Résumé

Une méthode d’analyse immuno-enzymatique chimiluminescente directe et hautement spécifique (CL-ELISA) pour la surveillance du chloramphénicol (CAP) dans les cosmétiques a été développée. L’anticorps anti-chloramphénicol (mAb) adopté dans ce travail pour le dosage immunologique direct pourrait se lier spécifiquement au CAP, avec une réactivité croisée négligeable (moins de 0,01%) avec la plupart des analogues du CAP, y compris le thiamphénicol (TAP) et le florfénicol (FF). La limite de détection (LOD), mesurée par IC10, était de 0,0021 ng mL-1. La plage de détection (IC20-IC80) était comprise entre 0,00979 et 0,12026 ng mL−1. Dans les échantillons de cosmétiques à pointes, les récupérations moyennes variaient de 82,7 % à 99,6 %, avec une variation intrajournalière et interjournalière inférieure à 9,8 et 8,2 %, respectivement. De plus, à l’aide d’un mAb anti-CAP marqué HRP, le procédé pourrait être traité en mode d’immunoréaction directe rapide. Cette méthode CL-ELISA pourrait être appliquée pour la détection spécifique, rapide, semi-quantitative et quantitative des BOUCHONS dans les cosmétiques, facilitant le contrôle de qualité précis de la contamination des bouchons.

1. Introduction

Le chloramphénicol (CAP) est un membre de la famille des agents antibactériens amphénicol, et ils ont été produits par le streptocoque vénézuélien (structure illustrée à la figure 1). Le chloramphénicol est généralement un antibiotique à large spectre doté d’une activité antimicrobienne efficace. Il peut être généralement contre une variété répandue de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, y compris les organismes anaérobies. En raison de sa forte activité, le chloramphénicol est largement utilisé dans les industries de l’élevage, de l’aquiculture et des cosmétiques pour la prévention et le traitement des infections bactériennes. Dans des publications récentes, le chloramphénicol aurait été utilisé pour le traitement de l’épifolliculite, de l’acné et d’autres affections cutanées. Le chloramphénicol a également été largement adopté dans les cosmétiques comme antiseptique pour inhiber la croissance des micro-organismes.

Figure 1

Cependant, des études récentes ont montré que les antibiotiques amphénicols présentaient des effets indésirables potentiels pour la santé humaine. Par conséquent, les applications du chloramphénicol sont interdites dans de nombreux pays, y compris les membres de l’UE, les États-Unis et la Chine. Bien qu’il existe des réglementations officielles pour ces antibiotiques, le chloramphénicol est toujours ajouté illégalement aux cosmétiques, en raison de son faible coût et de son excellent effet antibactérien. Afin d’assurer la sécurité des cosmétiques et de préserver la santé humaine, il est émergent de développer des méthodes sensibles, fiables et disponibles pour la détection du chloramphénicol aux niveaux de traçage dans les échantillons de cosmétiques.

De nombreuses méthodes analytiques ont été rapportées pour la détection du CAP et des antibiotiques connexes, telles que la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la chromatographie en phase liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Cependant, ces méthodes nécessitent principalement des instruments coûteux, des procédures de prétraitement compliquées et un personnel bien formé, et elles ne convenaient pas au dépistage rapide d’un grand nombre d’échantillons. Des immunoessais principalement basés sur la reconnaissance spécifique anticorps-antigène ont été adoptés pour le criblage rapide et à haut débit des analytes cibles. Un substrat chimiluminescent à caractère hautement sensible pourrait être utilisé dans une plate-forme de dosage immuno-enzymatique direct chimiluminescent (CL-ELISA). Par rapport aux protocoles colorimétriques conventionnels, la sensibilité des immunoessais pourrait être améliorée d’au moins 2 à 3 fois avec le chimioluminescent comme substrat.

Les publications précédentes sur la détection par immunodosage du CAP ne permettent pas de distinguer le CAP de ses analogues de la famille des amphénicols (Figure 1), y compris le thiamphénicol (TAP) et le florfénicol (FF), en raison des anticorps spécifiques à large large. Dans ces recherches, il est difficile de déterminer si le BOUCHON de contamination, ses analogues, ou la somme d’entre eux en cas de résultat positif. Dans cette recherche, nous avons utilisé un anticorps monoclonal anti-CAP (mAb) hautement spécifique qui peut se lier à la spécificité du CAP et à des valeurs de CR négligeables pour la plupart des analogues testés. Sur la base de ce même mAb, une méthode CL-ELISA très spécifique et directe a été développée pour la détermination des traces de CAP dans les cosmétiques. Ce protocole développé ne nécessite pas de réaction de conjugaison indirecte complexe avec un anticorps secondaire marqué HRP. Avec un substrat chimiluminescent, la sensibilité pourrait être améliorée de manière significative (schéma illustré à la figure 2). Avec l’utilisation de mAb anti-CAP marqué par HRP, le dosage a été effectué en mode d’immunoréaction directe rapide sans procédures d’immunoréaction complexes. Cette méthode CL-ELISA peut être appliquée pour la détection spécifique, rapide, semi-quantitative et quantitative de la PAC dans les cosmétiques, et ce travail contribuera au contrôle de la qualité et à la régulation de la PAC.

Figure 2

2. Matériaux et méthodes

2.1. Produits chimiques et réactifs

Les étalons Chloramphénicol (CAP), ciprofloxacine (CIP), florfénicol, (FF), pénicilline (PEN), ractopamine (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazine (SUL) et thiamphénicol (TAP) ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (pureté à 99%, St. Louis, MO, USA). L’antigène conjugué CAP et l’anticorps CAP marqué par HRP ont été obtenus à partir de ZeYang Co. (Pékin, Chine). Une solution de substrat de chimiluminescence supersignale a été achetée auprès de Thermo Fisher (États-Unis). Le système de synthèse Milli-Q a été obtenu à partir de Millipore (Bedford, MA, USA) pour la purification de l’eau. D’autres réactifs (de qualité analytique) ont été achetés auprès de Beijing Reagent Corp. (Beijing, Chine).

2.2. Équipement et Instrumentation

Plaques de microtitres en polystyrène à 96 puits opaques blanches Costar (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) ont été utilisés dans ce travail. Le lecteur de microplaques SpectraMax M5 a été obtenu à partir de Molecular Devices (CA, USA). La centrifugeuse MIKRO 22R a été obtenue à partir de Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Allemagne).

2.3. Tampons et solutions

Pour ce test CL-ELISA développé, différents tampons et solutions ont été préparés pour l’immunoessai.

Solution saline tampon phosphate (PBS, 0,01M, pH 7,4) : 8,0 g de NaCl, 2,9 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4 et 0,2 g de KCl ont été dissous dans 1 L d’eau désionisée.

Tampon de blocage (pH 7,4): 0,5% de caséine dans 0,01 M de PBS.

Tampon d’enrobage (pH 9,6) : 1,59 g de Na2CO3 et 2,93 g de NaHCO3 ont été dissous dans 1 L d’eau désionisée.

Tampon de dilution enzymatique (pH 7,4): 5% de sérum fœtal bovin dans 0,01 M de PBS.

Tampon de lavage (PBST): 0,01% Tween-20 dans 0,01 M de PBS.

2.4. Procédure ELISA chimiluminescente compétitive (CL-ELISA)

Des plaques de microtitres en polystyrène opaque à 96 puits Costar blanches ont été adoptées pour la réaction d’immunoessai. 100 µL d’antigène conjugué CAP ont été dissous dans du tampon d’enrobage à une concentration finale à 0,00042 ng mL-1 qui a été ajouté et incubé à 4°C pendant 20 h pour l’enrobage. Après trois lavages au tampon de lavage, un tampon de blocage (150 µL par puits) a été ajouté à chaque puits et incubé pour occuper les sites actifs en excès à 37 ° C pendant 1,5 h. Les plaques enrobées ont été stockées à 4 °C avant utilisation.

Pour l’analyse du BOUCHON, les plaques de microtitres revêtues ont été préconditionnées à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, 30 µL d’échantillons traités ou d’étalon de CAP et 70 µL d’anticorps anti-CAP marqués HRP (2,46 ng mL-1) dilués par un tampon de dilution enzymatique ont été ajoutés à tour de rôle dans chaque puits. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 30 min pour une réaction concurrentielle directe. Après cinq lavages de la plaque avec du tampon de lavage, une solution de substrat de chimiluminescence supersignale (100 µL /puits) a été ajoutée et l’intensité de chimiluminescence de chaque puits a été mesurée avec un lecteur de microplaques SpectraMax M5.

2.5. Courbe standard

Dix niveaux de concentration différents ont été testés pour l’évaluation des courbes d’étalonnage. La concentration la plus élevée était de 1000 ng mL−1, et les concentrations suivantes ont été diluées en série par un tiers de la concentration précédente. Chaque concentration a été exécutée en trois fois selon le protocole CL-ELISA.

B/B0 est défini pour le rapport de chimiluminescence des résultats. Ici, B représente l’intensité de chimiluminescence de différentes concentrations standard de CAP, et B0 représente l’intensité de chimiluminescence sans norme de CAP dans chaque test.

Les courbes standard ont été évaluées en traçant B /B0 à différentes concentrations d’étalon de CAP et en ajustant les données à l’équation logistique à quatre paramètres suivante en utilisant Origin (version 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA): Dans cette équation, A représente l’asymptote supérieure (rapport de chimiluminescence B/B0 sans étalon de CAP). B est la pente de la courbe au point d’inflexion. C, représentant 50% de l’absorbance maximale, est la valeur X au point d’inflexion. Et D est l’asymptote inférieure (signal de fond).

2.6. Préparation des échantillons pour l’analyse CL-ELISA

Des échantillons cosmétiques (2,00 g ± 0,02 g) ont été pesés avec précision et transférés dans des tubes à centrifuger en polypropylène de 50 mL. Ensuite, 20 mL de PBS ont été ajoutés et vortexés pendant 30 s, puis ultra-sonication pendant 3 min pour l’extraction du BOUCHON. Chaque échantillon a été centrifugé à 12000 g pendant 10 min à 4°C, et le surnageant a été recueilli et filtré sur une membrane de 0,22 µm. Trente aliquotes de microlitre du surnageant de chaque échantillon ont été ajoutées à une plaque revêtue de 96 puits pour analyse selon la procédure CL-ELISA développée.

2.7. Précision et précision

Des échantillons de cosmétiques de lotion primaire négative ont déjà été confirmés par des analyses UPLC-MS/MS. Ensuite, chaque échantillon a été dopé avec l’étalon CAP à trois concentrations différentes de 5, 20 et 100 ng L-1. L’analyse a été traitée selon le protocole CL-ELISA développé avec cinq répliques chacune (n = 5). Les concentrations des échantillons ont été calculées selon la courbe d’étalonnage, et la précision et la précision ont été évaluées sur la base des récupérations de tous les échantillons.

3. Résultats et discussion

3.1. Spécificité de l’essai

La spécificité de la méthode a été évaluée en évaluant l’étendue de la réactivité croisée (CR) avec des composés structurellement apparentés de CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL et TAP. Les valeurs de CR ont été évaluées avec l’équation suivante:Dans cette équation, IC50 est la demi-concentration inhibitrice maximale d’une substance. Les résultats de spécificité du mAb anti-CAP sont présentés dans le tableau 1. À partir des résultats, des valeurs de CR négligeables (inférieures à 0,01%) ont été obtenues pour tous les analogues étudiés dans cette recherche, y compris les TAP et FF les plus liés à la structure. On peut en conclure que ce test CL-ELISA développé pourrait être appliqué pour la détection de CAP spécifique.

Analogue IC50 (ng mL−1) CR (100%) CAP 0.034 100 TAP >1,000 <0.01 FF >1,000 <0.01 SAL >1,000 <0.01 RAC >1,000 <0.01 SUL >1,000 <0.01 CIP >1,000 <0.01 PEN >1,000 <0.01

Tableau 1

IC50 et valeur de réactivité croisée (CR) des analogues de CAP .

3.2. Optimisation de la procédure CL-ELISA

Le rapport antigène/anticorps dans un système de réaction compétitif influence de manière significative l’immunoréaction. Dans ce protocole CL-ELISA, le rapport antigène/anticorps a été évalué et optimisé. Rapports antigène / anticorps de 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, et 30:70 ont été étudiés. Les résultats ont été optimisés selon IC50 et RLUmax (unités lumineuses relatives maximales) et présentés dans le tableau 2. La valeur de la CI50 a augmenté de manière significative avec l’augmentation du ratio d’anticorps. Lorsque le rapport antigène / anticorps était de 70: 30, le résultat le plus sensible avec la valeur IC50 la plus faible a été obtenu. De plus, une proportion élevée d’anticorps a conduit à une valeur élevée de RLUmax. Cependant, pour les rapports antigène/anticorps testés, toutes les valeurs de RLU convenaient à la détection de CAP. En raison de la sensibilité élevée du substrat chimiluminescent, il n’y avait pas de différence apparente de la valeur de RLUmax. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. La sensibilité

IC50, LOD (mesurée par IC10) et la plage de détection (IC20−IC80) ont été obtenues à partir de la courbe d’étalonnage sigmoïdale pour évaluer la sensibilité du protocole CL-ELISA proposé (Figure 3). Dans cette recherche, la LOD était de 0,0021 ng mL-1 tandis que la valeur de la CI50 était de 0,016 ng mL−1 pour le CAP. La plage de détection de cette méthode était de 0,00979 à 0,12026 ng mL−1. Par rapport aux immunoessais établis, cette méthode présentait une sensibilité plus élevée et une LOD plus faible pour le CAP.

Figure 3

3.4. Précision et précision

Pour une investigation précise et précise, les récupérations de la PAC dans les échantillons enrichis ont été calculées en premier. Et l’exactitude et la précision ont été évaluées avec cinq répliques chacune sur trois jours de validation. À trois niveaux enrichis de 5, 20 et 100 ng L-1, les taux moyens de récupération des CAPSULES dans les échantillons de cosmétiques à base de lotion d’apprêt à pointes variaient de 82,7 % à 99,6 %. Les variations intrajournalières et inter-journalières étaient inférieures à 9,8 % et 8,2 %, respectivement (les résultats sont présentés dans le tableau 3).

Analyte Spiked level (ng L−1) Recovery (%) Intra-day variation (%) Inter-day variation (%) CAP 5 82.7−99.6 9.8 8.2 20 85.3−98.9 7.9 6.4 100 88.6−96.9 6.1 5.5

Tableau 3

Précision et précision du capuchon dans les échantillons cosmétiques à pointes.

4. Conclusions

Dans le cadre de cette recherche, une méthode CL-ELISA nouvelle et très sensible pour la détection des bouchons dans les cosmétiques a été développée. Le mAb utilisé dans l’essai a montré une spécificité élevée pour le CAP avec des valeurs de CR négligeables par rapport à ses analogues, en particulier pour la plupart des TAP et FF liés à la structure. Sur la base de ce mAb même, la méthode CL-ELISA proposée pourrait être appliquée pour la détection de CAP spécifiquement au lieu de mélanges de CAP et d’autres analogues. Il s’agit du premier rapport d’un CL-ELISA pour la détermination de la PAC dans les cosmétiques. La méthode LOD était de 0,0021 ng mL-1, IC50 était de 0,016 ng mL-1 et la plage de détection était de 0,00979 à 0,12026 ng mL−1. Dans les échantillons de cosmétiques à pointes, les récupérations moyennes variaient de 82,7 % à 99,6 %, la variation intrajournalière et interjournalière étant inférieure à 9,8 % et 8,2 %, respectivement. L’analyse offre les avantages d’une grande spécificité, d’une simplicité, de temps d’analyse rapides et d’une rentabilité élevée. En ce qui concerne sa sensibilité et sa spécificité, la méthode CL-ELISA développée est supérieure à la plupart des essais immunologiques rapportés pour la détection du CAP. On peut en conclure que cette méthode CL-ELISA développée pourrait être appliquée à la détection spécifique, rapide, semi-quantitative et quantitative de la CAP dans les cosmétiques.

Disponibilité des données

Les données utilisées pour étayer les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Nous tenons à remercier LetPub(www.letpub.com ) pour fournir une assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Programme clé National R&D de la Chine (no. 2017YFE0110800), la Fondation Nationale des Sciences Naturelles de Chine (no. 31871718) et l’action de Recherche et d’Innovation Horizon 2020 de l’UE (no. 727864-EU-China-Safe).