Résultats

Identification de la chaîne α du récepteur de l’IL-7 (CD127) comme Marqueur pour les lymphocytes T de mémoire. Lors de la recherche de nouveaux marqueurs pour définir des sous-ensembles de cellules T effectrices et mémoires chez la souris, nous avons analysé l’expression superficielle de la chaîne α du récepteur IL-7/CD127 (Fig. 1 bis). Au cours des réponses primaires à la Lm, des sous-populations distinctes de populations de lymphocytes T spléniques spécifiques à l’antigène peuvent être distinguées en fonction des niveaux d’expression de CD127. Les cellules CD127 à faible expression (CD127low) prédominent pendant la phase effectrice aiguë. Cependant, lors de la transition vers la phase des cellules T mémoire, les cellules CD127low disparaissent progressivement, tandis que les populations exprimant des niveaux élevés (CD127high) restent remarquablement stables en taille dans le temps (Fig. 1 a et c). Ces valeurs cinétiques distinctes suggèrent fortement que l’expression de CD127 est une caractéristique sélective pour les cellules T à mémoire longue durée de vie. Pendant la phase effectrice, les lymphocytes T CD127 à faible CD8+ migrent préférentiellement vers des organes non lymphoïdes, alors que seuls les lymphocytes T CD127 à haute CD8+ sont détectés dans LN (Fig. 1b). La rate représente un  » organe intermédiaire  » où toutes les différentes sous-populations se trouvent tôt après la vaccination (22, 23). Plus tard au cours de la phase de mémoire, les lymphocytes T spécifiques à l’antigène dans tous les organes sont caractérisés par un phénotype CD127high (Fig. 1 b et c). La comparaison des capacités des lymphocytes T spécifiques à l’antigène CD127low et CD127high à proliférer en réponse à la stimulation a révélé des différences frappantes entre les deux sous-ensembles. Comme le montre la Fig. 1d, les lymphocytes T CD127high spécifiques à la Listeria purifiés prolifèrent rapidement après une stimulation anti-CD3, tandis que les lymphocytes T CD127low prolifèrent mal. Il est peu probable que ces différences de prolifération reflètent un avantage des cellules CD127 positives par stimulation de l’IL-7R médiée par l’Ab, car différents clones de mAb ayant une activité d’activation ou de blocage connue du CD127 ont démontré le même effet dans des essais de stimulation in vitro à court terme (données non montrées).

Pour démontrer plus directement que les lymphocytes T à mémoire longue durée de vie sont exclusivement présents dans le compartiment à haute expression de CD127 tôt après l’amorçage in vivo, nous avons effectué des études de transfert adoptives en utilisant une technique de coloration multimère réversible du CMH récemment développée (21) pour isoler fonctionnellement les lymphocytes T spécifiques à l’antigène directement ex vivo. Après le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de CD127high LLO91–99 de souris infectées pendant 10 jours par la Lm, les cellules transférées étaient encore détectables plusieurs semaines plus tard dans la rate de souris receveuses naïves (Fig. 2a), alors que les nombres de cellules après transfert des cellules CD127low étaient à la limite de détection. Cette observation n’était pas due à des différences de migration in vivo des cellules CD127 high et CD127low transférées, car nous avons trouvé des différences similaires pour le poumon (Fig. 2a) et d’autres organes (LN et foie, données non représentées). Pour soutenir davantage l’interprétation selon laquelle les lymphocytes T CD127high maintiennent exclusivement des cellules mémoire spécifiques à l’antigène, des souris receveuses ont été mises au défi après un transfert adoptif avec une infection à Listeria. Encore une fois, ce n’est que chez les souris qui avaient reçu des lymphocytes T CD127high avant l’infection que l’expansion rapide des lymphocytes T spécifiques de LLO91–99 transférés était détectable (Fig. 2b). Encore une fois, ce résultat n’était pas dû à des différences de migration car le maintien ou l’expansion des lymphocytes T CD127low transférés n’était détectable dans aucun autre organe (Fig. 2b et données non représentées). Bien que ces résultats d’études de transfert adoptif soutiennent fortement l’hypothèse selon laquelle les lymphocytes T à mémoire longue durée de vie sont exclusivement présents dans le compartiment des lymphocytes T hauts CD127, nous avons également observé des limites substantielles de cette approche expérimentale. En particulier, les lymphocytes T mémoire à fonction effectrice immédiate semblent être assez sensibles aux expériences de transfert adoptives et meurent rapidement après purification et application i.v.; bien qu’ils survivent pendant des mois à des années s’ils restent intacts in vivo (11). Ainsi, bien que nos résultats de transfert adoptif soient conformes à l’interprétation selon laquelle CD127 est un marqueur pour les lymphocytes T à mémoire longue, nous ne pouvons exclure que des problèmes intrinsèques concernant la survie de sous-populations distinctes de lymphocytes T contribuent également au résultat de ces expériences.

La Codification des Populations de Lymphocytes T Spécifiques à l’Antigène avec CD127 et CD62L Permet une Discrimination Entre Les Sous-Populations de Lymphocytes T Mémoires. Une caractérisation plus poussée de la population de lymphocytes T CD127high a montré qu’elle pouvait être subdivisée en sous-populations exprimant des niveaux élevés et faibles de CD62L (Fig. 3). L’analyse fonctionnelle ex vivo directe (21) des lymphocytes T purifiés (10 à 12 jours après l’infection, lorsque toutes les sous-populations sont détectables simultanément dans la rate) a révélé d’autres différences fonctionnelles. Alors que les sous-ensembles de lymphocytes T CD62Llow présentent une activité cytolytique ex vivo vigoureuse et immédiate, les lymphocytes T CD127high/CD62Lhigh présentent une très mauvaise lyse des cellules cibles enrobées de peptide (Fig. 3). La coloration des cytokines intracellulaires de sous-populations triées a révélé que les lymphocytes T CD127high / CD62Llow, comme le sous-ensemble CD127low / CD62Llow, produisent les cytokines effectrices INF-γ et le facteur de nécrose tumorale α; en revanche, le sous-ensemble CD127high / CD62Lhigh produit de l’IL-2 mais pas de l’IFN-γ et du facteur de nécrose tumorale α. Ainsi, la combinaison de marqueurs CD127 et CD62L permet d’identifier des sous-populations de lymphocytes T aux caractéristiques très similaires à celles décrites précédemment chez l’homme. Les lymphocytes T CD127low/CD62Llow présentent toutes les caractéristiques connues d’une population réelle de lymphocytes T effecteurs (TE, faible activité proliférative, survie in vivo limitée et fonction effectrice immédiate). Le sous-ensemble CD127high / CD62Lhigh correspond aux caractéristiques de la MTC et les cellules T CD127high / CD62Llow correspondent à la description de la MFT.

La génération de Sous-populations Distinctes de Lymphocytes T en mémoire Dépend de l’Aide des lymphocytes T Médiée par CD40L. Parce que nous pensions qu’il pourrait être problématique de fonder exclusivement l’interprétation selon laquelle l’expression de CD127 peut être utilisée comme marqueur pour distinguer les cellules T effectrices des cellules à mémoire longue sur des expériences de transfert de cellules adoptives, nous avons décidé d’analyser des lignées mutantes de souris présentant des défauts dans la génération de la mémoire des cellules T. Si CD127 est bien un marqueur de cellules T mémoire « précoce », nous devrions être en mesure d’identifier des différences pendant les points temporels précoces et tardifs dans les sous-ensembles CD127 positifs chez les souris présentant des défauts de mémoire.

Comme des études récentes ont démontré l’importance de l’aide des lymphocytes T pour la génération de réponses mémorielles durables (2-4), nous avons décidé de déterminer si la présence ou l’absence d’aide des lymphocytes T CD4+ lors de l’amorçage des lymphocytes T CD8+ conduit à des différences dans les compositions de sous-ensembles de lymphocytes T spécifiques à l’antigène détectées dans la phase posteffectrice précoce. Les souris déficientes en CMH II, dépourvues de lymphocytes T CD4 + classiques, ont une réponse mémoire CD8 + défectueuse et la qualité de la protection diminue avec le temps (2-4). La coloration des sous-populations de lymphocytes T 10 jours après la primo-infection a révélé que le sous-ensemble CD127high/CD62Llow est presque complètement absent chez les souris CMH II–/– (Fig. 4a); les autres sous-populations sont présentes à des fréquences similaires à celles des souris WT C57BL/6. Ces données démontrent que l’absence d’aide des lymphocytes T empêche la génération efficace d’un sous-ensemble de lymphocytes T avec un phénotype de mémoire effectrice, ce qui semble crucial pour une expansion rapide in vivo et une fonction effectrice.

Comme les mécanismes importants de l’aide des lymphocytes T CD4+ sont médiés par l’interaction de CD40 et de CD40L (24-26), nous avons étudié si les souris CD40L–/– présentaient un phénotype similaire à celui des souris CMH II–/–. Conformément à d’autres études récentes (27), les souris CD40L–/– ne montrent aucune différence dans la charge bactérienne ou la clairance bactérienne après une infection primaire à Listeria (données non illustrées) et ont une réponse normale des lymphocytes T CD8+ primaires à une dose sublétale de Lm (Fig. 4c). Cependant, leur capacité à effacer rapidement la réinfection avec une dose plus élevée de Lm (≈10 × DL50) est réduite (Fig. 4b), en corrélation avec des réponses altérées des lymphocytes T de la mémoire CD8+ (Fig. 4c) et un sous-ensemble CD127high/CD62Llow très réduit (Fig. 4 e et f) pendant la phase posteffectrice précoce. Lors de la réinfection avec Listeria, la prolifération des lymphocytes T répondant chez les souris CD40L–/– est équivalente à celle des populations cellulaires chez les souris WT, ce qui indique que le phénotype n’est pas dû à un défaut général de la capacité proliférative des lymphocytes T mémoire (Fig. 4d) mais plutôt à un nombre réduit de lymphocytes T mémoire capables de répondre immédiatement à la réencombrement de l’antigène. Ce phénotype a été mis en évidence par des expériences de marquage in vivo dans lesquelles le BrdUrd a été incorporé pendant toute la phase d’expansion (Fig. 4d) et par des études in vivo BrdUrd pulse–chase surveillant la perte de marque lors de la prolifération (données non présentées).

Une Génération Réduite de Sous-Ensembles de Lymphocytes T avec un Phénotype de Mémoire Effectrice Tôt Après L’Amorçage Est Transmise dans le Pool de Lymphocytes T à Mémoire Tardive. Nos données montrent qu’en l’absence de lymphocytes T CD4+ ou CD40L, le sous-ensemble de lymphocytes T CD127high/ CD62Llow est considérablement réduit tôt après l’amorçage. De plus, nous (Fig. 4b) et d’autres (3-5) ont démontré qu’une altération de l’aide des lymphocytes T pendant l’amorçage des lymphocytes T entraîne des changements dans la qualité de l’immunité protectrice vers la réinfection par le virus de la Lm ou de la chorioméningite lymphocytaire. Pour établir un lien plus clair entre le défaut observé dans la génération précoce de lymphocytes T CD127high/ CD62Llow et la qualité de la mémoire des lymphocytes T subséquente chez ces souris, nous avons analysé plus en détail les populations de lymphocytes T spécifiques à l’antigène pendant la phase de mémoire (5 semaines après l’infection primaire à Listeria). À ce stade, l’analyse des lymphocytes T spécifiques à l’antigène doit être effectuée sur des cellules dérivées de différents tissus en raison de leur comportement migratoire distinct. En plus de la rate, nous avons choisi le LN comme tissu représentatif des organes lymphoïdes et le poumon comme compartiment périphérique typique, non lymphoïde. À ce stade, les lymphocytes T spécifiques à l’antigène dans ces organes sont presque tous CD127high (Fig. 1b); les cellules du poumon sont CD62Llow (données non représentées), alors que la plupart des lymphocytes T mémoire spécifiques à l’antigène dans le LN sont CD62Lhigh (Fig. 5b). Pour déterminer le nombre de lymphocytes T mémoire spécifiques à l’antigène avec une fonction effectrice immédiate claire dans les différents organes, nous avons effectué une coloration de cytokines intracellulaires pour l’IFN-γ. Comme le montre la Fig. les souris CD40L–/– 5a sont caractérisées par un nombre considérablement diminué de lymphocytes T mémoire spécifiques à l’antigène avec fonction effectrice immédiate par rapport aux souris WT. Ce résultat est vrai au niveau des fréquences (pourcentage) dans le compartiment des cellules T CD8+ et en chiffres absolus (Fig. 5 bis). Cependant, la coloration au tétramère du CMH des lymphocytes dérivés du LN (Fig. 5b) ont révélé des nombres presque identiques de lymphocytes T spécifiques à l’antigène avec un phénotype CD62Lhigh. Certaines lymphocytes T spécifiques à l’antigène CD62Llow sont également détectables chez les LNs de souris WT, en corrélation avec les fréquences des cellules productrices d’IFN-γ (Fig. 5 bis). Cette population est essentiellement absente chez les LNs de souris CD40L–/-; l’ensemble du sous-ensemble CD8+/CD62Llow est réduit chez les souris CD40L–/–, suggérant un défaut général dans la génération de ce sous-ensemble de lymphocytes T. En résumé, nos données montrent que l’absence d’aide des lymphocytes T CD4+ dépendants de CD40L pendant la période d’amorçage entraîne des différences quantitatives dans les sous-populations de lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène, avec un nombre considérablement réduit de cellules présentant un phénotype de mémoire effectrice (CD127high / CD62Llow). Ces différences quantitatives dans les cellules ayant une fonction effectrice précoce immédiate sont transmises dans la phase mémoire et affectent la qualité de l’immunité protectrice.