Utilisation d’analogues de l’ATP par des CDK modifiés

Nous avons généré des CDK mutants « Shokat » contenant des échanges d’acides aminés à un résidu volumineux conservé dans leurs poches de liaison à l’ATP. Dans le cas de CDK2 et CDK3, il s’agit d’un échange phénylalanine-alanine en position 80, désigné CDK2 (F80A). Nous avons également synthétisé 12 analogues de l’ATP pour déterminer si les CDK modifiés peuvent utiliser ces analogues pour phosphoryler la protéine de rétinoblastome recombinant (Rb) in vitro, et nous avons constaté qu’ils utilisaient le N6- (2-phényléthyl)-ATP (PE-ATP) le plus efficacement possible (Figure 1a, et données non illustrées). Bien que le type sauvage et la cycline E-CDK2 (F80A) utilisent tous deux de l’ATP normal pour phosphoryler la protéine glutathion-S-transférase (GST)-Rb, seule la kinase F80A peut utiliser du PE-ATP. Des résultats similaires ont été obtenus avec la cycline E-CDK3, mais dans ce cas, le mutant F80A ne pouvait plus utiliser d’ATP normal, bien que la base structurelle de cette observation ne soit pas claire (Figure 1a). Ces études ont confirmé que les kinases de type sauvage et modifiées présentent les spécificités ATP souhaitées.

Alors que les CDK mutants utilisaient efficacement le PE-ATP pour phosphoryler Rb in vitro, des expériences similaires utilisant du PE-ATP radiomarqué dans des lysats cellulaires ont échoué car le phosphate marqué était clivé du PE-ATP par une activité ATPase dans les lysats (données non montrées). Nous sommes donc passés à la forme thiophosphate de l’analogue ATP (PE-ATP-γ-S), qui n’a pas été hydrolysé par les lysats (Figure 1b). Bien que les kinases utilisent souvent l’ATP-γ-S moins efficacement que l’ATP normal, la thiophosphorylation présente plusieurs avantages dans ce contexte. Premièrement, les thiophosphates sont plus stables et résistants aux phosphatases. Deuxièmement, comme il n’y a pas d’événements de thiophosphorylation préexistants dans les cellules, le marquage au thiophosphate fournit des marqueurs uniques pour les protéines phosphorylées par la kinase mutante. Enfin, le groupe thiophosphate a des propriétés chimiques similaires au groupe sulfhydryle et se prête à des modifications chimiques. Nous avons exprimé et purifié des complexes solubles de type sauvage et de cycline A-CDK2 (F80A) à partir de bactéries et effectué un test similaire de la Rb kinase pour tester leur capacité à utiliser le PE-ATP-γ-S. Comme le montre la figure 1c, bien que les deux kinases puissent utiliser l’ATP ou l’ATP-γ-S pour phosphoryler la protéine GST-Rb (comme l’indique son changement d’électromobilité), seul le mutant F80A peut utiliser le PE-ATP-γ-S. Nous avons donc utilisé le PE-ATP-γ-S pour toutes nos études ultérieures.

Purification en une seule étape des peptides thiophosphorylés

L’utilisation d’analogues de CDK et d’ATP modifiés facilite la phosphorylation de substrat hautement spécifique: le prochain défi est de savoir comment les identifier au sein d’un lysat complexe. Nous avons cherché à utiliser les balises thiophosphates pour capturer et enrichir de manière covalente les peptides thiophosphorylés après phosphorylation et digestion des lysats. Cependant, un problème clé était de distinguer chimiquement les thiophosphopeptides et les peptides contenant de la cystéine. Bien qu’une méthode chimiosélective d’enrichissement des thiophosphopeptides ait été décrite, l’abondance écrasante de résidus de cystéine dans un mélange protéique complexe rend cette approche difficile. Nous avons utilisé une méthode simple de capture et de libération pour isoler sélectivement des peptides thiophosphorylés dans des lysats cellulaires trypsinisés (Figure 2a). Les protéines contenues dans le lysat ont été phosphorylées in vitro avec de la cycline A-CDK2 (F80A) et du PE-ATP-γ-S. Le mélange de protéines a ensuite été digéré et les peptides résultants ont été mélangés avec du Thiopropyl Sepharose 6B, une résine disulfure activée qui capture à la fois des peptides contenant de la cystéine et des thiophosphopeptides par une réaction d’échange de disulfure. Étant donné que l’élution traditionnelle du dithiothréitol (DTT) libère les deux types de peptides liés, nous avons utilisé les différences qualitatives entre les peptides thiophosphates liés à la résine et les peptides contenant de la cystéine au niveau de la liaison phosphorothiolatesulfure et de la liaison alkyldisulfure, respectivement. À des valeurs de pH élevées, la liaison phosphorothiolatesulfure est hydrolysée et l’alkyldisulfure reste intact. Le traitement de la résine avec une base forte (comme l’hydroxyde de sodium) libère spécifiquement des thiophosphopeptides (et les convertit également en phosphopeptides normaux), mais pas les peptides contenant de la cystéine, en hydrolysant la liaison phosphorothiolatesulfure (Figure 2b). Comme les peptides liés par la cystéine ne sont pas élués dans l’étape finale, nous ne pouvons pas récupérer les thiophosphopeptides contenant de la cystéine. De plus, l’élution entraîne une perte de la signature thiophosphate en convertissant le thiophosphopeptide en phosphopeptide. Notre méthode d’isolement des thiophosphopeptides diffère modestement de celle de Blethrow et al. en ce sens, nous capturons les thiophosphopeptides en utilisant la chimie d’échange de disulfure (résine disulfure) au lieu de l’alkylation (résine iodoacétamide), et nous les élutons sélectivement par hydrolyse de base plutôt que par oxydation.

Pour tester la faisabilité de cette approche, nous avons phosphorylé le GST-Rb avec la cycline A-CDK2 (F80A) et le PE-ATP-γ-S, et appliqué notre procédure de purification à un digest de trypsine du mélange réactionnel. Les peptides isolés ont été analysés par spectrométrie de masse tandem électrospray (ESI-MS/ MS) à l’aide d’un spectromètre de masse à piège à ions. Les peptides ont été identifiés en faisant correspondre les spectres de masse en tandem à une base de données de séquences de protéines humaines (avec une séquence GST-Rb ajoutée) à l’aide du logiciel SEQUEST. Le substrat GST-Rb contient cinq cystéines ainsi que sept sites SP/ TP, qui sont des sites favorisés pour la phosphorylation de CDK. Nous avons récupéré plusieurs phosphopeptides contenant uniquement et tous les sites de phosphorylation attendus (Tableau 1). De plus, nous n’avons récupéré aucun peptide contenant de la cystéine et très peu de peptides non spécifiques. Cela a fourni une preuve de principe pour nos essais à grande échelle.

Identification de substrats de la cycline A-CDK2 humaine dans les lysats cellulaires

Notre objectif était d’identifier la cycline A- Substrats CDK2 à l’échelle du protéome. Pour réduire la complexité de l’échantillon, nous avons fractionné le lysat cellulaire entier des cellules HEK293 en 11 fractions en utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et la précipitation de sulfate d’ammonium (fichier de données supplémentaires 1). Nous avons ensuite effectué des dosages in vitro de kinases sur chaque fraction. Comme contrôle positif, nous avons également ajouté une petite quantité de GST-Rb à chaque réaction. Après avoir digéré le mélange réactionnel avec la trypsine, nous avons appliqué notre protocole de purification pour isoler les thiophosphopeptides des mélanges peptidiques. Les peptides récupérés ont été soumis à une chromatographie liquide – analyse MS/MS et à une recherche de base de données. Nous avons récupéré un nombre variable de peptides et au moins un phosphopeptide Rb de chacune des fractions de lysat (fichier de données supplémentaires 2).

Les CDK phosphorylent les protéines d’une manière dirigée par la proline sur la sérine ou la thréonine, et de nombreuses études soutiennent l’idée que le motif S/T-P-X-R/K représente le motif de consensus CDK. À partir des phosphopeptides, nous avons identifié un total de 203 protéines : 180 candidats ont été phosphorylés au sein de motifs SP ou TP (dirigés par la proline; Fichier de données supplémentaires 3). Ces substrats candidats représentent un large éventail de processus biologiques, y compris le contrôle du cycle cellulaire, le métabolisme de l’ADN et de l’ARN, la traduction et les structures cellulaires (Figure 3). Un total de 96 sites dirigés par la proline sur 222 (43%) étaient conformes au consensus CDK connu (avec un résidu chargé positivement en position +3). Fait intéressant, environ 24% des sites dirigés par la proline (53/222) contenaient un résidu chargé positivement dans les positions +4 ou +5, ce qui suggère que ce motif peut également être favorisé par CDK2. En effet, Blethrow et al. a également noté qu’un nombre important de substrats de la cycline B-CDK1 contiennent des sites non consensuels. Pour les peptides contenant des sites non consensuels, nous avons constaté qu’environ 50% des protéines correspondantes portaient au moins un motif K/RXLφ ou K/RXLXφ (où φ est un gros résidu hydrophobe et X est un acide aminé quelconque) distal des sites de phosphorylation, et presque toutes portaient au moins un motif RXL minimal (fichier de données supplémentaires 3). Ceci est cohérent avec l’idée bien établie que ces motifs favorisent la liaison de la cycline A-CDK2 aux substrats. En plus de sélectionner pour les phosphorylations avec des motifs de consensus CDK, nous avons identifié 28 protéines qui ont déjà été impliquées comme substrats CDK (marquées en gras dans le fichier de données supplémentaires 3). Ainsi, près de 15% de nos candidats ont déjà été trouvés comme cibles CDK, ce qui confirme l’idée que nos méthodes capturaient et enrichissaient les substrats CDK2. Enfin, 43% des phosphorylations que nous avons trouvées ont déjà été identifiées dans des analyses de phosphoprotéomes in vivo à grande échelle, indiquant que ces phosphorylations ne sont pas limitées à nos conditions de lysat.

Nos études et celles rapportées par Blethrow et al. nous avons utilisé des schémas d’isolement de phosphopeptides similaires et des cyclines-CDK connexes, et nous nous attendions à ce qu’il puisse y avoir un chevauchement substantiel dans les substrats révélés par les deux études. En effet, nous avons trouvé près de 50% (30/68) des substrats de la cycline B-CDK1 dans notre liste de candidats de la cycline A-CDK2 ; ainsi, ces méthodes sont robustes et reproductibles (fichier de données supplémentaires 4). Cependant, il existe également des différences substantielles entre les deux listes, et celles-ci résultent probablement de nombreux facteurs, notamment des différences procédurales, des types cellulaires différents, une identification peptidique incomplète par la SEP et une spécificité de substrat conférée par les sous-unités de cycline et / ou de kinase. Certaines de ces différences peuvent également refléter les différentes fonctions biologiques de la cycline A-CDK2 et de la cycline B-CDK1. Par exemple, nous avons trouvé neuf protéines impliquées dans la traduction des protéines et / ou la fonction des ribosomes, mais aucune de ces protéines n’a été trouvée avec la cycline B-CDK1, malgré leur abondance relativement élevée.

Bien que nous ayons identifié un certain nombre de substrats CDK2 connus, nous n’avons pas identifié certains substrats CDK2 précédemment décrits. Certains des facteurs énumérés ci-dessus peuvent également expliquer l’incapacité de trouver des substrats CDK2 connus dans nos analyses. De plus, les substrats déjà phosphorylés par des CDK endogènes n’auraient pas été thiophosphorylés in vitro. Il est également possible que certaines protéines n’aient pas été solubilisées lors de la préparation du lysat et/ou de l’étape de sonication et exclues de nos analyses. Enfin, il est possible que de grands complexes protéiques aient été perturbés par les procédures de fractionnement avant la réaction de kinase, et que les protéines phosphorylées par CDK2 uniquement dans le cadre de ces complexes ne soient pas découvertes par nos méthodes.

Nous avons également récupéré quatre phosphopeptides correspondant à la cycline A et au CDK2 et 27 phosphopeptides supplémentaires avec des sites non dirigés par la proline (fichier de données supplémentaires 5). Nous soupçonnions que ces phosphopeptides résultaient de l’auto-phosphorylation de la cycline A-CDK2 et de la phosphorylation de fond par d’autres kinases, et d’autres ont rapporté une phosphorylation de fond similaire. Pour tester ces possibilités, nous avons réalisé une réaction de kinase témoin en utilisant la cycline A-CDK2 (F80A) et le PE-ATP-γ-S sans lysat cellulaire ajouté et récupéré trois des quatre peptides de cycline A-CDK2 (fichier de données supplémentaires 5). De plus, lorsque nous avons effectué une réaction similaire « kinase seule » en présence de γ-32P-ATP, nous avons observé l’incorporation de 32P dans ces deux protéines de manière dose-dépendante (fichier de données supplémentaires 6). Ces expériences ont confirmé qu’il y avait une auto-phosphorylation de fond de la cycline A-CDK2 dans les essais originaux.

Nous avons également effectué des réactions de kinases témoins en utilisant les fractions de lysat, GST-Rb ‘spike-in’ et PE-ATP-γ-S sans ajout de cycline A-CDK2. Ces réactions témoins  » no-kinases » ont phosphorylé 7 des 27 phosphopeptides dirigés non proline de notre liste (fichier de données supplémentaires 5), suggérant que la plupart, sinon la totalité, de ces phosphopeptides résultaient d’une phosphorylation de fond par des kinases capables d’utiliser l’analogue de l’ATP dans une mesure limitée. Par exemple, la plupart de ces peptides contiennent des sites de phosphorylation dirigés vers des résidus acides qui sont des motifs de caséine kinase 2. La caséine kinase 2 est unique en ce qu’elle peut utiliser le GTP ainsi que l’ATP; ainsi, le site actif peut accueillir les analogues volumineux de l’ATP, tels que le PE-ATP. Fait important, nous n’avons récupéré aucun phosphopeptide Rb de ces expériences témoins, ce qui indique qu’il n’y avait pas d’activité CDK non spécifique dans nos dosages. Nous avons également récupéré 44 peptides non modifiés, dont 12 contenaient des résidus de cystéine. La majorité de ces peptides provient de plusieurs fractions de lysat (fichier de données supplémentaires 2). Nous soupçonnons que celles-ci résultent d’une liaison non spécifique de faible niveau des peptides à la résine malgré des conditions de lavage strictes, et dans le cas des peptides contenant de la cystéine, d’une faible hydrolyse de la liaison alkyldisulfure lors de l’étape d’élution. En résumé, nos méthodes étaient très sélectives et nos études ont identifié un groupe étonnamment important de substrats candidats de la cycline A-CDK2, dont la plupart n’ont pas été précédemment identifiés comme cibles CDK.

Validation de substrats candidats en tant que cibles de cycline A-CDK2

Nous avons utilisé plusieurs stratégies pour valider certains des nouveaux candidats de notre liste en tant que substrats de cycline A-CDK2. Parce que nos identifications de protéines étaient basées sur des séquences peptidiques, nous avons commencé par confirmer que la cycline A-CDK2 phosphorylait trois candidats complets et natifs immunoprécipités via des étiquettes épitopiques à partir de 293 cellules transfectées (EF2, TRF2 et RAP1). Comme ces protéines n’étaient pas présentes sur la liste des cyclines B-CDK1, nous avons déterminé si elles étaient également phosphorylées par la cycline B-CDK1. Chaque candidat CDK2 a été phosphorylé à la fois par la cycline A-CDK2 et la cycline B-CDK1, bien que EF2 ait été phosphorylé dans une moindre mesure que TRF2 ou RAP1 (Figure 4a). Nous avons également exprimé TRF2, RAP1 et la protéine ribosomique RL12 sous forme de fusions GST et les avons purifiées à partir d’Escherichia coli. Lorsque nous avons utilisé la cycline A-CDK2 pour phosphoryler TRF2 et RAP1 in vitro, les protéines ont été fortement phosphorylées, et les analyses de la SEP ont révélé que ces phosphorylations se produisaient sur les mêmes sites que nous avions initialement identifiés (Figure 4b). Nous avons également utilisé la cycline A-CDK2 et la cycline B-CDK1 pour phosphoryler la GST-RL12, et nous avons constaté que les deux CDK phosphorylaient également la RL12 in vitro (figure 4c). Ces études confirment ainsi que les peptides identifiés dans notre criblage représentent des protéines pouvant être phosphorylées par la cycline A-CDK2, au moins in vitro. Bien que nous ayons trouvé des différences qualitatives dans la capacité de la cycline A-CDK2 et de la cycline B-CDK1 à phosphoryler des protéines spécifiques, dans chaque cas, les candidats ont été phosphorylés par les deux CDK. Étant donné que la préparation enzymatique que nous avons utilisée dans ces études contenait un excès de CDK2 libre (F80A), nous avons envisagé la possibilité que certaines phosphorylations du substrat résultent de l’association de cyclines endogènes avec CDK2 (F80A) qui était soit monomère, soit qui pourrait s’être dissociée de la cycline A pendant les conditions d’essai. Nous avons constaté que la quantité d’activité de la cycline B-CDK2 (F80A) dans ces extraits était négligeable par rapport à la cycline A-CDK2 (F80A), et nous n’avons pu détecter aucune activité de la cycline E-CDK2 (F80A) (fichier de données supplémentaire 7). Néanmoins, on ne peut exclure la possibilité que certains peptides aient été phosphorylés par CDK2 (F80A) en complexe avec une cycline endogène, et la spécificité de tout substrat candidat pour la cycline A par rapport aux autres cyclines activant CDK2 doit être validée comme décrit ci-dessous.

Validation de RL12 en tant que substrat in vivoCDK2

Les études ci-dessus ont validé plusieurs nouveaux candidats identifiés dans notre écran comme substrats CDK2 in vitro. Cependant, pour déterminer si un nouveau substrat est également phosphorylé par CDK2 in vivo, nous avons effectué une analyse plus complète de la protéine ribosomique RL12. Nous avons d’abord mélangé des immunoprécipités de cycline A-CDK2 et de RL12 marqués par épitope exprimés dans des cellules humaines en présence de γ-32P-ATP et avons constaté que la cycline A-CDK2 phosphorylait RL12 in vitro (Figure 5a). La phosphorylation a été en grande partie abolie chez un mutant RL12 où la phosphosérine S38 identifiée a été remplacée par une alanine, et elle a été rétablie lorsque la S38 a été remplacée par une thréonine (Figure 5b). Nous avons ensuite utilisé la cartographie des phosphopeptides pour identifier le peptide contenant S38 et confirmé qu’il était directement phosphorylé par CDK2 in vitro (figure 5c). Pour tester si RL12 est également phosphorylé in vivo de manière dépendante de CDK2 au même site, nous avons marqué métaboliquement des cellules avec du 32P-orthophosphate et immunoprécipité de type sauvage ou de RL12-S38A à partir de cellules surexprimant soit la cycline E-CDK2, la cycline E-CDK2 catalytiquement inactive, soit l’inhibiteur de CDK p21 (pour inhiber les CDK endogènes). Comme nous ne pouvons pas étudier la phosphorylation endogène de la RL12 en raison de l’absence d’anticorps anti-RL12 approprié, ces études ont examiné la phosphorylation de la RL12 ectopique in vivo (ces conditions de transfection ont conduit à une surexpression d’environ cinq à dix fois l’ARNm de la RL12 (fichier de données supplémentaires 8). Nous avons constaté que le RL12 sauvage, mais pas le RL12-S38A, était phosphorylé in vivo (figure 5d). Cette phosphorylation a été améliorée dans les cellules surexprimant la cycline E-CDK2, mais pas la cycline E-CDK2 inactive, et a été diminuée dans les cellules surexprimant l’inhibiteur de CDK p21 (qui inhibe les cyclines-CDK endogènes; Figure 5d). Enfin, nous avons utilisé la cartographie des phosphopeptides et des analyses phosphoaminoacides de la protéine RL12 immunoprécipitée à partir des cellules marquées et avons confirmé que la phosphorylation de la RL12 par la cycline E-CDK2 in vivo s’est également produite sur S38 (Figure 5e). La phosphorylation in vivo de RL12 S38 a également été rapportée dans des études sur les phosphoprotéomes.

Bien que nous ayons validé chacun des nouveaux candidats que nous avons testés jusqu’à présent en montrant que les protéines de pleine longueur sont phosphorylées par CDK2, certains candidats de notre liste ne seront probablement pas des substrats physiologiquement pertinents de la cycline A-CDK2. Par exemple, les réactions de kinase ont été effectuées dans des lysats, et la compartimentation subcellulaire in vivo peut restreindre l’accès de CDK2 à certains candidats. De plus, il est possible que d’autres kinases cellulaires soient soit redondantes avec, soit plus importantes que CDK2 par rapport à des substrats individuels in vivo. Il est donc essentiel que les candidats soient évalués rigoureusement dans un contexte aussi physiologique que possible. À cette fin, dans les études en cours, nous utilisons une approche de ciblage génétique pour muter un sous-ensemble de ces sites de phosphorylation dans les gènes endogènes afin d’étudier leur signification physiologique.