Résumé
Le carbendazime, en tant que fongicide, a été couramment utilisé pour lutter contre les maladies fongiques dans l’agriculture, la foresterie et les médicaments vétérinaires. Dans cette étude, la toxicité aiguë et reproductive du carbendazime a été évaluée en utilisant Caenorhabditis elegans (C. elegans) comme modèle afin d’évaluer au préalable les risques potentiels de ce fongicide dans la production et l’application agricoles. Les résultats ont montré que la croissance de C. elegans était inhibée par 0,01 µg/L de carbendazime. Le traitement de 0,1 µg / L de carbendazime a entraîné une diminution significative du comportement de locomotion et des dommages importants au système reproducteur et antioxydant, entraînant une réduction drastique de la durée de vie des nématodes. Ces résultats permettent de mieux comprendre le risque environnemental du carbendazime et soulèvent de nouvelles préoccupations en matière de sécurité.
1. Introduction
Les pesticides, une sorte de réactifs chimiques ou biologiques, sont largement utilisés en agriculture pour réguler la croissance des plantes et contrôler les maladies et les insectes nuisibles, ce qui peut favoriser la croissance des cultures et améliorer le rendement des cultures. Cependant, l’utilisation généralisée des pesticides entraînera différents degrés de résidus dans les cultures ou les aliments et affectera ainsi la santé humaine. Les problèmes des résidus de pesticides ont non seulement attiré une grande attention des consommateurs, mais sont également devenus l’un des facteurs clés affectant la sécurité alimentaire.
Le carbendazime, en tant que fongicide à large spectre, a été utilisé pour lutter contre les maladies fongiques dans l’agriculture, la foresterie et les médicaments vétérinaires. Cependant, le carbendazime est classé dans la catégorie des produits chimiques dangereux par l’Organisation mondiale de la santé et a été classé dans la liste prioritaire des produits chimiques perturbateurs endocriniens par la Commission européenne. Ces dernières années, il est évident que l’utilisation généralisée du carbendazime avec dépassement de gamme et surdosage et le fait que le carbendazime est difficile à dégrader conduisent tous deux au problème des résidus de carbendazime en agriculture. Bien que l’effet toxique du carbendazime soit signalé depuis les années 1980, la toxicité du carbendazime devient un sujet brûlant en raison de l’inquiétude croissante concernant les perturbateurs endocriniens environnementaux. Le carbendazim a été interdit dans plusieurs pays en raison de ses impacts négatifs sur l’environnement et la santé tels que les perturbations du développement et de la reproduction, la toxicité et la mutagénicité. Les effets indésirables du carbendazime sur les paramètres biochimiques, histopathologiques et hématologiques du foie, des reins et des glandes endocrines et leurs niveaux hormonaux ont été illustrés chez le rat. De plus, il nécessite une étude plus approfondie sur la faible concentration due aux résidus de carbendazime.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), en tant que modèle de recherche important, est largement utilisé pour effectuer une évaluation. Selon Amrit et al. , C. elegans présente de nombreux avantages, tels que la petite taille, le temps de génération rapide, la facilité de culture en laboratoire et la courte durée de vie des adultes. C. elegans a été choisi dans cette étude comme organisme modèle pour évaluer la toxicité d’une faible concentration de carbendazime, qui peut être considérée comme une valeur de référence pour l’application du carbendazime en agriculture.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Produits chimiques et Souches
Carbendazime (pureté ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, Chine) a été dissous dans du N, N-diméthylformamide (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, Chine) pour produire une solution originale de carbendazim à 1 g / L. Les concentrations de DMF étaient de 0,1 % dans les solutions d’exposition finale (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/L). 0,1% de DMF sans carbendazime était le groupe témoin. C. elegans (type sauvage N2) a été obtenu à l’origine auprès du Caenorhabditis Genetics Center (Université du Minnesota, MN, États-Unis). Les nématodes ont été cultivés sur des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencées avec Escherichia coli OP50 à 20°C comme décrit. Les larves L1 de C. elegans ont été collectées en lavant les nématodes gravides avec un mélange de blanchiment (NaOH 1 M, NaHOCl 10%).
2.2. Létalité
Des solutions originales de carbendazim (1 g /L) ont été diluées avec du milieu liquide S (1,12 g de K2HPO4, 5,92 g de KH2PO4 et 5,85 g de NaCl ont été dilués avec 1 L d’eau) pour obtenir les concentrations finales de carbendazim de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, et 1 mg / L, qui contenait 0,1% de DMF. Le milieu liquide avec 0,1% de DMF était le groupe témoin. 30 nématodes (L4) ont été testés dans des plaques à 96 puits pour chaque concentration. La survie des nématodes a été comptée au microscope après une culture de 24 heures dans l’incubateur. Le processus du test est basé sur la méthode de Xiang et al. . Trois expériences parallèles ont été nécessaires.
2.3. Comportement de locomotion
Au moins 10 C. elegans (L4) ont été prélevés au hasard dans chaque concentration pour déterminer le comportement de la locomotive, qui a été enregistré à la fois par la fréquence des coups de tête et les temps de courbure du corps. Le nombre de fréquence de battements de tête a été compté par les changements dans la direction de flexion au milieu du corps de C. elegans en 1 min. La mesure de la courbure corporelle a été définie comme le temps des changements de direction de la partie des nématodes cultivés dans NGM sans E. coli OP50 dans les 30 s.
2,4. Essais de croissance et de développement
C. elegans exposé au carbendazime pendant 24 h a été analysé. La longueur corporelle des nématodes exposés au carbendazime a été évaluée par le logiciel Image J. La progéniture de chaque C. les elegans des larves L4 jusqu’au jour 1 ont été enregistrés au stade L3 après avoir été transférés individuellement dans une nouvelle plaque tous les jours jusqu’à ce que la reproduction cesse. Au moins trois essais parallèles ont été effectués.
2.5. Analyse de la durée de vie
Tous les C. elegans testés pour la durée de vie ont été cultivés dans le même état à 20 ° C. Les C. elegans synchronisés ont été cultivés dans des plaques NGM avec différentes concentrations de carbendazime jusqu’au jour 4. Les nématodes testés seraient ensuite transférés dans de nouvelles plaques NGM tous les 2 jours. Survivant et mort C. les elegans ont été enregistrés quotidiennement (à partir du premier jour de l’âge adulte) jusqu’à ce que tous les nématodes de chaque concentration soient morts. Au moins trois essais parallèles ont été effectués.
2.6. La détermination des dommages oxydatifs
ROS intracellulaires a été mesurée avec le diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluoroscéine (H2DCFH-DA), qui est de loin la sonde de détection réactive de l’oxygène la plus courante et la plus sensible. Les C. elegans de type sauvage N2 ont été lavés dans du tampon M9 puis perturbés par ultrasons. Le surnageant a été analysé le niveau de ROS suivant l’instruction du kit ROS. La concentration de travail finale de H2DCHE-DA était de 10 μΜ. Les longueurs d’onde d’excitation et d’absorbance d’émission étaient respectivement de 485 nm et 535 nm. Au moins trois essais parallèles ont été effectués.
La superoxyde dismutase totale intracellulaire (T-SOD) a été déterminée selon les instructions du kit T-SOD acheté à l’Institut de bioingénierie de Nanjing Jiancheng. Après avoir été lavés trois fois avec du M9, les nématodes examinés ont été perturbés par ultrasons et ont réagi avec un kit T-SOD. La longueur d’onde d’absorbance était de 550 nm. De plus, le surnageant a été utilisé pour détecter le niveau de protéine pour chaque concentration, dans laquelle la longueur d’onde d’absorbance était de 595 nm. Au moins trois essais parallèles ont été effectués.
2.7. Analyse des données
Toutes les données ont été données sous forme de moyenne ± erreur-type de la moyenne (MEB) en utilisant une ANOVA unidirectionnelle. Les graphiques ont été présentés à l’aide d’Origin 8.5 et de GraphPad Primer 7, et l’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel SPSS 19.0. Le niveau de signification statistique a été réalisé en utilisant et.
3. Résultats
3.1. Détermination du Comportement de locomotion de C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
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Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans après des expositions aiguës au carbendazime en analysant les données sur la fréquence des coups de tête et les temps de flexion corporelle des nématodes (Figures 1 (a) et 1(b)). Les deux ont montré des diminutions significatives aux concentrations de carbendazimes allant de 0,01 µg/L à 100 µg/L (). De plus, les coups de tête des nématodes exposés à 100 µg/L ont diminué à 68,27 %. Pour le test des courbures corporelles, lorsque les concentrations de carbendazime étaient de 10 µg /L et 100 µg /L, il a eu un effet inhibiteur significatif sur les courbures corporelles de C. elegans de 36,77% et 35,48% par rapport au test témoin, respectivement.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Détermination de la Croissance et du développement de C. elegans après des expositions aiguës au Carbendazime
Par rapport au groupe témoin (Figures 1 (c) et 1(d)), la longueur et la surface corporelle ont été significativement () réduites dans les groupes exposés de 0,01 µg /L à 100 µg /L. Les deux ont été diminuées de 19,16% et 22,15% au traitement de 0,01 µg/L par rapport au groupe témoin, respectivement. La concentration de 10 µg / L a présenté les impacts les plus négatifs, et la longueur du corps et la surface corporelle de C. elegans ont été diminuées de 35,21% et 65,22% par rapport au groupe témoin, respectivement.
3.3. Détermination de la taille des couvées de C. elegans après une exposition aiguë au Carbendazime
Selon la figure 2, la taille des couvées des nématodes a diminué significativement () dans les groupes de traitement de 0,1 µg /L à 100 µg /L. La taille des couvées de C. elegans a diminué de manière la plus significative, qui a diminué à 43,71% avec le traitement de 10 µg/L par rapport au groupe témoin.
3.4. Détermination de la durée de vie de C. elegans après une exposition aiguë au Carbendazime
La durée de vie de C. elegans a été significativement inhibée de 0,01 µg/L à 100 µg/L de carbendazime selon la courbe de durée de vie illustrée à la figure 3. Les résultats ont montré que la durée de vie de C. elegans était réduite de 24 à 20 jours avec le traitement de 0,01 µg/L de carbendazime. La durée de vie des nématodes traités avec 0,01 µg/L de carbendazime a été réduite de 20,00%. Lorsque la concentration d’exposition au carbendazime était de 100 µg/L, la durée de vie de C. elegans était la plus réduite de 45,83 %.
3.5. Les effets d’une exposition aiguë au Carbendazime sur le Système antioxydant de C. elegans
Les niveaux de ROS de C. elegans témoin et traité à l’exposition au carbendazime de différentes concentrations sont illustrés à la figure 4 (a). Il a été indiqué que le taux de ROS intracellulaire était significativement augmenté () dans des plages allant de 0,01 µg/L à 100 µg/L de carbendazime. Par rapport au contrôle, le taux de ROS a été augmenté au maximum de 70,60% avec le traitement de 10 µg / L. Selon les résultats des taux de SOD intracellulaires, il a augmenté au traitement de 0.01 µg/L à 100 µg/L de carbendazime (figure 4(b)). Le taux de SOD a été augmenté de 10,70% à 0,1 µg/L de carbendazime par rapport au groupe témoin.
(a)
(b)
(a) (b)
4. Discussion
Le carbendazime, en tant que fongicides, est largement utilisé en agriculture pour inhiber la croissance des champignons. L’utilisation du carbendazim a été interdite en Australie, dans la majeure partie de l’Union européenne et aux États-Unis en raison de sa toxicologie sévère et de sa nature persistante. Pour cette étude, c’était la première fois d’utiliser C. elegans en tant qu’organismes modèles pour évaluer les effets du carbendazime sur le comportement des locomotives, la croissance et le développement, la reproduction, la durée de vie et les systèmes antioxydants. De plus, les résultats ont montré qu’il avait une influence négative sur C. elegans.
Selon la CL50 de 24 h, la concentration de toxicité aiguë de C. elegans exposé à différentes concentrations de carbendazime est de 0,867 mg/L. La CL50 de 96 h de carbendazime en réponse au poisson zèbre a été illustrée comme étant de 1,75 mg/L. Les œufs de carpe prussienne Carassius gibelio ont montré les effets toxiques à la concentration de 0,036 mg / L. Des études ont montré que la croissance et le développement de Navicula sp. est inhibée par le carbendazime avec une valeur 24 h-CE50 de 2,18 mg /L. Bien que le taux de croissance des algues soit récupéré après une exposition de 72 h, la teneur en chlorophylle-a reste significativement diminuée lorsque le traitement du carbendazime était au-delà de 0,5 mg /L. Dans ce présent, C. elegans exposés à une faible concentration de carbendazime ont été sélectionnés pour évaluer ses effets en fonction de la concentration réelle de l’exposition quotidienne humaine. De faibles concentrations de carbendazime ne signifient pas qu’il est sûr. Le carbendazime présente des impacts biologiques négatifs à des doses beaucoup plus faibles dans certaines études.
Le comportement de la locomotive a été évalué pour évaluer la neurotoxicité de C. elegans (larve L4) après une exposition de 24 h au carbendazime. Les résultats ont montré que le carbendazime pouvait avoir des effets négatifs sur le comportement des locomotives grâce à la détection des chocs de la tête et de la flexion du corps de C. elegans, qui étaient tous deux plus sensibles dans le groupe d’exposition le plus élevé. Le comportement locomotive des embryons de poisson zèbre exposés au carbendazime est sensible. Des études antérieures ont montré que les poissons ont un comportement anormal lorsque les concentrations sublétales de carbendazime sont de 0,22 à 0,43 mg / L.
Les malformations développementales pourraient également être l’une des raisons de la locomotion anormale. La croissance et le développement de C. elegans ont été mesurés dans notre étude. Les résultats ont montré que la longueur corporelle et la surface corporelle de C. elegans étaient significativement rétrécies au traitement dépassant 0,01 µg/L de carbendazime. La croissance normale des vertébrés est liée à l’homéostasie métabolique de l’hormone thyroïdienne. Williams et coll. ont indiqué que le carbendazime pourrait provoquer une perte de sperme après l’implantation, une malformation fœtale et une croissance et un développement lents.
La toxicité pour la reproduction du carbendazime a été démontrée que le carbendazime pouvait inhiber la polymérisation des microtubules des cellules fongiques et des mammifères, provoquant une perturbation de l’assemblage des microtubules en agissant avec la β-tubuline, ce qui a pour conséquence d’altérer la ségrégation des chromosomes dans le processus de division cellulaire. La formation de microtubules par des liaisons non covalentes de tubuline α et β est responsable de la ségrégation chromosomique dans le processus de mitose et de méiose. La taille des couvées de C. elegans diminue de manière significative à une concentration de carbendazime de 0,1 µg/L. Il a été constaté que le carbendazime affecte les systèmes de reproduction chez les cailles et les hamsters japonais. Il a été conclu que la durée de vie de C. elegans était significativement réduite avec une concentration de carbendazime ≥ 0,01 µg / L sur la base de notre étude. Des études ont montré que le carbendazime a conduit à l’infertilité et à la toxicité pour le développement et manifeste une toxicité embryonnaire, une apoptose des cellules germinales et une tératogenèse chez différentes espèces de mammifères.
L’apoptose est une mort cellulaire programmée complexe, qui est un phénomène hautement régulé caractérisé par une série de processus cellulaires. De nombreuses études ont montré que la production de ROS induite par le stress oxydatif est liée à la mort cellulaire apoptotique. Notre étude a révélé que le carbendazime pourrait induire une augmentation significative du niveau de valeurs de ROS et une petite augmentation du niveau de valeurs de SOD. Le stress oxydatif causé par la pollution de l’environnement induit l’expression accrue de ROS et endommage par la suite le système de défense antioxydant. La SOD est responsable de la détoxification des radicaux libres toxiques et de leurs activités, qui est utilisée pour évaluer le niveau de stress oxydatif et le statut antioxydant cellulaire. La métalloenzyme SOD accélère la transformation des radicaux superoxyde cytotoxiques endogènes en H2O2, et l’augmentation des niveaux d’expression de SOD peut contribuer à améliorer les activités enzymatiques afin d’éliminer les radicaux superoxyde induits par le carbendazime et de prévenir l’apparition d’un dysfonctionnement cellulaire lors de l’exposition au carbendazime. Des concentrations plus élevées de carbendazime pourraient provoquer un stress oxydatif sévère, qui détruit par la suite l’équilibre de l’homéostasie cellulaire et favorise l’apoptose. Cependant, le carbendazime à de faibles concentrations pourrait encore endommager de manière significative le système reproducteur selon nos résultats.
5. Conclusion
À notre connaissance, la présente étude a évalué pour la première fois l’innocuité du carbendazime exposé à C. elegans. Il a démontré que le carbendazime pouvait avoir un effet néfaste sur le comportement de la locomotive, le développement et la croissance, la reproduction, la durée de vie et le système antioxydant de C. elegans. J’espère qu’il doit accorder plus d’attention à l’application du carbendazime en fonction des résultats. En outre, la sécurité d’utilisation du carbendazime doit être évaluée plus avant, en particulier la toxicité de la bioaccumulation et les effets génotoxiques potentiels.
Disponibilité des données
Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article.
Conflits d’intérêts
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par la Fondation Nationale des Sciences naturelles de Chine (31501569).
