Conception de l’étude

Étude VX-765 : Des souris WT (véhicule WT+; n = 18) et J20 âgées de cinq mois (véhicule J20+ : n = 14), et des souris injectées par VX-765 Souris J20 (J20 + VX-765: n = 13) les souris ont été évaluées longitudinalement à cinq moments différents: ligne de base avant le traitement (les J20 non traités de base ont été regroupés; n = 19), après trois injections IP par semaine de VX-765 ou de véhicule (Traitement 1), après six injections supplémentaires sur 2 semaines (Traitement 2), après une période de lavage de 4 semaines (WO) et après trois injections supplémentaires en 1 semaine (Traitement 3) (Fig. 1 bis). Tous les animaux testés ont été inclus dans les analyses, sauf si (a) l’animal est mort pendant l’expérience, ou (b) l’animal n’a pas réagi de manière comportementale. Un total de 25 portées, réparties dans quatre cohortes différentes et testées à des moments différents, ont été utilisées. Trois de ces cohortes ont subi des tests NOR et en plein champ, tandis que la cohorte 4 a été utilisée pour Barnes maze. Une fois que les animaux ont été testés à la base pour confirmer que les animaux J20 présentaient un déficit comportemental, les animaux J20 ont été affectés au hasard au traitement par véhicule ou par VX-765, indépendamment de leur performance comportementale. De tous les animaux utilisés, quatre souris J20 ne présentaient aucun déficit comportemental au début de l’expérience et n’ont pas été utilisées. Deux souris du véhicule J20+ n’ont pas bougé du tout pendant l’expérience et leurs données comportementales ont été exclues; cependant, ces animaux ont été gardés et ont toujours été utilisés pour l’analyse post-mortem.

Étude de validation de Casp1 : Pour valider les effets spécifiques de Casp1 de VX-765, des souris J20 ont été générées sur un fond Casp1−/-. Soixante-treize souris ont été utilisées (n = 12-13 par génotype, six génotypes différents), qui ont toutes été élevées par fécondation in vitro (FIV) à partir de 35 femelles donneuses. Les détails de l’élevage sont décrits dans la section Études animales ci-dessous. Toutes les souris ont été évaluées sur le plan comportemental entre l’âge de 7 et 8 mois, et aucun animal n’a été exclu de cette étude.

Toutes les souris ont été sacrifiées et traitées à l’âge de 8 mois. La notation comportementale a été aveugle au génotype et au traitement de la souris, et tous les animaux ont été assignés au hasard pour une analyse biochimique ou histologique et analysés à l’aveugle.

VX-765, VRT-043198 Essais IC50 sur les caspases recombinantes

Études sur les animaux

Toutes les procédures sur les animaux ont suivi les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université McGill. La lignée de souris transgéniques J20 (stock JAX No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, États-Unis) exprime les mutations d’applications humaines suédoises (670 / 671KM→NL) et Indiana (717V→F) sous le PDGF-ßpromoter. Des souris mâles J20 ont été utilisées comme reproductrices et leur sperme a été utilisé pour l’expansion des colonies de FIV.

Les génotypes ont été déterminés par biopsie de la queue et RT-PCR. Les souris ont été logées en groupe (2 à 4 animaux par cage) dans des cages à macrolons standard dans un cycle lumière / obscurité inverse de 12 h et dans des conditions environnementales contrôlées. De la nourriture et de l’eau étaient disponibles ad libitum.

Le VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) a été dissous dans du crémophore à 20% dans du dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) et administré par voie intrapéritonéale. Les souris J20 et WT traitées par véhicule n’ont reçu que du crémophore.

Analyse de la perméabilité de la barrière hémato–encéphalique

Des souris J20 et WT âgées de cinq mois ont été anesthésiées avec de l’isoflurane et l’artère carotide droite a été séparée. Une petite incision a été pratiquée le long de la paroi carotide et un micro-cathéter a été inséré dans l’entrée de l’artère carotide interne. Le cathéter a été fixé en place à l’aide de fil de suture. Le VX-765 (50 mg kg−1) a été perfusé à 50 µl min−1 (volume total de 90 à 120 µl). Le micro-cathéter a été laissé pendant 5 minutes supplémentaires pour permettre la diffusion, après quoi le sang a été recueilli par ponction intra-cardiaque. La souris a été perfusée par voie transcardiale avec une solution saline glacée et l’hippocampe et le cortex ont été disséqués. Des échantillons ont été envoyés à la plateforme de biopharmacie (Université de Montréal) pour une analyse de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse en tandem.

Analyse comportementale

Champ libre: l’activité locomotrice a été mesurée à l’aide d’un système de suivi automatisé HVS2100 (HVS Image, Hamptom, Royaume-Uni). Les souris ont été placées dans la chambre à ciel ouvert (boîte en plexiglas de 40 × 40 cm, pas de plafond et sol blanc) et ont été autorisées à explorer pendant 5 min.

Nouvelle reconnaissance d’objets (NOR): des souris ont été pré-exposées à deux objets identiques dans la chambre à ciel ouvert pendant 5 min. Deux heures après la pré-exposition, les souris ont été replacées dans la chambre et exposées à un objet familier et à un objet nouveau pendant 5 min. Des souris ont été exposées à un objet spécifique une seule fois au cours de différentes sessions de test, et le placement d’objets nouveaux a été contrebalancé dans chaque groupe de traitement. Le pourcentage de touches du nouvel objet pendant la phase de test et l’indice de discrimination ((#touches nouvelles − # touches familières) / total de touches) ont été évalués.

Barnes maze: la plate-forme Barnes maze (91 cm de diamètre, surélevée à 90 cm du sol) se composait de 20 trous (chacun de 5 cm de diamètre). Tous les trous étaient bouchés, à l’exception d’un trou cible qui menait à une boîte d’évacuation encastrée. Des indices spatiaux, une lumière vive et un bruit blanc ont été utilisés pour motiver les souris à trouver l’évasion lors de chaque session. Pour la phase d’adaptation, chaque souris a exploré la plate-forme pendant 60 s. Toute souris n’ayant pas trouvé la boîte d’échappement y a été guidée et y est restée pendant 90 s. Pour la phase d’acquisition, chaque essai a suivi le même protocole, dans le but d’entraîner chaque souris à trouver la cible et à entrer dans la boîte d’échappement dans les 180 s. Les souris sont restées dans la boîte pendant 60 s supplémentaires. Quatre essais par jour, espacés d’environ 15 min, ont été effectués pendant 4 jours consécutifs. Dans le test de sonde (jour 5), chaque souris a effectué un essai de 90 s. La cible se trouvait toujours dans la même position, mais la boîte d’échappement était bloquée. La latence et les erreurs pour atteindre la cible, ainsi que le nombre de coups de souris dans chacun des trous (préférence cible) ont été mesurés. Le labyrinthe en Y était composé d’un labyrinthe symétrique en forme de Y avec trois bras à 120 ° l’un de l’autre, désignés A, B et C. Les animaux étaient placés à l’extrémité distale du bras A et autorisés à explorer le labyrinthe pendant 5 min. Les entrées totales de bras et l’alternance spontanée, définies comme des entrées consécutives dans trois bras différents, ont été enregistrées. Le pourcentage d’alternance a été déterminé.

Traitement des tissus

Pour l’immunohistochimie, des souris (n = 4-6 par groupe) ont été anesthésiées avec de l’isofluorane et perfusées par voie transcardiale avec une solution saline glacée suivie d’une solution saline glacée à 4% de paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dans une solution saline tamponnée au phosphate de 0,1 M. Les cerveaux ont été post-fixés dans du formol tamponné neutre à 10% (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) pendant 16 h et transférés dans de l’éthanol à 70%. Les cerveaux ont été incrustés de paraffine et sectionnés à 4 µm.

Pour western blot et ELISA (n = 4-8 par groupe), les souris anesthésiées ont été disloquées cerviquement, l’hippocampe et le cortex disséqués et immédiatement congelés sur de la glace carbonique. Les protéines ont été extraites en 5× volume/poids avec du tampon RIPA (50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mm NaCl, 0,25% Na-désoxycholate, 1 MM EDTA, 1 mm Na3VO4, 1 mm NaF, 1 mm PMSF, 10 µl ml−1 de Cocktail d’inhibiteurs de Protéases (Sigma-Aldrich)) sur glace avec un homogénéisateur tissulaire (OMNI International, Kennesaw, GA , États-Unis). Les échantillons ont été centrifugés (20 000 ×g, 4 °C) pendant 20 min, le surnageant récupéré et la protéine quantifiée par la méthode BCA. Le culot RIPA-insoluble a ensuite été extrait dans de l’acide formique à 70% dans du dH2O, évaporé et resolubilisé dans du Tris-HCl 200 mM, pH 7,5.

Coloration immunohistologique

Les épitopes ont été démasqués soit dans du citrate (citrate Tris-Na de 10 mM, pH 6,0), soit dans de l’EDTA (Base Tris de 10 mM, EDTA de 1 mM, Tween-20 à 0,05%, pH 9.0) tampon de récupération d’antigène, et immunisé à l’aide du processeur de diapositives automatisé Dako Autostainer Plus et du système EnVision Flex (Dako, Burlington, ON, Canada). Après la deparaffinisation et la réhydratation, des sections ont été traitées à la peroxydase, bloquées dans un bloc protéique sans sérum et immunostées avec les anticorps suivants dilués dans un diluant d’anticorps EnVision Flex: anti-Iba1 de lapin 1: 2000 (Wako 019-19741, Richmond, Virginie, États-Unis), anti-GFAP de lapin 1: 8000 (Dako Z-0334), anti-Aß1-40 de lapin 1:2000 (F25276, développé en laboratoire) et 1 : 1000 antisynaptophysine de souris (Sigma-Aldrich S5768). Les sections ont été traitées avec l’anticorps secondaire conjugué HRP de souris ou de lapin approprié fourni en kit et visualisées avec du DAB. Les coupes ont été contrétainées à l’hématoxyline, déshydratées et recouvertes de Permount (Fisher Scientific). Des sections ont été numérisées avec MIRAX SCAN pour analyse (Zeiss, Don Mills, ON, Canada). Après deparaffinisation et réhydratation, les lames ont été colorées avec de la Thioflavine-S aqueuse filtrée à 1% (Sigma-Aldrich).

Analyse immunohistologique quantitative

Les cellules Iba1-positives dans le cortex et la partie antérieure de la région CA1 de l’hippocampe ont été quantifiées à l’aide d’une version modifiée du cadre de comptage aréal48. En bref, une diapositive sur cinq a été quantifiée (ce qui donne quatre sections par cerveau). Plusieurs images ×80 ont été prises avec le BALAYAGE MIRAX dans la zone d’intérêt et le nombre de cellules Iba1 positives a été compté manuellement. La densité numérique (nombre de cellules mm−3) dans la région CA1 antérieure et le cortex a été estimée. Un nombre minimum de 150 visites par zone était nécessaire pour faire une estimation fiable. Des sections supplémentaires ont été comptées si nous n’étions pas en mesure d’atteindre notre nombre minimum. La quantification a été effectuée en aveugle pour le traitement et le génotype. Le logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) a été utilisé pour mesurer l’accumulation d’Aß, la GFAP et la coloration immunopositive à la synaptophysine dans la région CA1 et le cortex. Quatre sections par cerveau ont été analysées et plusieurs images ont été prises dans chaque section pour couvrir la région CA1 et le cortex. Le seuil a été ajusté de manière égale sur tous les cerveaux pour mettre en évidence la zone tachée, et les particules ont été analysées pour déterminer la surface totale de coloration. Les résultats sont exprimés en surface totale colorée par surface totale analysée (µm2 mm-2). Les images représentatives n’ont été recadrées que pour se conformer aux contraintes de taille et n’ont subi aucun post-traitement.

Western blot

Des échantillons de protéines de souris (25-100 µg) ont été préparés dans du Laemmli (5% de 2-β-mercaptoéthanol, 1 mm Na3VO4, 1 mm NaF, 1 mm PMSF, 10 µl ml−1 de Cocktail d’inhibiteurs de protéases (Sigma-Aldrich)), bouillis pendant 5 min et séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Des échantillons ont été sondés avec les anticorps primaires suivants, dilués dans du lait sec non gras à 5% dans une solution saline tamponnée Tris et un tampon bloquant le Tween-20 ou le PBS à 0,1% (Thermoscientifique): 1:1000 Aß1-16 anti-humain de souris (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 lapin anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1: 1000 lapin anti-néprilysine (Abcam ab79423), 1: 500 lapin anti-E (Abcam ab32216), 1: 1000 lapin anti-Caspase-3 (Signalisation cellulaire 9665), 1: 1000 souris anti-Caspase-8 (Signalisation cellulaire 8592), 1: 1000 lapin anti-Caspase-3 (Signalisation cellulaire 9665) Caspase-9 (Signalisation cellulaire 9504) et anti β-actine de souris 1: 5000 (Sigma-Aldrich A5441). Des blots ont été détectés avec un anticorps secondaire anti-souris lié à 1:5000 HRP (GE Amersham NA9310, Montréal, QC, CA) ou 1:5000 anti-lapin (Dako P0217) suivi d’ECL (GE Amersham). Les bandes immunoréactives ont été visualisées à l’aide du système d’imagerie ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), et des analyses densitométriques ont été effectuées avec un logiciel d’analyse de jauge d’image (Fujifilm USA). La luminosité et le contraste des taches brutes ont également été ajustés sur l’ensemble de l’image avec le logiciel Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) pour générer des images représentatives. Aucune modification supplémentaire n’a été apportée. Le logiciel CanvasTM X (système Acd, Plantation, FL, USA) a été utilisé pour créer les figures finales. Les taches brutes pour les taches occidentales sont disponibles dans la figure supplémentaire 11.

ELISA

Les cytokines pro et anti-inflammatoires et les taux d’Aß dans le cerveau de souris ont été déterminés à l’aide de kits de test immunitaire par électrochimiluminescence de Meso Scale Discovery (Rockville, MD, États-Unis). Les normes et les échantillons ont été préparés selon les protocoles du fabricant et exécutés en double exemplaire. Le panneau proinflammatoire de souris ten-plex a été utilisé pour l’hippocampe et la corticale de souris et des échantillons. Un seul kit d’Il-1β a été utilisé pour mesurer le plasma de souris. Le panneau proinflammatoire humain à quatre plex a été utilisé pour les échantillons de HPN (voir ci-dessous). Le kit Aß 6E10 humain à quatre panneaux a été utilisé pour des échantillons d’hippocampe et de cortex de souris et d’HPN.

Extraction d’ARN et synthèse d’ADNc

L’ARN total a été extrait de l’hippocampe et du cortex de souris (n = 3 par groupe) avec du Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA) suivi d’une homogénéisation avec une aiguille de calibre 20. Le kit miRNeasy mini, comprenant une étape de traitement de la DNase sur colonne, a été utilisé pour purifier l’ARN total (Qiagen). La qualité et la quantité d’ARN ont été déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Les produits ont été visualisés sur des gels d’agarose colorés à 2% RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada). Des expériences de PCR en temps réel ont été réalisées avec SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) sur un système de PCR rapide en Temps réel Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’amplification génique a été réalisée avec les amorces suivantes : (18s) 5′-GTAACCCGTTGAACCCCAT-3′ et 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; ( AC) 5′-ACTAACCTGGTGGTGAAG-3′ et 5′-GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Néprilysine) 5′-TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ et 5′-CTCCCACAGCATTCTCCAT-3′. Les résultats sont exprimés sous forme de valeurs d’induction de pli normalisées pour signifier les gènes de référence HPRT et 18S en utilisant la méthode Pfaffl.

Matrice PCR RT2-Profileur de plasticité synaptique de souris

La matrice PCR RT2-Profileur de plasticité synaptique de souris (PAMM-126Z, Qiagen) profile l’expression de 84 gènes impliqués dans les altérations synaptiques au cours de l’apprentissage et de la mémoire et cinq gènes d’entretien ménager (β-actine; β-2-microglobuline; glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, GAPDH; β-glucuronidase, Gusb; Protéine de choc thermique 90 alpha (cytosolique), Hsp90ab1) avec PCR en temps réel. L’ARN total (465 ng pour chaque échantillon) a été transcrit inverse (ce qui comprenait une étape d’élimination de l’ADN génomique) suivant le protocole du fabricant (Kit de synthèse d’ADNc du Premier brin, Qiagen). La réaction de PCR en temps réel a été réalisée dans un cycler en temps réel ABI 7500 (Bloc Rapide) (Applied Biosystems) en utilisant le mélange maître RT2 SYBR Green/ ROX PCR (Qiagen). Les conditions de cyclage étaient les suivantes : 2 min à 50 °C, 10 min à 95 °C, 40 cycles, 15 s chacun à 95 °C et 1 min à 60 °C. Le seuil et la ligne de base ont été réglés manuellement selon les instructions du fabricant. Les données ont été normalisées à la moyenne géométrique des cinq gènes de ménage et analysées par la méthode Ct comparative (2-ΔCT).

Culture de cellules neuronales et test de dégénérescence axonale

Des tissus corticaux fœtaux âgés de douze à seize semaines ont été obtenus du Laboratoire de recherche sur les anomalies congénitales (Université de Washington, Seattle, États-Unis) conformément à un protocole approuvé par le conseil d’examen institutionnel de McGill. Des HPN ont été cultivés à partir de cerveaux dissociés de la trypsine, traités avec de la désoxyribonucléase I et filtrés sur des mailles de nylon de 130, 70 et 30 µm21. Les cellules dissociées ont été centrifugées pendant 10 min à 300 × g et remises en suspension dans un milieu essentiel minimal (MEM) avec des sels d’Earle, et complétées par 5% de BCS décomplémenté, 1 × Pénicilline-Streptomycine, 1 mm de pyruvate de sodium et 2 mM de l-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Des cellules ont été ensemencées à une densité de 3×106 cellules ml-1 sur des plaques de culture tissulaire à six puits revêtues de poly-l-lysine de 5 µg mL-1 (Sigma-Aldrich). Le milieu MEM a été changé tous les 2 jours et la prolifération des astrocytes a été limitée avec un traitement antimitotique fluorodésoxyuridine (FdU) (1 mM, Sigma) pendant les 4 premiers jours. Les cultures neuronales ont été cultivées 7 à 10 jours avant de mener des expériences. Quatre préparations de neurones différentes à des moments différents ont été testées. L’une des préparations de neurones n’était pas stable et la culture, y compris le Sérum + contrôle qui n’a reçu aucun médicament, est morte au milieu de l’expérience. Par conséquent, trois préparations de neurones différentes provenant de trois donneurs génétiquement différents ont été utilisées.

La toxicité du VX-765 a été évaluée avec le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les neurones ont été traités avec 25-200 µM VX-765 ou 0,1% de DMSO (concentration de DMSO la plus élevée utilisée) pendant 72 h. Les neurones ont ensuite été incubés avec 0,5 µg ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) pendant 4 h à 37 ° C (5% de CO2). Les cristaux de formazan ont été dissous dans 100 µl de DMSO pendant 30 min. L’absorbance a été mesurée à 560 et 670 nm à l’aide du lecteur de plaques Synergy H4.

La dégénérescence axonale a été induite soit par transfection APPWT, soit par stress de privation sérique. Le VX-765 a été administré soit en tant que stratégie de prétraitement (1 h avant le facteur de stress), soit en tant que stratégie de traitement post-pénétration (48 h après le facteur de stress). Les neurones ont été transfectés par Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canada) avec des perles d’or recouvertes de pBudCE41-eGFP pour la visualisation par fluorescence. Les neurones stressés par l’APPWT ont été transfectés avec pBudCE41-eGFP/APPWT. Brièvement, les neurones ont été traités avec un milieu additionné de 25 ou 50 µM de VX-765, d’inhibiteur de Casp1 de 5 µM de Z-YVAD-fmk ou de DMSO. Des images en fluorescence ont été prises toutes les 24 h (jusqu’à 72 h après traitement) avec un microscope Nikon Eclipse Ti (Nikon, Mississauga, ON, CA) et une caméra CCD Photometrics coolSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, AZ, USA) à l’aide du logiciel NIS Elements AR 3.10 (Nikon). Le pourcentage de perlage neuronal a été mesuré en comptant le nombre de neurones perlés eGFP-positifs sur le nombre total de neurones eGFP-positifs à chaque point temporel. Un minimum de 150 neurones eGFP positifs a été compté pour chaque condition. Le milieu conditionné a été échantillonné (additionné de 1 mm Na3VO4, 1 mm NaF, 1 mm PMSF, 10 µl ml−1 de Cocktail d’inhibiteurs de Protéases (Sigma-Aldrich)), et les neurones ont été récoltés dans un tampon de lyse cellulaire (HEPES 50 mM, CHAPS 0,1%, EDTA 0,1 mM) pour analyse.

Analyses statistiques

Le nombre d’animaux ou d’expériences indépendantes, ainsi que l’analyse statistique utilisée (ANOVA et comparaisons post-hoc) sont tous indiqués dans les légendes de la figure. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± s.e.m., avec les valeurs F et p indiquées dans les légendes de la figure. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).