Résultats

Expression d’ALDH1 dans le pancréas embryonnaire et adulte.

Sur la base d’études antérieures documentant des niveaux élevés d’activité enzymatique d’ALDH1 dans les progéniteurs épithéliaux neuraux, hématopoïétiques et mammaires (17-19), nous avons caractérisé les modèles temporels et spatiaux de l’expression de la protéine ALDH1 dans le pancréas de souris embryonnaire et adulte (Fig. 1). En utilisant l’E-cadhérine comme marqueur des cellules épithéliales pancréatiques, nous avons constaté que la protéine ALDH1 est d’abord détectable dans l’épithélium pancréatique en développement sur E12.5 (Fig. 1 BIS). À ce stade, l’expression est limitée aux extrémités des tubules ramifiés, récemment proposés pour représenter un domaine progéniteur multipotentiel (20). Un modèle d’expression similaire a déjà été rapporté pour les transcriptions Aldh1a1 (21). L’expression dans les extrémités tubulaires (et non dans les troncs centraux) persiste jusqu’à E14.5 (Fig. 1 B et B’), et est par la suite régulée à la baisse dans la différenciation des cellules acinaires. Dans le pancréas adulte, l’expression épithéliale d’ALDH1 est le plus fréquemment observée dans les cellules épithéliales canalaires centroacinaires et terminales (Fig. 1 Ce). Des cellules mésenchymateuses (E-cadhérine négative) exprimant l’ALDH1 ont également été détectées autour des îlots endocriniens et des acini exocrines (Fig. S1).

Pour caractériser davantage l’expression d’ALDH1 et l’activité enzymatique d’ALDH1 dans les cellules adultes des canaux terminaux/centroacinaires, nous avons utilisé des préparations d’unités canalaires acinaires périphériques fraîchement isolées du pancréas exocrinien de souris digéré par la collagénase (22). Il est important de noter que ces unités périphériques acineuses-canalaires isolées sont nettement appauvries en grands canaux et en éléments endocriniens. Par rapport au pancréas total, les unités canalaires acineuses périphériques présentaient une déplétion > de 400 fois dans les transcrits d’insuline, telle qu’évaluée par RT-PCR (Fig. S2A). Lorsque l’analyse FACS a été réalisée sur des unités canalaires acinaires périphériques récoltées à partir de souris transgéniques Ins1:DsRed exprimant une protéine fluorescente rouge dans des cellules β, seules 3 des 10 000 cellules (0,03%) de cette préparation étaient positives pour DsRed.

Une caractérisation tridimensionnelle supplémentaire de l’expression de la protéine ALDH1 a été réalisée à l’aide d’un marquage fluorescent en monture entière d’unités périphériques acinaires-canalaires isolées. La protéine ALDH1 a été localisée en combinaison avec l’E-cadhérine comme marqueur des cellules épithéliales et avec l’agglutinine conjuguée de Dolichos biflorus (DBA) conjuguée de FITC ou l’agglutinine d’arachide conjuguée de FITC (PNA), marqueurs des cellules canalaires et acineuses, respectivement. L’imagerie multicanale a confirmé une localisation canalaire principalement centroacinaire/terminale des cellules épithéliales exprimant l’ALDH1 dans le pancréas adulte (Fig. S3). Les cellules exprimant l’ALDH1 étaient le plus souvent interposées entre l’épithélium canalaire terminal et les cellules acineuses plus périphériques. De plus, des cellules épithéliales uniques exprimant l’ALDH1 ont également été observées immédiatement adjacentes à l’épithélium canalaire terminal (Fig. S3 A et B). Les cellules ALDH1-positives DBA-positives et DBA-négatives ont été identifiées, alors que les cellules PNA-positives ALDH1-positives n’ont été que rarement identifiées.

Isolement des Cellules Canalaires Centroacinaires et Terminales exprimant l’ALDH1.

Dans l’espoir d’isoler les cellules exprimant l’ALDH1 du pancréas de souris adulte, nous avons profité d’un substrat fluorogène appelé « Aldefluor » (StemCell Technologies), qui a déjà été utilisé dans l’isolement basé sur FACS des cellules souches épithéliales hématopoïétiques, neurales et mammaires (17-19). Avant d’essayer l’isolement basé sur FACS des cellules épithéliales pancréatiques exprimant l’ALDH1, nous avons d’abord appliqué ce réactif pour visualiser des cellules vivantes exprimant l’ALDH1 dans des unités acineuses-canalaires périphériques (Fig. 2). Comme le montre la Fig. 2 E et F, ces études ont confirmé la localisation canalaire centroacinaire/terminale de cellules aldéfluorées à faible abondance dans le pancréas de souris adulte. Les cellules canalaires centroacineuses/terminales aldéfluorées positives se distinguent facilement des cellules acineuses adjacentes en raison de leur petite taille et de l’absence de granules de zymogène. Des exemples supplémentaires d’imagerie de cellules vivantes utilisant le réactif aldéfluoré sont fournis à la Fig. S4. Ces résultats impliquaient que l’immunofluorescence anti-ALDH1 et la cytofluorescence à base d’aldéfluorescence marquaient une population canalaire centroacinaire / terminale similaire, et suggéraient en outre que ces cellules pourraient être isolées avec succès par FACS.

Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation et le tri basés sur FACS de cellules uniques dissociées des unités acinoducales périphériques. Comme moyen initial d’établir un déclenchement spécifique des cellules exprimant l’ALDH1, nous avons utilisé un inhibiteur pharmacologique de l’activité enzymatique de l’ALDH1 (DEAB). Comme représenté à la Fig. 2 A-D, cette stratégie a permis l’isolement d’une population cellulaire à faible abondance caractérisée par des niveaux élevés d’activité enzymatique ALDH1 sensible au DEAB, comprenant 0,9% ± 0.2% de toutes les cellules triées dans le pancréas de souris adulte. En utilisant un anticorps anti-cadhérine pour identifier simultanément les cellules épithéliales, les cellules d’Aldéfluor(+) E-cadhérine (+) représentaient 0,5 % ± 0,13 % de toutes les cellules triées dans le pancréas de souris adulte (Fig. 2D).

En utilisant la RT-PCR quantitative pour comparer les populations d’Aldéfluor positif, d’E-cadhérine positive (A+E+), d’Aldéfluor négatif, d’E-cadhérine positive (A-E+), d’Aldéfluor positif, d’E-cadhérine négative (A+E-) et d’Aldéfluor négatif, d’E-cadhérine négative (A−E-) isolées du pancréas de souris adulte, nous avons constaté que la population A+E+ était considérablement enrichie pour le codage des transcriptions Aldh1a1 et Aldh1a7, et appauvri en transcriptions pour deux autres isoformes ALDH1, Aldh1a2 et Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 n’a été détecté dans aucun des échantillons. Par rapport à la population A−E+, les cellules A+E+ ont été légèrement appauvries en transcriptions de Pdx1 (P< 0,09), d’Amylase (P < 0,001) et de cytokératine-19 (P < 0,01 ) (marqueurs exprimés dans les cellules β différenciées, les cellules acineuses et les cellules canales, respectivement). En revanche, les cellules A+ E+ ont été caractérisées par une expression à haut niveau de Ptf1a, bien qu’elles aient été appauvries à la fois des transcrits amylases et de la protéine amylase (Fig. 3G et Fig. S5). De plus, ces cellules ont été enrichies pour des transcrits codant pour Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 et Hey2, marqueurs précédemment associés à des populations progénitrices dans le pancréas et d’autres tissus. En utilisant un marquage immunofluorescent sur des préparations de cytospines de cellules triées par FACS, nous avons confirmé un enrichissement marqué pour la protéine ALDH1 et Sox9 et une déplétion de l’amylase dans les cellules A + E + (Fig. S5). De plus, nous avons également effectué une analyse FACS pour déterminer la fréquence à laquelle les cellules aldéfluorées (+) étaient également positives pour les marqueurs de cellules souches tels que CD133 et la protéine Sca-1, et nous avons observé que plus de 90% des cellules aldéfluorées (+) coexprimaient en outre ces deux marqueurs de cellules souches. En revanche, seulement 0,11% des cellules aldéfluorées (+) étaient également positives pour le marqueur endothélial vasculaire PECAM, alors que 0,08% étaient positives pour le marqueur hématopoïétique CD45. Lorsque l’analyse FACS a été réalisée sur des unités canalaires acinaires périphériques récoltées sur des souris transgéniques Ins1-DsRed exprimant une protéine fluorescente rouge dans des cellules β, toutes les cellules aldéfluorées (+) se sont révélées négatives pour dsRed.

Dosage de la pancréatosphère de la Fonction endocrine et Exocrine des progéniteurs.

En tant que dépistage initial de l’activité de type progéniteur, nous avons dosé les cellules aldéfluor(+) et Aldéfluor(-) pour déterminer la capacité de former des pancréatosphères (Fig. 3), similaire au test de neurosphère couramment utilisé pour identifier les progéniteurs neuronaux (23). Dans ces essais, les cellules canalaires A+E+ centroacinaires/terminales ont été capables de former des sphères en culture en suspension. Les cellules A+E+ affichaient une efficacité de formation de sphères > 100 fois supérieure à celle de leurs homologues A-E+ (Fig. 3 A et B et tableau S1). Avec des rendements plus faibles, des cellules simples A+E+ ont même pu former des sphères lorsqu’elles étaient plaquées à densité clonale (une cellule par puits) dans des plaques à 96 puits (tableau S1). Aucune des populations d’E-cadhérine négative n’a montré de capacité significative de formation de sphères. En culture sur une période de 5 à 7 jours, les pancréatosphères dérivées de cellules A+E+ présentaient une forte expression de l’E-cadhérine (Fig. 3C), confirmant leur identité épithéliale, et les cellules individuelles dans les sphères ont commencé à accumuler des quantités considérables d’amylase ou d’insuline et d’insuline C-peptide (Fig. 3 D et E). À 5 jours, ≈50% des pancréatosphères présentent une expression de l’amylase, alors que quelque 30% présentent une immunoréactivité à l’insuline C-peptide. Les sphères individuelles étaient généralement positives pour l’insuline ou l’amylase, mais pas les deux. De petits sous-ensembles de cellules dans les sphères ont maintenu l’expression d’ALDH1 pendant la période de culture, et ont également démontré l’expression nucléaire de la protéine Sox9 (Fig. 3 F et G), suggérant le maintien possible d’un pool de progéniteurs auto-renouvelés. Cette capacité apparente d’auto-renouvellement était en outre étayée par le fait que les pancréatosphères générées par les cellules canalaires centroacinaires/terminales aldéfluorées (+) pouvaient être soumises à une dissociation enzymatique en série, maintenant leur capacité de formation de sphères sur un minimum de trois passages séquentiels à des intervalles de 7 jours. De plus, les cellules dans les sphères étaient très prolifératives, comme l’a évalué l’incorporation nocturne d’EdU ajoutée au début ou à la fin de la période de culture (Fig. 3H).

Sur la base des capacités distinctes des progéniteurs affichées par les cellules A+E+, nous avons examiné plus en détail les populations cellulaires triées pour l’expression de Ngn3, un marqueur des cellules progénitrices endocriniennes (Fig. S2B). Conformément aux études précédentes (7), nous n’avons pas pu détecter une expression significative de Ngn3 dans le pancréas adulte total ou dans l’une des populations cellulaires fraîchement triées. Cependant, une fois que les cellules A+ E+ ont été mises en culture, elles ont commencé à générer une expression détectable de Ngn3 immédiatement avant le début de l’expression de l’insuline, confirmant davantage la capacité de progéniteur endocrinien des cellules épithéliales centroacineuses et canalaires terminales exprimant l’ALDH1.

Les Pancréatosphères Dérivées de Cellules Canalaires/ Centroacinaires Terminales Aldéfluorées (+) Présentent Une Sécrétion d’Insuline Sensible au Glucose.

La détection de cellules exprimant l’insuline et le peptide C de l’insuline dans les pancréatosphères cultivées a permis d’évaluer si ces cellules étaient capables de sécréter de l’insuline sensible au glucose, une caractéristique des cellules β fonctionnelles. Comme témoin positif, nous avons utilisé des cellules Ins-1 (clone 832/13) une lignée de cellules β immortalisée couramment utilisée pour des études de sécrétion d’insuline en réponse à des concentrations physiologiques de glucose. Après une incubation d’une nuit de pancréatosphères ou de cellules Ins-1 dans du glucose de 0, 5 et 11 mM, les surnageants des milieux de culture et les lysats cellulaires ont été récoltés et analysés pour détecter l’insuline C-peptide sécrétée et cellulaire à l’aide d’un dosage à base d’ELISA. Les pancréatosphères dérivées de cellules canalaires centroacinaires / terminales aldéfluorées (+) sécrètent le peptide C de manière dépendante du glucose, avec une sensibilité au glucose similaire à celle affichée par les cellules Ins-1 (Fig. 3I).

Les Cellules Canalaires/Centroacinaires Terminales Adultes Aldefluor(+) Peuvent Contribuer aux Lignées Endocrines et Exocrines Embryonnaires.

En tant que test encore plus rigoureux de l’activité des progéniteurs pancréatiques, nous avons microinjecté des cellules aldéfluor (+) et Aldéfluor (–) isolées dans des bourgeons pancréatiques dorsaux microdissectés isolés d’embryons de souris E12.5, et nous avons évalué leur capacité à contribuer de manière productive au développement des lignées endocrines et exocrines (Fig. 4). Cette approche a récemment été utilisée pour documenter l’activité progénitrice des cellules exprimant le Ngn3 survenant après la ligature du canal pancréatique (7). Pour retracer la lignée des cellules donneuses d’origine adulte et les distinguer de leurs homologues d’origine embryonnaire, nous avons isolé des cellules aldéfluor (+) et Aldéfluor (–) du pancréas de souris porteuses d’un pCAG exprimé de manière ubiquitaire: le transgène de mCherry, comme représenté schématiquement à la Fig. 4A (pCAG: Les souris mCherry ont été gentiment fournies par Michael Wolfgang, Université Johns Hopkins). Par rapport aux cellules aldéfluorées (–), les cellules aldéfluorées (+) ont un potentiel considérablement accru de contribuer aux lignées endocrines émergentes au sein des bourgeons dorsaux en maturation, comme le démontre la coexpression de mCherry avec l’un ou l’autre des peptides C (Fig. 4 B-E) ou du glucagon (Fig. 4 F-I). En utilisant un marquage E-cadhérine superposé pour permettre le comptage de cellules individuelles positives à mCherry, nous avons évalué quantitativement la capacité des cellules aldéfluor (+) et Aldéfluor (−) adultes à entrer dans des lignées embryonnaires. Sept jours après la microinjection de cellules aldéfluorées (+) dans E12.5 bourgeons dorsaux, l’expression du glucagon a été observée dans 11,7 % des cellules mCherry positives résiduelles, l’expression du peptide C de l’insuline étant observée dans 11,6 % supplémentaires (Fig. 5N). En revanche, 2,4% des cellules aldéfluor (-) résiduelles mCherry-positives ont exprimé du glucagon et seulement 0,2% ont exprimé l’insuline C-peptide. Fait intéressant, les populations d’Aldéfluor (+) et d’Aldéfluor (–) ont montré des capacités équivalentes à entrer dans des lignées épithéliales non endocrines, ce qui reflète peut–être le fait que la majeure partie de la population d’Aldéfluor (-) était composée de cellules acineuses déjà différenciées. Des fréquences similaires de positivité de l’E-cadhérine, de l’amylase et du PNA ont été observées dans des cellules mCherry-positives résiduelles dérivées des populations d’Aldéfluor (+) ou d’Aldéfluor (–) (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

Pour évaluer le comportement in vivo des cellules du canal centroacinaire et terminal exprimant l’ALDH1, nous avons évalué les schémas d’expression de l’ALDH1 dans le cadre d’une inflammation chronique et d’une métaplasie régénératrice induites par l’administration séquentielle de caéruléine à faible dose. Comme indiqué précédemment (15), le traitement de souris adultes par trois injections de caéruléine (50 µg / kg) par semaine pendant 3 semaines consécutives a induit un état de pancréatite chronique suivi d’une régénération et d’une réparation quasi complètes. Ce processus est caractérisé par des infiltrats inflammatoires, une expansion stromale et la formation de complexes tubulaires métaplasiques régénérateurs, qui comprennent des complexes tubulaires de type 1 précédemment montrés dérivés de cellules acineuses, et des complexes tubulaires de type 2 (TC2), précédemment montrés dérivés de cellules non acineuses et provenant vraisemblablement de cellules de conduits terminaux proliférantes (15). Contrairement à l’abondance relativement faible du canal terminal exprimant l’ALDH1 et des cellules centroacinaires observées dans le pancréas adulte normal (Fig. 5a et B), conduit terminal exprimant l’ALDH1 (Fig. 5 C et D) et centroacinaire (Fig. Les cellules 5 E et F) ont été considérablement élargies dans le cadre d’une pancréatite chronique induite par la caéruléine. Il est à noter que les complexes tubulaires de type 2 étaient composés principalement de cellules exprimant l’ALDH1 (Fig. 5H), alors que les complexes tubulaires de type 1 n’ont montré aucune preuve d’expression d’ALDH1 (Fig. 5G).