Cellules circulantesedit
Les techniques requises pour obtenir des cellules isolées varient selon le type de cellule requis. Les cellules circulantes telles que les cellules sanguines ou certaines cellules tumorales peuvent être isolées en prélevant un échantillon de sang. Comme les échantillons de sang contiennent un mélange de nombreux types de cellules différents, une méthode de séparation des cellules en différents types doit être utilisée. La méthode la plus couramment utilisée pour cela est la cytométrie en flux, au cours de laquelle un analyseur automatisé inspecte un flux étroit de cellules. Dans une version de cette technique, une lumière est diffusée sur le flux de cellules, et l’analyseur détecte la lumière réfléchie ou la fluorescence avant d’utiliser cette information pour manœuvrer rapidement les cellules d’intérêt dans une chambre de collecte.
Tissus solidesmodifier
Lorsqu’il s’agit de tissus solides, l’obtention de tissus pour l’isolement cellulaire peut être plus difficile. Des tissus humains excédentaires peuvent parfois être obtenus au moment de la chirurgie planifiée, par exemple des échantillons d’appendice auriculaire droit sont souvent excisés et jetés lors d’une chirurgie à cœur ouvert telle qu’un pontage aorto-coronarien. D’autres tissus tels que des échantillons de pancréas ou de vessie peuvent être prélevés sous forme de biopsie. Alternativement, les tissus d’animaux sont fréquemment obtenus en sacrifiant l’animal.
Après l’obtention d’un échantillon de tissu, il doit être entouré ou perfusé par une solution à une température appropriée contenant les sels et les nutriments nécessaires au maintien en vie des cellules. Cela peut être réalisé en immergeant simplement le tissu dans la solution, ou peut impliquer des arrangements plus complexes tels que la perfusion de Langendorff. Les solutions couramment utilisées comprenaient des modifications de la solution de Tyrode ou de la solution de Krebs et de Henseleit Ces solutions contiennent des concentrations précises d’électrolytes, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphate, du chlorure et du glucose. Les concentrations de ces électrolytes doivent être soigneusement équilibrées, en faisant attention à la pression osmotique. L’acidité de la solution doit être régulée, souvent à l’aide d’un tampon de pH tel que HEPES. L’isolement des cellules de certains tissus peut être amélioré en oxygénant la solution. Dans les premiers stades, perfuser le tissu avec une solution ne contenant pas de calcium est utile en particulier lors de l’isolement des myocytes cardiaques, car l’absence de calcium provoque la séparation des disques intercalés.
Des enzymes protéolytiques peuvent ensuite être ajoutées à la solution. Les enzymes qui digèrent le collagène (collagénases) sont souvent utilisées pour isoler les cellules du cœur ou de la vessie. Des enzymes à usage général qui digèrent de nombreuses sortes de protéines (protéases) peuvent également être utilisées. Lors de l’isolement des cellules du tissu cérébral, d’autres enzymes qui décomposent l’ADN (DNAases) peuvent être nécessaires.
Ces enzymes, en plus de digérer la matrice extracellulaire, peuvent également digérer d’autres protéines importantes essentielles au fonctionnement des cellules d’intérêt. Si les cellules sont exposées à ces enzymes pendant trop longtemps, il en résulte une mort cellulaire, mais si elles ne sont pas exposées aux enzymes pendant assez longtemps, la digestion de la matrice extracellulaire ne sera pas complète. Après que les enzymes ont été retirées du tissu en le perfusant avec une deuxième solution qui ne contient pas d’enzymes, les cellules peuvent être séparées ou dissociées mécaniquement. Une technique simple de dissociation des cellules consiste à couper le tissu en petits morceaux avant d’agiter les morceaux dans une solution à l’aide d’une pipette.
