Résumé

Différentes techniques sont disponibles pour l’isolement du Candida dans la cavité buccale. De telles méthodes jouent un rôle important dans le diagnostic et la prise en charge de la candidose orale. L’importance croissante du Candida est en partie liée à l’émergence de l’infection par le VIH et à l’utilisation plus répandue de la chimiothérapie immunosuppressive. Avec le Candida albicans, il y a eu une plus grande reconnaissance de l’importance de l’espèce non albicans Candida dans la candidose orale. L’identification des souches infectantes de Candida est importante car les isolats des espèces de Candida diffèrent considérablement, tant par leur capacité à provoquer une infection que par leur sensibilité aux agents antifongiques. Ainsi, cette revue donne un aperçu des méthodes fiables d’isolement candidal et d’identification des isolats de la cavité buccale.

1. Introduction

Le terme Candida provient du mot latin candide, qui signifie blanc. Les spores de Candida sont une forme commensale et inoffensive d’un champignon dimorphique qui devient un pseudohyphes invasif et pathogène lorsqu’il y a une perturbation de l’équilibre de la flore ou de l’affaiblissement de l’hôte.

La traduction de ce commensal endogène en parasite pathogène peut être associée à d’autres facteurs que les attributs pathogènes de l’organisme lui-même, ce qui est assez unique par rapport à la plupart des autres maladies infectieuses, où la virulence des organismes considérés comme étant le facteur clé de la pathogenèse. Par conséquent, les espèces de Candida sont strictement opportunistes. On pourrait affirmer que ni les formes superficielles ni les formes systémiques des infections à Candida ne pouvaient être initiées en l’absence de pathologie sous-jacente.

Il existe de nombreuses espèces de Candida (tableau 1), mais la plus répandue qui est récupérée de la cavité buccale, à l’état commensal et en cas de candidose buccale, est C. albicans. On estime que cette espèce représente plus de 80 % de tous les isolats de levure orale.

Ces dernières années, il y a eu un intérêt accru pour les infections causées par l’agent pathogène opportuniste Candida. L’importance croissante du Candida est en partie liée à l’émergence de l’infection par le VIH et à l’utilisation plus répandue de la chimiothérapie immunosuppressive. L’identification des souches infectantes de Candida est importante car les isolats des espèces de Candida diffèrent considérablement, tant par leur capacité à provoquer une infection que par leur sensibilité aux agents antifongiques.

Avec le C. albicans, il y a eu une plus grande reconnaissance de l’importance de l’espèce Candida non albicans dans la maladie humaine. C. glabrata et C. les krusei sont des espèces qui ont attiré l’attention en raison de leur résistance accrue à certains agents antifongiques. C. dubliniensis est une espèce pathogène récemment identifiée, décrite pour la première fois en 1995 lorsqu’elle a été coisolée avec C. albicans à partir de cas de candidose orale chez des individus infectés par le VIH.

Cette revue donne un aperçu des méthodes fiables d’isolement candidal et d’identification des isolats de la cavité buccale.

2. Attributs pathogènes du Candida

La transition du Candida d’un organisme commensal inoffensif à un organisme pathogène est complexe et est liée à des changements environnementaux subtils qui conduisent à l’expression d’une gamme de facteurs de virulence (tableau 2). C’est l’effet combiné des facteurs hôtes et candidaux qui contribuent finalement au développement de la candidose orale.

Quel que soit le type de candidose, la capacité des espèces de Candida à persister sur les surfaces muqueuses d’individus sains est un facteur important contribuant à sa virulence. Ceci est particulièrement important dans la cavité buccale, où l’organisme doit résister à l’action de lavage mécanique d’un flux relativement constant de salive vers l’œsophage.

Aucun facteur de virulence prédominant pour le Candida n’est reconnu, bien qu’un certain nombre de facteurs aient été impliqués dans la promotion du processus d’infection. Ceux-ci comprennent les attributs impliqués dans l’adhésion du Candida aux surfaces buccales (par exemple, l’hydrophobicité relative de la surface cellulaire et la présence de molécules d’adhésine spécifiques), la capacité de résister aux mécanismes de défense immunitaire de l’hôte (par exemple, commutation phénotypique à haute fréquence et transition morphologique) et la libération d’enzymes hydrolytiques (par exemple., aspartyl protéinases et phospholipases sécrétées) qui peuvent induire des dommages aux cellules hôtes.

3. Candidose buccale

Samaranayake a proposé une classification où les lésions de candidose buccale étaient subdivisées en deux groupes principaux: le Groupe I, ou candidoses buccales primaires confinées à des lésions localisées dans la cavité buccale sans atteinte de la peau ou d’autres muqueuses; Le Groupe II ou candidoses buccales secondaires, où les lésions sont présentes dans les sites buccaux ainsi qu’extra-oraux tels que la peau (Tableau 3). Les lésions du groupe I sont constituées de la triade classique — variantes pseudomembraneuses, érythémateuses et hyperplasiques — et certaines ont suggéré une subdivision supplémentaire de ces dernières en types ressemblant à une plaque et nodulaire.

4. Diagnostic de candidose buccale

Le diagnostic de candidose buccale peut souvent être posé sur la nature des caractéristiques cliniques de présentation, bien que des échantillons microbiologiques doivent être prélevés si possible afin d’identifier et de quantifier tout Candida pouvant être présent et de fournir des isolats pour les tests de sensibilité antifongique.

5. Méthodes d’isolement

Les techniques disponibles pour l’isolement du Candida dans la cavité buccale comprennent l’utilisation d’un frottis, d’un écouvillon ordinaire, d’une culture d’empreinte, d’une collecte de salive entière, d’un rinçage buccal concentré et d’une biopsie de la muqueuse. Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients particuliers et le choix de la technique de prélèvement est principalement régi par la nature de la lésion à étudier (tableau 4). Lorsqu’une lésion accessible et définie est évidente, une approche d’échantillonnage directe telle que l’utilisation d’un écouvillon ou d’une empreinte est souvent préférée car cela fournira des informations sur les organismes présents au niveau de la lésion elle-même. Dans les cas où il n’y a pas de lésions évidentes ou dans les cas où la lésion est difficile d’accès, un échantillon indirect basé sur des échantillons de salive en culture ou un rinçage buccal est plus acceptable.

L’estimation quantitative de la charge fongique peut être effectuée en utilisant des empreintes, un rinçage buccal concentré et une culture de rinçage buccal, comme moyen de différencier le transport commensal et l’existence pathogène de Candida oral, avec des charges plus élevées considérées comme probables dans ce dernier cas.

6. Microscopie directe

Les caractéristiques morphologiques des espèces de Candida (Tableau 5) doivent être examinées pour l’identification. Un frottis est utile pour différencier les formes de levure et d’hyphes, mais il est moins sensible que les méthodes culturales. La préparation d’hydroxyde de potassium (KOH) de l’échantillon révèle des hyphes septés non pigmentés avec une ramification dichotomique caractéristique (à un angle d’environ 45 °). Dans la méthode de coloration fluorescente du KOH-Calcofluor, les caractéristiques fongiques telles que les hyphes, les cellules de levure et d’autres éléments fongiques vont fluorescer.

Un frottis prélevé sur le site lésionnel est fixé sur des lames de microscope puis coloré soit par la coloration de gram, soit par la technique périodique de Schiff acide (PAS). En utilisant ces méthodes, les hyphes candidaux et les levures apparaissent soit en bleu foncé (coloration de Gram), soit en rouge / violet (PAS).

En cas de candidose hyperplasique chronique, une biopsie de la lésion est nécessaire pour la détection ultérieure du Candida envahissant par coloration histologique à l’aide de taches de méthénamine argentée PAS ou Gomori. La démonstration des éléments fongiques dans les tissus se fait car ils sont teints en profondeur par ces taches. La présence de blastospores et d’hyphes ou de pseudohyphes peut permettre à l’histopathologiste d’identifier le champignon comme une espèce de Candida et, compte tenu de la présence d’autres caractéristiques histopathologiques, de poser un diagnostic de candidose hyperplasique chronique.

7. Culture en laboratoire

7.1. Écouvillon

Un écouvillon d’un site lésionnel est une méthode relativement simple de détection de la croissance et une estimation semi-quantitative du Candida peut être obtenue. L’approche d’échantillonnage consiste à frotter doucement un coton-tige stérile sur le tissu lésionnel, puis à inoculer un milieu d’isolement primaire tel que la gélose dextrose de Sabouraud (SDA).

7.2. Rinçage buccal concentré

La technique de rinçage buccal consiste à maintenir 10 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (0,01 M, pH 7,2) dans la bouche pendant 1 minute. La solution est ensuite concentrée (10 fois) par centrifugation et un volume connu, généralement 50 µL, inoculé sur milieu gélosé à l’aide d’un système de placage en spirale. Après 24 à 48 heures d’incubation à 37 °C, la croissance est évaluée par dénombrement des colonies et exprimée en unités formant colonie candidale par mL (cfu mL−1) de rinçage.

7.3. Culture d’impression

La méthode d’impression utilise un tampon de mousse stérile de taille connue (typiquement 2,5 cm2), préalablement trempé dans un milieu liquide approprié, tel que le bouillon de Sabouraud, immédiatement avant utilisation. Le tampon est ensuite placé sur le site cible (muqueuse ou prothèse intra-orale) pendant 30 secondes, puis transféré sur une gélose pour culture.

8. Milieu de culture

Le milieu d’isolement primaire le plus fréquemment utilisé pour le Candida est le SDA qui, bien que permettant la croissance du Candida, supprime la croissance de nombreuses espèces de bactéries buccales en raison de son faible pH. L’incorporation d’antibiotiques dans le SDA augmentera encore sa sélectivité. Typiquement, le SDA est incubé en aérobic à 37 ° C pendant 24 à 48 heures. Le candida se développe sous forme de colonies convexes crème, lisses et pâteuses sur le SDA et la différenciation entre les espèces est rarement possible. On estime que plus d’une espèce de Candida est présente dans environ 10% des échantillons oraux et ces dernières années, la capacité de détecter les espèces non albicanes est devenue de plus en plus importante.

Au cours des dernières années, d’autres milieux différentiels ont été développés qui permettent l’identification de certaines espèces de Candida en fonction de l’apparence et de la couleur des colonies après la culture primaire. L’avantage de tels milieux est que la présence de plusieurs espèces de Candida dans une seule infection peut être déterminée, ce qui peut être important dans le choix des options de traitement ultérieures. On peut citer à titre d’exemple la gélose Pagano-Levin ou les géloses chromogènes disponibles dans le commerce, à savoir CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate ou Candichrom albicans.

La gélose de Pagano-Levin distingue les espèces de Candida en fonction de la réduction du chlorure de triphényltétrazolium. Le milieu produit des colonies de C. albicans de couleur pâle, tandis que les colonies d’autres espèces de Candida présentent divers degrés de coloration rose. La gélose de Pagano-Levin a une sensibilité similaire à la SDA mais est supérieure pour la détection de plus d’une espèce dans l’échantillon, CHROMagar Candida identifie C. albicans, C. tropicalis et C. krusei se sont basés sur la couleur et l’apparence des colonies, tandis que Albicans ID et Fluroplate se sont avérés bénéfiques pour l’identification présumée de C. albicans. La spécificité de l’identification est rapportée à 95 % pour CHROMagar Candida et à 98,6 % pour les géloses Albicans ID et Fluroplate. L’utilisation de CHROMagar Candida comme gélose d’isolement primaire a été citée comme une approche permettant de discriminer le C. dubliniensis nouvellement décrit de C. albicans. Sur CHROMagar Candida, C. dubliniensis se développerait en colonies d’un vert plus foncé que celles de C. albicans. Cependant, la discrimination entre ces deux espèces à l’aide de CHROMagar semble diminuer lors de la sous-culture et du stockage des isolats. L’échec de la croissance de C. dubliniensis sur un milieu gélosé à une température d’incubation élevée de 45 °C a récemment été suggéré comme test alternatif pour discriminer ces deux espèces.

9. Identification des espèces de Candida

L’identification des levures sur la base de milieux de culture primaires peut être confirmée par une variété de tests supplémentaires traditionnellement basés sur les caractéristiques morphologiques (tableau 5) et physiologiques des isolats.

9.1. Critères morphologiques

Le test sur tube germinal est la méthode de laboratoire standard pour identifier C. albicans. Le test implique l’induction d’excroissances d’hyphes (tubes germinaux) lorsqu’elles sont repiquées dans du sérum de cheval à 37 ° C pendant 2 à 4 heures. Environ 95% des isolats de C. albicans produisent des tubes germinaux, propriété également partagée par C. stellatoidea et C. dubliniensis.

C. albicans et C. dubliniensis peuvent également être identifiés parmi d’autres espèces en fonction de leur capacité à produire des caractéristiques morphologiques connues sous le nom de chlamydospores. Les chlamydospores sont des structures sphériques réfractiles générées aux extrémités des hyphes après la culture d’isolats sur un milieu nutritionnellement pauvre tel que la gélose à la semoule de maïs. Les isolats sont inoculés en hachures croisées sur la gélose et recouverts d’une lamelle stérile. Les géloses sont incubées pendant 24 à 48 heures à 37 °C, puis examinées au microscope pour détecter la présence de chlamydospores.

9.2. Critères physiologiques / Identification biochimique

L’identification biochimique des espèces de Candida repose en grande partie sur l’utilisation des glucides. Les tests traditionnels auraient impliqué la culture d’isolats d’essai sur une gélose basale dépourvue de source de carbone. Les solutions de glucides seraient ensuite placées dans des puits de la gélose ensemencée ou sur des disques de papier filtre situés à la surface de la gélose. La croissance au voisinage de la source de carbone indiquerait une utilisation. Les systèmes commerciaux sont basés sur le même principe, mais les glucides de test sont logés dans des puits en plastique situés sur une bandelette réactive. La croissance dans chaque puits est lue par des changements de turbidité ou des changements de couleur dans certains systèmes de kit. Les codes numériques obtenus à partir des résultats des tests sont utilisés pour identifier l’organisme testé sur la base de la comparaison de la base de données.

9.3. Sérologie

Des tests sérologiques sont fréquemment utilisés pour déterminer la signification clinique des isolats d’espèces de Candida. L’augmentation des titres d’anticorps lgG contre C. albicans peut refléter une candidose invasive chez des individus immunocompétents. La détection des anticorps IgA et IgM est importante pour identifier une infection aiguë. Les personnes immunodéprimées présentent souvent une variabilité dans la production d’anticorps et, dans un tel cas, l’utilisation d’un test de détection d’antigène est recommandée. Des tests tels que le test immuno-enzymatique (ELISA) et le test radio-immuno (RIA) pour la détection de l’antigène candidial, du mannane à paroi cellulaire ou des constituants cytoplasmiques sont maintenant disponibles dans les pays développés.

Le diagnostic sérologique est souvent retardé et les tests manquent encore de sensibilité et de spécificité. De plus, la production d’anticorps chez les patients immunodéprimés est variable, ce qui complique le diagnostic. Cela est dû au fait que les antigènes fongiques et les métabolites sont souvent éliminés rapidement de la circulation et que la présence d’anticorps n’implique pas toujours une infection à Candida, en particulier chez les patients atteints d’une maladie sous-jacente grave ou qui prennent des médicaments immunosuppresseurs.

Les tests sérologiques ne sont normalement pas un outil de diagnostic de la candidose buccale. Cependant, de tels tests peuvent être un instrument pronostique chez les patients présentant une candidose buccale sévère qui répondent mal au traitement antimycotique.

9.4. Méthodes d’identification à base moléculaire

L’identification par analyse de la variabilité génétique est une approche plus stable que l’utilisation de méthodes basées sur des critères phénotypiques. Pour l’identification de Candida basée sur la variation génétique, on analyse les différences de caryotype électrophorétiques et les polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) en utilisant l’électrophorèse sur gel ou l’hybridation ADN-ADN.

Des approches PCR spécifiques aux espèces ont également été utilisées pour l’identification des espèces de Candida. Plusieurs gènes cibles ont été rapportés pour la discrimination des espèces de Candida, bien que ceux qui sont le plus fréquemment amplifiés soient les séquences de l’opéron de l’ARN ribosomique. L’identification peut être obtenue sur la base des tailles de produit de PCR obtenues après une résolution par électrophorèse sur gel, ou de la variation de séquence de produit de PCR déterminée soit par séquençage direct, soit par l’utilisation d’une analyse de fragments de restriction après la coupe de séquences de PCR avec des endonucléases de restriction.

L’hybridation in situ par fluorescence avec la méthode de l’acide nucléique peptidique (PNA Fish) est une nouvelle technique de détection qui cible des séquences spécifiques d’espèces hautement conservées dans l’ARNr abondant de C. albicans vivant. Les cellules individuelles peuvent être détectées directement sans avoir besoin d’amplification. Cette technique permet d’atteindre une sensibilité de 98,7 à 100%, avec une spécificité de 100%, permettant la discrimination de C. albicans à partir du C. dubliniensis phénotypiquement similaire.

La technologie moléculaire peut également être utilisée pour identifier des souches d’espèces de Candida, bien que l’utilisation de techniques telles que l’Électrophorèse sur gel en champ Pulsé (PFGE), l’analyse d’ADN polymorphe amplifié au hasard (RAPD) et la PCR par amplification de séquences répétées (REP) soient largement réservées aux enquêtes épidémiologiques dans la recherche sur la candidose buccale.

10. Conclusion

Au cours des dernières années, une plus grande importance a été accordée à l’identification fiable des espèces de Candida à partir d’échantillons cliniques humains. Une représentation schématique de l’isolement et de l’identification candidaux est présentée à la figure 1. Étant donné que le candida est la microflore résidente, des méthodes d’isolement appropriées sont nécessaires pour déterminer la présence dans la bouche ainsi que leur nombre. Il est également important d’identifier les souches infectantes de Candida car les isolats des espèces de Candida diffèrent considérablement, à la fois par leur capacité à provoquer une infection et par leur sensibilité aux agents antifongiques. Diverses techniques phénotypiques sont disponibles pour identifier les Candida isolés, notamment en utilisant des tests de culture morphologique, des milieux gélosés différentiels et des tests d’assimilation biochimique. Ces méthodes sont complétées par des techniques moléculaires récentes largement réservées aux investigations épidémiologiques.

Figure 1

Représentation schématique de l’isolement et de l’identification des espèces de Candida de la cavité buccale.