Résultats

Nous avons d’abord évalué si CD63 et la H, K-ATPase résident dans le même compartiment subcellulaire dans les cellules pariétales gastriques. Des travaux antérieurs ont montré que les cellules pariétales du rat expriment des niveaux élevés de CD63 (22). La microscopie à immunofluorescence sur des coupes congelées d’estomac de rat indique que le CD63 est présent dans la plupart des cellules de l’estomac de rat, y compris les cellules pariétales (Fig. 1 BIS). CD63 se colocalise partiellement avec le HKa dans les cellules pariétales. De plus, nous avons analysé une préparation TVE hautement purifiée provenant d’estomac de porc (un cadeau aimable de C. T. Okamoto). La H, K-ATPase contribue ≈50% de la teneur en protéines dans des préparations similaires (23). L’analyse par Western blot indique que le CD63 est abondamment présent dans cette préparation purifiée de TVEs (Fig. 1B).

Pour étudier une éventuelle interaction in situ entre CD63 et la H, K-ATPase, nous avons effectué des expériences de traction vers le bas en utilisant de la lectine de tomate biotinylée. Des études antérieures ont montré que cette lectine se lie spécifiquement et uniquement au HKß dans les préparations gastriques (24-27). Nous avons épongé une préparation TVE avec du mAb anti-HKß et de la lectine de tomate biotinylée pour confirmer que la lectine s’associe spécifiquement au HKß glycosylé (Fig. 1C). Nous avons ensuite utilisé de la lectine de tomate biotinylée pour isoler les protéines qui interagissent avec le HKß dans la préparation TVE. L’analyse par Western blot indique que le CD63 est précipité par la lectine de tomate (Fig. 1D), démontrant que CD63 et la H, K-ATPase s’associent in situ et suggérant que cette association peut être physiologiquement pertinente. Un prétraitement de la préparation TVE avec du SDS à 4%, suivi d’une dilution de 20 fois dans du tampon de lyse, a considérablement réduit la quantité de CD63 précipitée. La quantité de HKß précipitée n’a pas été altérée par ce traitement (données non présentées). Ces données suggèrent que la présence de CD63 dans le pull-down est attribuable à son association avec le HKß et non à une association directe entre le CD63 et la lectine de tomate.

Pour étudier plus avant la signification fonctionnelle de l’interaction entre CD63 et le HKß, nous avons transfecté des cellules COS-7 avec un ADNc codant pour le HKß de lapin soit individuellement, soit conjointement avec un ADNc codant pour une construction CD63 marquée par un DRAPEAU (CD63-FL). Nous avons démontré que le HKß n’a pas besoin de s’assembler avec le HKa pour atteindre la surface cellulaire dans les cellules COS transfectées (20). Nous avons utilisé une construction CD63 qui porte une étiquette d’épitope de DRAPEAU à son extrémité N parce que l’extrémité C de CD63 contient un motif à base de tyrosine qui est nécessaire au trafic intracellulaire de cette tétraspanine (13).

Les cellules COS cotransfectées avec le HKß et le CD63-FL ont été soumises à une immunoprécipitation à l’aide d’un pAb anti-FLAG. L’analyse par Western blot du matériau immunoprécipité indique que le HKß coprécipite avec le CD63 (Fig. 2, HKß+ CD63-FL). Les protéines CD63-FL et HKß coimmunoprécipitent dans une variété de détergents, y compris 2% CHAPS, 1% Brij 96 et 1% Triton X-100. L’association entre CD63 et le HKß constitue l’un des rares complexes de tétraspanine décrits qui survit à la solubilisation dans le Triton X-100 et est donc susceptible de représenter une interaction directe (28). La sous-unité β a deux formes: ßm (mature), qui est modifiée avec des glucides complexes, et ßc (core), qui est modifiée avec des glucides riches en mannose (29). Les deux formes coprécipitent avec CD63, bien que le rapport ßc/ßm dans le précipité varie en fonction des conditions de solubilisation.

Le HKß n’a pas été détecté dans les immunoprécipitations de DRAPEAU effectuées sur des cellules transfectées avec le HKß seul, démontrant que le DRAPEAU pAb n’interagit pas avec la sous-unité β (Fig. 2, HKß). Le HKß ne coimmunoprécipite pas avec le FLAG pAb à partir d’un mélange (50:50, vol/ vol) de lysats préparés à partir de cellules transfectées individuellement avec le CD63-FL et la sous-unité β, confirmant que l’interaction se produit in vivo (Fig. 2, deuxième voie). Les échantillons incubés avec le FLAG pAb ne précipitent pas la protéine lysosomale Lamp-1, ce qui indique que l’interaction entre CD63-FL et le HKß est spécifique et non un artefact de solubilisation incomplète du compartiment CD63 (Fig. 2).

Nous avons ensuite examiné si l’interaction entre HKß et CD63 affecte la localisation subcellulaire de la sous-unité β. Le HKß est présent à la surface cellulaire dans les cellules COS transfectées transitoirement (Fig. 3 A–C). Il y a une redistribution prononcée de la sous-unité β en vésicules intracellulaires contenant du CD63 lorsque les cellules COS sont cotransfectées à la fois avec le HKß et le CD63-FL (Fig. 3 D-F). Pour exclure la possibilité que cette localisation altérée puisse être un effet non spécifique de la surexpression de CD63, nous avons étudié l’effet de l’expression de CD63 sur la distribution de AQP4. AQP4 est un canal d’eau présent dans les membranes plasmiques basolatérales des cellules pariétales. Il ne subit pas d’endocytose et d’exocytose régulées avec la H, K-ATPase (30, 31). Ce canal ne coimmunoprécipite pas avec le CD63-FL dans un lysat Triton X-100 de cellules COS cotransfectées (Fig. 4 BIS). Lorsque des cellules cotransfectées sont visualisées par microscopie confocale à immunofluorescence, AQP4 n’est pas présent dans le compartiment contenant CD63 (Fig. 4B), indiquant que la redistribution induite par le CD63 dans les vésicules intracellulaires est spécifique des protéines qui interagissent avec cette tétraspanine.

Pour étudier les mécanismes de la redistribution médiée par le CD63 du HKß, nous avons profité de travaux récents qui ont caractérisé le trafic intracellulaire du CD63. Rous et coll. (13) ont démontré que le motif à base de tyrosine présent à l’extrémité C terminale de CD63 interagit avec les sous-unités adaptatrices μ2 et μ3. La protéine μ2 est un membre du complexe hétérotétramérique AP-2. Ce complexe est présent au niveau de la membrane plasmique et relie les protéines cargo à la couche de clathrine, médiant leur endocytose (14). La protéine μ3 est un membre du complexe hétérotétramérique AP-3. Ce complexe participe au ciblage lysosomal et se trouve à la fois dans le réseau trans-Golgi et dans un compartiment vésiculaire qui se colocalise partiellement avec les endosomes (12). Lorsque le motif à base de tyrosine YEVM de CD63 est muté en AEVM, CD63 est incapable d’interagir avec μ2 ou μ3 et est principalement exprimé sur la surface cellulaire (13). Lorsque le HKß est coexprimé avec la construction CD63-AEVM étiquetée en DRAPEAU, CD63-AEVM et la sous-unité β sont réparties à la surface de la cellule (Fig. 3 G-I). Ainsi, la distribution intracellulaire du HKß est affectée par des signaux de trafic intégrés dans la queue cytoplasmique CD63.

Lorsque la séquence YEVM de la queue de CD63 est mutée en YEVI, le motif modifié continue d’interagir avec μ3 mais ne s’associe plus à μ2 (13). Le CD63-YEVI est localisé principalement dans le compartiment endosomal–lysosomal tardif, probablement parce que la protéine tétraspanine altérée se déplace directement dans ce compartiment après son passage biosynthétique initial à travers le Golgi (13). La petite population de CD63-YEVI qui atteint la membrane plasmique présente une intériorisation altérée car elle ne peut plus interagir avec μ2 (13). Lorsque le HKß et une construction CD63-YEVI marquée par un DRAPEAU sont coexprimés dans les cellules COS, une grande partie du CD63-YEVI est localisée dans le compartiment endosomal–lysosomal tardif; cependant, la sous-unité β reste à la surface cellulaire et n’est pas redistribuée dans un compartiment intracellulaire (Fig. 3 J-L). L’analyse de la coimmunoprécipitation confirme que le HKß peut s’associer à la fois au CD63-YEVI et au CD63-AEVM (données non représentées). Ces données suggèrent que pour que le HKß soit distribué dans un compartiment intracellulaire CD63 positif, ces protéines doivent interagir à la surface de la cellule et être endocytées sous forme de complexe.

Pour déterminer si le HKß détecté dans les vésicules intracellulaires correspond à une protéine endocytée à la surface de la cellule, nous avons observé l’internalisation de la sous-unité β en présence et en absence d’expression exogène de CD63. Les cellules COS ont été cotransfectées avec le HKß et le CD63-FL. Les cellules ont ensuite été refroidies à 4 °C pour arrêter l’endocytose et marquer la surface avec le HKß mAb. Les cellules marquées ont été incubées à 37°C pendant 40 min pour permettre la reprise de l’endocytose. Après l’incubation, les cellules ont été refroidies à 4°C et marquées en surface avec des IgG anti-souris de chèvre conjuguées Cy5. Les cellules ont été fixées et incubées avec du pAb anti-DRAPEAU et ont ensuite été marquées avec des IgG anti-souris de chèvre conjuguées à l’isothiocyanate de fluorescéine et des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées à la rhodamine. Ainsi, le HKß resté à la surface a été visualisé sur le canal Cy5, le HKß intériorisé a été visualisé sur le canal isothiocyanate de fluorescéine et le CD63-FL a été visualisé sur le canal rhodamine. Cette analyse a démontré que la sous-unité β internalisée se colocalise avec CD63, suggérant que le pool du HKß qui est colocalisé avec CD63 est dérivé par endocytose de la membrane cellulaire (Fig. 5 E-H). Les cellules qui ne surexpriment pas CD63 présentent une sous-unité β beaucoup moins intériorisée après une incubation de 40 min (Fig. 5 A–D).

Pour quantifier l’internalisation du HKß et vérifier en outre que le HKß et le CD63 s’associent à la surface de la cellule, nous avons effectué des expériences de biotinylation à la surface de la cellule. Dans la première expérience, des cellules COS ont été transfectées avec la sous-unité β seule et biotinylées avec de l’ester de biotine-SS-N-hydroxysuccinimide à 4 °C. Des échantillons en double ont ensuite été incubés à 37 °C pendant différentes durées pour permettre la reprise de l’endocytose. Les cellules ont été ramenées à 4 ° C, et une plaque de chaque point temporel a été dépouillée de la biotine restante à la surface des cellules par exposition à l’agent réducteur imperméable à la membrane MesNa. Les cellules ont été lysées et incubées avec des billes de streptavidine. Les protéines associées aux billes de streptavidine ont été séparées par SDS/PAGE et les membranes ont été sondées avec le HKß mAb (Fig. 6 BIS). La fraction de sous-unité β à la surface de la cellule ne change pas sensiblement au fur et à mesure de l’internalisation à 37°C. Après les 10 premières minutes, une petite fraction du HKß marqué en surface est séquestrée à l’intérieur de la cellule et le rapport surface / HKß intériorisé reste élevé. Ces données suggèrent que la sous-unité β non associée au CD63 s’intériorise très lentement ou est internalisée mais recyclée rapidement à la surface, tout comme le récepteur de la transferrine.

Nous avons ensuite cherché à caractériser le comportement du HKß associé au CD63. Les cellules COS ont été cotransfectées avec le HKß et le CD63-FL. Les cellules ont été biotinylées et dépouillées comme décrit ci-dessus. Pour isoler la population de HKß associée au CD63, le lysat cellulaire a été incubé avec des billes d’agarose conjuguées à la protéine A et à la pAb FLAG. Le matériau immunoprécipité a été élué avec une petite quantité de tampon contenant 3% de SDS, dilué 30 fois avec 1% de Triton X-100 et incubé avec des billes de streptavidine. Les protéines associées aux billes de streptavidine ont été séparées par SDS/PAGE et sondées avec le HKß mAb (Fig. 6B). Pour les cellules qui n’ont pas été soumises à un protocole de stripping, le signal détecté dans ce Western blot représente le pool total de sous-unités β marquées en surface associées au CD63, y compris les complexes qui se trouvaient encore au niveau de la membrane plasmique et les complexes qui avaient été internalisés en vésicules. Pour les cellules soumises à un protocole de stripping, le signal représente la population de sous-unité β associée à CD63 qui était présente à la surface cellulaire lors de la biotinylation et qui a ensuite été intériorisée et protégée de la bande de MesNa.

Au moment de 0 min, le HKß biotinylé est facilement détecté dans les immunoprécipités anti-FLAG provenant de cellules non déclenchées, démontrant que le HKß et le CD63 sont capables de s’associer à la surface cellulaire. La totalité du HKß biotinylé récupéré au point temporel de 0 min est sensible à la bande de MesNa. La quantité de sous-unité β biotinylée associée à CD63 protégée du réactif MesNa augmente à mesure que l’on laisse incuber les cellules à 37°C. En effet, la quantité de HKß présente en surface et associée à CD63 à 0 min est sensiblement la même que la quantité de HKß associée à CD63 et protégée du stripping à 45 min. Ces résultats suggèrent que la sous-unité β associée au CD63 est intériorisée et ne retourne pas à la surface cellulaire.