Discussion

La présente étude a révélé un rôle de la protéine de liaison au Ca luminal SR, CSQ2, dans la régulation du couplage excitation-contraction et de la CICR dans le cœur. Plus précisément, nous montrons que la surexpression de CSQ2 médiée par l’Ad augmentait considérablement l’ampleur des transitoires de Ca induits par l’ICa moyennés sur les cellules et des étincelles de Ca spontanées dans des cellules cardiaques isolées. L’analyse de la phase ascendante et du taux de changement de ces signaux de Ca a indiqué que leur taille accrue était due à la fin ralentie des flux de libération de Ca sous-jacents provenant du SR. En plus de prolonger la libération active de Ca, la dynamique de la recharge fonctionnelle des réserves de Ca de SR a également été ralentie dans les cellules avec des niveaux élevés de protéines CSQ2, comme l’indique le temps de récupération ralenti pour les étincelles de Ca répétitives. Nous avons essentiellement obtenu les résultats opposés dans les myocytes, dans lesquels les taux de CSQ2 étaient réduits par transduction antisens médiée par l’Ad. Ces myocytes ont montré une libération de Ca plus courte mais une restitution accélérée des sites de libération de Ca. De plus, dans les myocytes stimulés périodiquement avec une diminution des taux de CSQ2, l’application d’isoprotérénol a provoqué des oscillations arythmogènes intracellulaires. Ces résultats montrent que CSQ2 est un déterminant clé de la fonction de libération de Ca du SR qui agit en gouvernant la durée de libération de Ca et la réfractarité du site de libération. À la lumière des perturbations isoprotérénol-dépendantes observées dans le cycle rythmique du Ca dans les myocytes sous-exprimant CSQ2, nos résultats sont pertinents pour comprendre les mécanismes cellulaires des arythmies induites par les catécholamines liées à des mutations du gène CSQ2.

Mécanismes moléculaires de l’action de CSQ2. Nous attribuons les effets observés de CSQ2 sur la libération de Ca de SR à la capacité de cette protéine à fonctionner comme un tampon moléculaire qui contrôle le libre dans l’espace luminal de SR (voir schéma proposé à la Fig. 5). Il est connu des études sur les bicouches lipidiques que la liaison du Ca à l’aspect luminal du complexe RyR (c’est-à-dire le capteur luminal de Ca) augmente l’activité du canal, alors qu’à luminal abaissé, l’activité du canal est réduite (CE50 ≈ 1 mM; réf. 26). Étant donné que de nombreux RYR seraient dans un état activé à des niveaux normaux de Ca luminal au repos (≈1 mM), l’abaissement du luminal pendant le processus de libération diminuerait donc l’activité globale du canal (un processus appelé désactivation dépendante du Ca luminal; réf. 3). Nos résultats suggèrent qu’en stabilisant le luminal libre local à proximité des RYR pendant le processus de libération, CSQ2 ralentit la fermeture luminale dépendante du Ca du canal RyR, augmentant ainsi la quantité de Ca libérée du SR vers le cytosol. CSQ2 contrôle également la dynamique de récupération de l’intra-SR libre pendant la ré-absorption de Ca en servant de puits pour le Ca dans la lumière SR. Ainsi, CSQ2 potentialise non seulement l’efflux de Ca SR mais stabilise également le CICR en modulant la restitution fonctionnelle, ou l’état de préparation, des sites de libération de Ca après chaque libération. Récemment, nous avons invoqué un mécanisme similaire pour expliquer les effets des chélateurs de Ca de faible affinité (sels organiques) chargés dans le SR sur la libération de Ca (3). L’importance de nos résultats actuels est qu’ils montrent comment le processus de libération est contrôlé par une protéine endogène de liaison au Ca résidente du SR, CSQ2. Ils révèlent également les conséquences pathologiques de la réduction des quantités de CSQ2 dans le SR des cellules cardiaques.

Il a été proposé que CSQ2 pourrait affecter la fonction du canal de libération de Ca par des interactions directes avec des protéines comprenant le complexe du canal de libération de Ca (c’est-à-dire RyR, junctine et/ou triadine) (réf. 13; pour examen, voir réf. 9). Nos études n’ont révélé aucune différence considérable dans les paramètres de libération de Ca de SR entre les cellules contenant des taux environ 3 fois plus élevés de protéine CSQ2 et les cellules dans lesquelles des tampons organiques ont été chargés dans le SR(3). Ainsi, l’explication la plus simple de nos résultats est que les effets prédominants de CSQ2 sur la libération de Ca de la SR sont dus aux actions de tampon de cette protéine à l’intérieur de la SR. L’élucidation du mécanisme détaillé par lequel CSQ2 et les protéines associées telles que la junctine et la triadine régulent la libération de Ca doit attendre des études impliquant la manipulation des niveaux et l’expression des formes mutantes de ces protéines ayant des capacités altérées à interagir entre elles et le RyR.

Le taux maximal de libération de Ca des myocytes stimulés était similaire quelles que soient les quantités de CSQ2 exprimées dans le SR (Fig. 2B et 3D). Ces résultats soutiennent l’idée que CSQ2 contrôle la fin du processus de libération, mais ces résultats ne sont pas ce que l’on pourrait nécessairement prédire en fonction des effets tampons attendus de cette protéine dans le SR. En effet, le taux maximal de libération devrait être plus élevé dans les cellules avec des forces de tampon de Ca luminales accrues causées par un déclin ralenti de l’intra-SR libre, car, dans ces cellules, la diminution retardée du gradient de Ca à travers la membrane du SR devrait rendre des intensités de flux de Ca plus importantes. Plusieurs raisons possibles expliquent pourquoi cela n’a pas été observé. Une possibilité est que l’intra-SR libre initial puisse être plus faible dans les cellules CSQ2-surexprimant que dans les cellules CSQ2-sousexprimant. Bien qu’à l’état d’équilibre, le libre dans un compartiment fermé tel que le SR ne devrait pas être influencé par le nombre de sites de liaison au Ca (cela ne devrait influencer que la cinétique à laquelle l’intra-SR à l’état d’équilibre est atteint), il est possible qu’un véritable état d’équilibre n’ait pas été atteint dans nos expériences (c’est-à-dire, les myocytes subissant une stimulation à faible taux). Une autre possibilité est que la présence de niveaux élevés de protéine CSQ2 ralentit la diffusion du Ca dans l’espace luminal, ralentissant ainsi l’exode du Ca à travers les canaux ouverts. De toute évidence, davantage de recherches, tant expérimentales que théoriques, sont nécessaires pour résoudre ce problème.

Résiliation du CICR. La façon dont la CICR, un processus avec une propension inhérente à l’auto-régénération, est terminée a fait l’objet de recherches intenses, d’abord en utilisant des mesures des transitoires de Ca globaux et, plus récemment, en examinant les étincelles de Ca (3, 27-30). Une possibilité qui a été envisagée est que les canaux RyR subissent une inactivation ou une adaptation dépendante du Ca à la suite de la montée de du côté cytosolique du canal (27-29). Une autre possibilité est que le déclin de l’intra-SR fournit un signal actif pour la fermeture des RYR après leur ouverture (3, 30-32). Nous avons récemment trouvé des preuves expérimentales directes d’un rôle des changements induits par le Ca luminal dans l’activité de RyR (c’est-à-dire la désactivation dépendante du Ca luminal) dans la fin de la libération de Ca de SR en maintenant les niveaux de Ca intra-SR avec des tampons de Ca de faible affinité chargés dans les citernes de SR (3). En utilisant ces tampons, nous avons considérablement prolongé la durée de la libération active de Ca sous-jacente aux transitoires de Ca focaux et globaux dans les myocytes. En accord avec ces résultats, nos résultats actuels montrent que l’augmentation des niveaux du tampon de Ca luminal SR de grande capacité CSQ2 prolonge la durée de libération du Ca, tandis que la réduction des quantités de ce tampon endogène raccourcit la durée de libération, apparemment en ralentissant ou en accélérant la fermeture luminale dépendante du Ca des RYR, respectivement. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves convaincantes du rôle de la désactivation luminale dépendante du Ca des RYR dans l’arrêt du CICR. Bien que démontrant l’importance des changements dans le Ca luminal dans la terminaison de la libération du Ca SR, nos résultats n’excluent pas nécessairement la possibilité que des mécanismes supplémentaires, tels que l’inactivation ou l’adaptation du RyR aux sites de régulation du Ca cytosolique, puissent également influencer la terminaison de la libération du Ca.

Bien qu’il existe des preuves claires d’un rôle des changements de l’Ac luminale dans la terminaison des étincelles cardiaques (réf. 3; la présente étude), des études antérieures ont indiqué que les étincelles de Ca dans le muscle squelettique peuvent ne pas s’accompagner d’un épuisement substantiel du SR. Lacampagne et coll. (33) ont utilisé l’analyse cinétique d’enregistrements d’étincelles de Ca à haute résolution temporelle pour suggérer que le flux de libération de Ca sous-jacent à l’étincelle de Ca est constant dans les fibres musculaires des amphibiens. Étant donné que le flux de Ca de SR doit diminuer chaque fois que le SR tombe, ce résultat pourrait signifier que les niveaux de Ca luminaux restent stables pendant les étincelles de Ca. Ainsi, il est possible que les mécanismes de base responsables de la terminaison des étincelles soient différents dans le muscle cardiaque et le muscle squelettique. La réalisation d’études complémentaires dans ces deux types de cellules (modulation des taux de protéines CSQ dans les fibres musculaires squelettiques et mesures rapides de la cinétique de l’étincelle de Ca dans les myocytes cardiaques) devrait aider à clarifier cette question.

Pertinence pour le CPVT. L’un des aspects les plus importants de nos résultats est qu’ils montrent comment des niveaux réduits de CSQ2 peuvent provoquer des arythmies cardiaques au niveau cellulaire. La PCVT est une maladie arythmogène caractérisée par une syncope et une mort subite inductibles par l’exercice et la perfusion de catécholamine (34). Jusqu’à présent, quatre mutations ont été liées au CPVT. Trois de ces mutations semblent entraîner une diminution de l’expression de CSQ2 (17), et une mutation a été proposée pour conduire à une liaison perturbée du Ca (16). Nos résultats suggèrent que la cause sous-jacente de la CPVT pourrait être liée à une restitution anormale du mécanisme de libération de Ca causée par une réduction des niveaux de CSQ2 (Fig. 5). En raison de la plus faible concentration de sites de liaison au Ca dans le SR des cellules sous-exprimant CSQ2, le remplissage du magasin de Ca par la pompe SERCA se produit plus rapidement que dans les cellules normales. La recharge en magasin devient encore plus rapide lorsque l’activité de SERCA est stimulée par la protéine kinase A, ce qui explique potentiellement la dépendance des épisodes cliniques de CPVT aux catécholamines. Dans les myocytes présentant une diminution des taux de CSQ2, la récupération prématurée des canaux de libération de Ca à partir d’un état réfractaire luminal dépendant du Ca a conduit à des décharges spontanées et extrasystoliques de réserves de Ca de SR. Il est connu que la libération spontanée de Ca peut induire des courants intérieurs et des oscillations dans le potentiel membranaire, entraînant une arythmie déclenchée (4-7). Par conséquent, les perturbations observées dans la manipulation du Ca pourraient expliquer, au moins en partie, la pathogenèse du CPVT associée à des anomalies génétiques qui entraînent soit une activité de liaison au Ca réduite (16), soit des niveaux d’expression réduits de CSQ2 (17).

Comparaison avec des Études antérieures chez des Souris transgéniques. Nos résultats diffèrent des résultats précédents obtenus chez des souris transgéniques surexprimant CSQ2 (14, 15). Dans ces études, une surexpression de 10 à 20 fois de CSQ2 a augmenté la capacité de stockage du Ca SR des myocytes cardiaques isolés; cependant, le Ca luminal n’était pas disponible pour la libération, ce qui a entraîné une diminution des signaux de libération de Ca globaux et locaux. Ces changements dans la manipulation de l’AC se sont accompagnés de plusieurs altérations structurelles, fonctionnelles et biochimiques aux niveaux cellulaire et subcellulaire et du développement d’une hypertrophie et d’une défaillance cardiaques. D’autre part, la présente étude maintient les niveaux de protéines CSQ2 plus proches des niveaux physiologiques dans des conditions aiguës plutôt que chroniques; ainsi, ces données sont susceptibles de refléter plus précisément les conséquences physiologiques directes des changements des taux de protéines CSQ2 sur la manipulation du Ca intracellulaire. Ces résultats mettent en évidence les problèmes potentiels d’interprétation des effets de l’expression de haut niveau constitutive des protéines dans des modèles animaux transgéniques et la valeur d’études complémentaires dans des contextes plus aigus.

Conclusion. En conclusion, nous avons constaté que CSQ2 est un déterminant essentiel de la capacité du SR à stocker et libérer du Ca dans le muscle cardiaque. CSQ2 semble servir de réservoir de Ca facilement accessible pour le CICR et également de tampon de Ca actif qui module la fermeture locale dépendante du Ca luminal des RYR. Dans le même temps, CSQ2 stabilise le mécanisme CICR en ralentissant la recharge fonctionnelle des réserves de SR Ca. Un comportement de reprimage anormal des canaux de libération de Ca pourrait expliquer ou contribuer à des arythmies ventriculaires associées à des mutations du gène CSQ2.