phénotype des lymphocytes T. En comparant les échantillons de base et les échantillons du jour 8, il y a eu une augmentation significative des cellules de phénotype de mémoire PD-1+ (CD45RO +) dans les sous-ensembles de cellules T CD4 et CD8 après un traitement par IL-2 à forte dose (Fig. 6 bis-c). Lorsque cette population était encore décomposée en mémoire centrale (CD62L+) et mémoire effectrice/effectrice (CD62L-) au point temporel jour 8, le sous-ensemble mémoire effectrice/effectrice exprimait une expression PD-1 significativement plus élevée que le sous-ensemble mémoire centrale (Fig. 6d-e). Ensemble, ces données sont en corrélation avec ce qui a été observé dans les études murines, ce qui suggère que ces données sont applicables aux études humaines et peuvent être un indicateur de ce qui se produit localement.