Résultats et discussion

Chez les mammifères, l’activité de la Cdc42 s’est avérée importante dans la régulation de la différenciation des cellules souches/progénitrices de la peau en cellules du follicule pileux, le contrôle de la polarité tige/progénitrice neuroépithéliale et de la bifurcation hémisphérique du cerveau, et la régulation du nombre de cellules et de la croissance pendant la période de développement périnatal (6-9). Fait intéressant, un examen de l’activité de Cdc42 chez des souris adultes de différents âges en POIDS révèle que le taux relatif de Cdc42-GTP des animaux plus âgés est significativement plus élevé que celui des plus jeunes dans divers tissus, y compris le cœur, le cerveau, les poumons, le foie, la moelle osseuse, la rate et les reins (Fig. 1 A et données non illustrées), ce qui soulève la possibilité qu’une activité accrue du Cdc42 soit impliquée dans le processus de vieillissement normal.

Pour déterminer si l’activité accrue de Cdc42 associée au vieillissement naturel peut avoir une pertinence physiologique, nous avons examiné le régulateur négatif de Cdc42, Cdc42GAP, chez des souris ciblées par des gènes après avoir atteint l’âge adulte. Des études antérieures sur des souris knockout homozygotes Cdc42GAP au cours de la période périnatale ont indiqué que divers tissus / cellules contenaient une Cdc42-GTP élevée, et que les embryons / nouveau−nés du génotype Cdc42GAP− /- présentaient une taille d’organe / organisme réduite qui est liée à une augmentation de l’apoptose spontanée dans divers types de cellules (6). Chez les souris adultes Cdc42GAP−/-, l’activité Cdc42 était constitutivement plus élevée dans plusieurs types de tissus / cellules que celle des souris WT correspondantes, tandis que le taux de RhoA-GTP ou de Rac1-GTP restait similaire à celui du WT (Fig. 1 D; données non présentées), suggérant une activité spécifique de gain de Cdc42 chez les animaux adultes similaire à celle pendant la période périnatale. La majorité des souris Cdc42GAP−/− sont mortes pendant la période néonatale en raison de leur taille plus petite et de leur physique faible (6). Cependant, une proportion d’entre eux (≈7%) pourrait survivre à la période néonatale en famille d’accueil en nourrissant des femelles sans lien de parenté. Malgré une consommation régulière de lait et des concentrations sériques normales de glucose et d’insuline observées chez les souris homozygotes au cours de la période postnatale, la prise de poids des souris Cdc42GAP−/− a commencé à décélérer à l’âge de ≈3 mois par rapport à l’âge de ≈5 mois pour les souris en poids ou hétérozygotes, et le poids corporel des homozygotes matures a diminué de ≈30% en raison d’une diminution de la cellularité globale (Fig. 1 C et données non représentées). La durée de vie médiane des souris Cdc42GAP−/− était de ≈12 mois, alors que les souris témoins (en poids ou hétérozygotes) sont restées vitales jusqu’à un âge médian de ≈27 mois (Fig. 1 D). La courbe de survie des souris homozygotes est quelque peu différente de la courbe de Gompertz typique, mais est similaire à celles rapportées pour les animaux transgéniques BubR1 (un régulateur de point de contrôle mitotique) knockout (10) ou p44 (une isoforme courte du suppresseur de tumeur p53) (11). La cyphose et le manque de vigueur chez les souris Cdc42GAP−/− sont devenus évidents à l’âge de ≈12 mois (Fig. 1 E). Les souris Cdc42GAP−/− pelées à l’âge de 15 mois ont montré une nette réduction de la masse corporelle, une perte importante de tissu adipeux sous-cutané, une lordokyphose sévère et une atrophie musculaire (données non présentées). Une radiographie a montré un phénotype significatif de la cyphose et une densité minérale osseuse réduite (DMO) chez les souris Cdc42GAP−/− à l’âge de 15 mois (Fig. 1 F). Une autre quantification des os disséqués de souris Cdc42GAP-/- a révélé des réductions de 3 et 2,6 fois de la DMO dans le tibia et le fémur, respectivement (SI Fig. 7). De plus, les souris Cdc42GAP−/− mâles et femelles ont perdu leur fertilité à un âge plus précoce que celui des souris WT. Lors de l’accouplement entre les femelles Cdc42GAP-/- et les mâles en POIDS, les homozygotes sont devenus stériles à l’âge de 26 semaines contre 48 semaines pour le poids (Fig. 1 G). Ces observations indiquent que la carence en Cdc42GAP entraîne une augmentation constitutive du taux de Cdc42-GTP, une taille corporelle réduite, une cyphose précoce, une réduction de la DMO, une période de fertilité raccourcie et une durée de vie réduite chez les souris adultes.

Les coupes colorées de H&E dans le corps vertébral de la souris femelle âgée de 8 mois ont montré que les souris Cdc42GAP−/- avaient un cortex plus fin et courbé et des trabécules plus fines que les souris WT (Fig. 2 Bis). De même, les sections de longitude du fémur des souris homozygotes ont montré une réduction de l’épaisseur de l’os cortical par rapport à celle des souris WT (données non représentées). Ces observations sont en accord avec l’aspect brut et les caractéristiques cliniques de l’ostéoporose. La masse de la rate, du foie et des reins des souris adultes Cdc42GAP−/− était réduite en raison d’une diminution de la cellularité globale, ce qui était évident dans les sections colorées en H&E de la rate, et les régions de pulpe blanche contenant des cellules T et B de la rate Cdc42GAP-/-âgée de 12 mois étaient nettement réduites par rapport à celles des souris WT adaptées à l’âge (Fig. 2 B et données non montrées), suggérant une atrophie lymphoïde prononcée chez les homozygotes. En accord avec la réduction apparente du tissu adipeux sous-cutané, l’analyse histologique des coupes transversales de la peau dorsale a révélé une absence presque totale de cellules adipeuses s.c. chez des souris Cdc42GAP-/- âgées de 9 mois (Fig. 2 C). Une perte de masse musculaire et une atrophie musculaire ont également été confirmées par l’examen de coupes de muscles squelettiques tachés de H&E de souris Cdc42GAP-/- âgées de 12 mois et de souris WT adaptées à l’âge (Fig. 2 C). Les souris Cdc42GAP−/− ont également montré une réduction marquée de la régénération des poils après l’ablation des poils dorsaux par rasage, tandis que le POIDS adapté à l’âge et au sexe a montré une repousse des poils robuste (SI Fig. 8). La capacité à tolérer des contraintes, telles que la cicatrisation des plaies, une activité associée au vieillissement (12) des souris Cdc42GAP-/−, a été significativement réduite par rapport à celle de WT (Fig. 2 D). L’analyse histopathologique des coupes de la plaie a montré peu de réépithélialisation dans le bord de la plaie des souris Cdc42GAP-/-, alors que la réépithélialisation complète des souris WT était évidente 4 jours après l’introduction de la plaie (Fig. 2 E). En plus de ces observations, un certain nombre de phénotypes hématopoïétiques des souris homozygotes, y compris l’anémie, une diminution de la cellularité de la rate et de la moelle osseuse, des défauts de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse et une sensibilité accrue des cellules souches hématopoïétiques à la mobilisation induite (13, 14) étaient compatibles avec un vieillissement précoce du système hématopoïétique. Fait important, un examen de jeunes souris homozygotes (< âgées de 4 mois) avant la manifestation de phénotypes évidents n’a révélé aucune anomalie majeure de l’os, de la peau et de la rate (SI Fig. 9 A et B et données non montrées), suggérant que les phénotypes vieillissants des souris Cdc42GAP-/- ne sont pas dus à un trouble du développement précoce. En outre, un certain nombre de phénotypes des souris homozygotes, y compris une réduction de l’épaisseur de l’os cortical, une cyphose et une perte de masse musculaire et de tissus épidermiques, ont pu être trouvés chez les souris WT âgées (> 2,5 ans) (SI Fig. 9 C et D et données non représentées). Comme résumé dans le tableau 1 de l’IS, ces résultats fournissent collectivement des preuves solides que la carence en Cdc42GAP provoque des phénotypes ressemblant à un vieillissement prématuré chez les animaux.

La coloration des tissus des adultes de 9 mois, y compris le foie, les reins et la rate, pour la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) a révélé une forte activité de ce marqueur de sénescence chez les souris homozygotes qui n’était pas détectable dans les tissus des souris WT adaptées à l’âge et au sexe (Fig. 3 A et SI Fig. 10), indiquant que les tissus Cdc42GAP−/−adultes peuvent subir une sénescence prématurée. Fait intéressant, l’augmentation de l’apoptose des tissus homozygotes observée pendant la période périnatale était absente chez les homozygotes adultes lorsque l’activité élevée de SA-β-gal était évidente (réf. 6 et données non représentées). Les cellules de fibroblastes embryonnaires Cdc42GAP−/−souris (MEF), qui contiennent ≈3 fois plus de Cdc42-GTP mais des teneurs normales en Rac1-GTP ou RhoA-GTP par rapport aux cellules MEF en POIDS (6), ont présenté une activité SA-β-gal significativement accrue et ont accumulé une morphologie sénescente aplatie et agrandie à partir du passage 6 lorsque les cellules MEF en POIDS étaient négatives pour l’activité SA-β-gal et étaient de morphologie contractuelle (Fig. 3b et SI Fig. 11). Les cellules Cdc42GAP−/−MEF ont commencé à ralentir leur croissance aux passages 5 à 7 lorsque les cellules MEF en POIDS appariées croissaient de façon exponentielle (Fig. 3c) (6), et elles ont subi une sénescence réplicative massive après le passage 7, alors que la plupart des cellules WT MEF n’ont pas atteint la sénescence avant le passage 13 (SI Fig. 11 et données non représentées). De plus, un pourcentage significativement plus élevé de cellules Cdc42GAP−/−MEF au passage 7 a formé des foyers plus grands dans le noyau que les cellules WT (SI Fig. 12). Ces résultats indiquent que le déficit en Cdc42GAP induit une sénescence tissulaire/cellulaire précoce.

Un facteur contribuant au vieillissement prématuré et à la sénescence cellulaire des mammifères est l’instabilité génomique accrue (15). L’analyse d’étalement par métaphase a montré que >30 % des splénocytes primaires de souris homozygotes âgées de 8 mois étaient aneuploïdes, alors que les splénocytes en POIDS correspondant à l’âge et au sexe n’avaient pas d’aneuploïdie détectable (Fig. 3 D), indiquant que le tissu Cdc42GAP-/- souffrait d’instabilité génomique. À l’appui de cette découverte, les cellules Cdc42GAP−/−MEF ont montré une augmentation significative des cellules à double noyau sous coloration DAPI par rapport aux cellules WT au passage 7 (SI Fig. 12). L’analyse du caryotype des passages ultérieurs des cellules MEF (passage 6-7) a en outre révélé que, bien que la plupart des chromosomes des cellules en poids (≈80%) soient restés intacts, 42% des cellules Cdc42GAP−/− contenaient au moins une aberration chromosomique, 20% en contenaient deux aberrations ou plus et 14% en contenaient trois ou plus (Fig. 3 E). Le pourcentage et le degré d’aneuploïdie ont également augmenté de manière significative dans les cellules Cdc42GAP−/−MEF, avec > 32% des cellules présentant un nombre anormal de chromosomes allant de 72 à 102, alors que la plupart des cellules en poids étaient diploïdes (Fig. 3 E et SI Fig. 13). L’analyse du caryotype des dommages chromosomiques indique que les aberrations des cellules MEF homozygotes étaient diverses, notamment la rupture des chromatides, la séparation prématurée des chromatides sœurs (caractéristique d’un point de contrôle défectueux de l’assemblage du fuseau), la translocation, les ruptures chromosomiques, le chromosome dicentrique et la fragmentation chromosomique (Fig. 3 F et SI Tableau 2), suggérant que la machinerie de réparation des dommages à l’ADN est compromise dans les cellules Cdc42GAP−/−. La coloration par immunofluorescence du phospho-H2 AX dans le noyau cellulaire, un marqueur de réponse aux dommages à l’ADN (16), montre que, bien que 10 % des cellules Cdc42GAP−/−MEF du passage 7 soient positives pour le marqueur des dommages à l’ADN, < 1 % des cellules en poids étaient positives (Fig. 3 G). La corrélation entre l’apparition et la progression des phénotypes de type vieillissement des souris Cdc42GAP-/− et le degré et la gravité observés des aberrations génomiques dans les cellules Cdc42GAP−/− soutient un rôle de Cdc42 dans le développement des caractéristiques progéroïdes.

Pour déterminer le mécanisme possible des dommages à l’ADN accumulés dans les cellules Cdc42GAP−/−, nous avons comparé le taux d’espèces réactives endogènes de l’oxygène (ROS) des cellules homozygotes avec celui des cellules WT, car Rac1 et Rac2, deux Rho GTPases étroitement apparentées, sont des régulateurs connus des ROS cellulaires (17). SI Fig. 14 montre que les cellules Cdc42GAP−/− ont affiché une activité ROS similaire à celle des cellules WT, indiquant que Cdc42GAP régule la stabilité génomique par un mécanisme endogène indépendant du ROS. En raison des similitudes de plusieurs phénotypes de souris Cdc42GAP−/− avec ceux d’un certain nombre de modèles de souris ciblés par des gènes de molécules de réparation des dommages à l’ADN, y compris les modèles de souris Brca1−/−p53+/−, Ku80−/− et Mtr−/−Wrn (12, 18, 19), nous avons également étudié la réactivité des cellules Cdc42GAP−/− passées précocement à divers agents de dommages à l’ADN. Dans le test de croissance de la réponse aux dommages à l’ADN, les cellules déficientes en Cdc42GAP ont montré un large défaut d’activité de réparation des dommages à l’ADN (Fig. 4), qui se manifestent par des pourcentages de mort cellulaire significativement plus élevés parmi les cellules homozygotes par rapport aux cellules en POIDS après traitement par des doses croissantes d’H 2O2, d’irradiation ionisante, de camptothécine, de méthyl-méthane sulfonate ou de mitomycine C. Ainsi, les diverses anomalies génomiques accumulées dans les passages ultérieurs des cellules Cdc42GAP−/− peuvent être attribuables, au moins en partie, à des activités altérées de réparation des dommages à l’ADN.

Une conséquence des dommages génomiques soutenus dans les cellules est l’induction de multiples gènes de réponse aux dommages de l’ADN et/ ou de sénescence (20, 21). Les expressions de p53, p21Cip1, p16Ink4a et phospho-p53 (Ser-15) dans les cellules Cdc42GAP−/−MEF étaient significativement plus élevées que celles des cellules WT MEF après des passages similaires, tandis que p19ARF dans les cellules homozygotes montrait une tendance similaire d’augmentation avec les passages, comme les cellules WT (Fig. 5 Bis). Les niveaux de protéines de p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) et le marqueur de dommages à l’ADN phospho-H2 AX dans les tissus Cdc42GAP−/− de souris âgées de 8 mois étaient également significativement plus élevés que ceux des tissus correspondants de souris WT appariées (Fig. 5 B). Ces résultats fournissent la preuve que l’activation de la voie régulée par la p53, p21Cip1 et p16Ink4a en particulier, est associée à une sénescence précoce induite par le déficit en Cdc42GAP. Pour examiner la question de savoir si une activité Cdc42 élevée dans les cellules déficientes en Cdc42GAP est suffisante pour tenir compte du phénotype de sénescence précoce, nous avons exprimé un mutant activateur de Cdc42, Cdc42F28L, dans les cellules MEF primaires WT et nous avons mesuré l’activité SA-β-gal des cellules en comparaison avec celle des cellules exprimant EGFP correspondantes à différents passages. L’expression de Cdc42F28L a provoqué une augmentation significative de la population cellulaire SA-β-gal positive (35% dans les cellules Cdc42F28L contre 7% dans les cellules exprimant l’EGFP) dans les cellules MEF à passage précoce (Fig. 5c), indiquant que l’activation de Cdc42 est suffisante pour l’induction d’une sénescence cellulaire précoce.

Pour explorer davantage la possibilité que le phénotype de sénescence des cellules Cdc42GAP−/− puisse être sauvé par un défaut p53, nous avons généré des souris Cdc42GAP+/−p53+/- et tenté de préparer des cellules MEF à partir du croisement. Sur 44 embryons, six avec le génotype Cdc42GAP-/-p53+/- et aucun du génotype Cdc42GAP−/−p53−/− ont été obtenus. Les cellules Cdc42GAP−/−p53+/−MEF ont augmenté à une vitesse comprise entre celle des cellules p53+/− et WT et ont montré une population sénescente basale comparable à celle des cellules p53+/− ou WT au passage 7, tandis que les cellules p53−/− et Cdc42GAP−/−MEF ont proliféré avec une courbe linéaire et une courbe de doublement de la population de courbure et étaient respectivement résistantes à la sénescence et sujettes à la sénescence à des passages similaires (Fig. 5 D et E). Ces résultats indiquent que la sénescence prématurée induite par l’activation de Cdc42 dépend de p53.

La durée de vie limitée des cellules et des animaux peut résulter d’une sénescence réplicative en réponse à divers stress, y compris des dommages à l’ADN (22), une érosion des télomères (23), des ROS (24) et/ou des oncogènes mal activés (25). Les souris Cdc42GAP−/− présentent un modèle animal de gain d’activité Cdc42 qui imite l’activation de Cdc42 induite par un signal mitogène (6) et permet d’évaluer les effets possibles de l’activation de Cdc42 sur la physiologie animale et cellulaire. Nous démontrons que la carence en Cdc42GAP provoque l’apparition précoce d’une sénescence dans les cellules et de phénotypes ressemblant à un vieillissement prématuré chez l’animal. En particulier, le ciblage du gène Cdc42GAP induit une augmentation globale de l’activité de Cdc42 et favorise l’instabilité génomique cellulaire avec une capacité réduite de réparation des dommages à l’ADN, qui à son tour peut activer p53 et p16 Ink4a, conduisant à une sénescence précoce (Fig. 5 F). Auparavant, Cdc42 s’est avéré être activé dans les cellules sénescentes pour moduler l’ajustement morphologique (26). Il a également été proposé d’être impliqué dans le changement morphologique cellulaire régulé par la p53, l’apoptose et la prolifération (27-29) et dans l’apoptose contrôlée par la kinase N-terminale C-Jun (30, 31), événements qui ont été associés à la sénescence cellulaire et au vieillissement animal (32, 33). Nos découvertes selon lesquelles l’activation de Cdc42 est associée au vieillissement naturel et que la carence en Cdc42GAP provoque un défaut de réparation des dommages à l’ADN pour permettre aux cellules d’accumuler des anomalies génomiques conduisant à une sénescence précoce suggèrent en outre un lien fonctionnel entre l’activité de Cdc42 et le vieillissement des mammifères.

Il a été démontré que l’activation de la voie p53 ou la perturbation de gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN ou la régulation de la stabilité génomique induisait un vieillissement précoce chez la souris (11, 12, 33, 34). Conformément aux observations précédentes selon lesquelles le Cdc42 pourrait ne pas être impliqué dans la régulation des activités du superoxyde cellulaire (17), nous avons constaté que les dommages accumulés à l’ADN dans les cellules Cdc42GAP−/− n’étaient pas associés à l’activité du ROS parce que les cellules homozygotes ne présentaient pas d’activité accrue du ROS. La délétion de Cdc42GAP provoque une réduction marquée de la capacité de réparation des dommages à l’ADN dans un large spectre, y compris les réponses à l’agent de réticulation de l’ADN et à l’inducteur de rupture à double brin ou à un brin, suggérant que l’activation prolongée de Cdc42 peut atténuer la capacité de réparation des dommages à l’ADN. La diversité des dommages génomiques trouvés dans les cellules Cdc42GAP−/− est également compatible avec un impact d’un défaut global de réparation des dommages à l’ADN. Les questions importantes qui restent à traiter comprennent quels déterminants moléculaires spécifiques sont impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN régulés par Cdc42GAP et quel(s) signal(s) en amont provoque une augmentation du Cdc42-GTP pendant le processus de vieillissement normal.