Criblage de marqueurs de surface cellulaire humaine

Les cellules hESC et hPSC-RPE ont été dissociées en cellules uniques à l’aide de TrypLE pendant 5 à 10 minutes. Les vésicules optiques ont été dissociées en cellules uniques à l’aide de TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) pendant 10 min, suivies d’une dissociation physique à l’aide d’une aiguille de 20 G. Pour permettre l’analyse simultanée de ces différentes populations dans un même échantillon, les cellules hESC, hPSC-RPE et les cellules vésiculaires optiques ont été marquées avec CellTrace™ CFSE (0,25 µM) pendant 7 min à 37 °C ou CellTrace™ Violet (5 µM) pendant 20 min à 37 °C en suivant le protocole du fabricant (Thermo Fisher Scientific). Ensuite, les trois types de cellules ont été colorés à l’aide des panneaux de criblage BD Lyoplate™ (BD Biosciences) suivant le protocole du fabricant. Le codage à barres des cellules a permis de distinguer facilement les trois groupes de cellules et de minimiser la variabilité de l’échantillon pendant le criblage. Des échantillons ont été analysés sur des plaques à 96 puits sur un LSRFortessa équipé de lasers 405, 640, 488, 355 et 561 nm (BD Biosciences) ou un CytoFLEX équipé de lasers 405, 638, 488 et 561 nm (Beckman Coulter). Les cellules non viables ont été exclues de l’analyse en utilisant un colorant d’acide nucléique 7-AAD (7-aminoactinomycine D) (BD Biosciences). L’analyse des données a été réalisée à l’aide du logiciel FlowJo v.10 (Tree Star). L’écran marqueur de surface cellulaire a été réalisé une fois pour les vésicules optiques 3D et une fois pour hPSC-RPE jour 60.

Culture cellulaire

Les lignées hESC HS980 et HS983 ont été précédemment dérivées et cultivées dans des conditions définies et exemptes de xéno30 (Swedish Ethical Review Authority:2011/745:31/3). Les donneurs ont donné leur consentement éclairé pour la dérivation et l’utilisation ultérieure des lignées hESC. La lignée hESC WA09/H9 a été obtenue à partir de Wicell et a été adaptée à une culture sans alimentation sur hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). Les cellules ont été maintenues par propagation clonale sur des plaques revêtues de hrLN-521 en milieu NutriStem hPSC XF (Biological Industries), dans un incubateur à 5% de CO2 / 5% d’O2, et passées enzymatiquement à un rapport de 1:10 tous les 5-6 jours.

Les lignes hiPSC CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I et CTRL-14-II ont été gracieusement fournies par le centre central iPSC du Karolinska Institutet (Autorité suédoise d’Examen éthique: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Les donneurs ont donné leur consentement éclairé pour la dérivation et l’utilisation ultérieure des lignées hiPSC. Les cellules ont été maintenues par propagation clonale sur des plaques revêtues de hrLN-521 (Biolamina) en milieu NutriStem hPSC XF (Biological Industries), dans un incubateur à 5% de CO2 / 5% d’O2 et passées enzymatiquement à un rapport de 1:10 tous les 5-6 jours.

Pour le passage, les cultures confluentes ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2+ et Mg2+ et incubées pendant 5 min à 37 °C, 5% CO2 / 5% O2 avec TrypLE Select. L’enzyme a ensuite été soigneusement éliminée et les cellules ont été collectées dans un milieu NutriStem hPSC XF frais préchauffé par pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules ont été centrifugées à 300 × g pendant 4 min, la pastille remise en suspension dans un milieu NutriStem hPSC XF frais préchauffé et les cellules plaquées sur un plat fraîchement revêtu de hrLN-521. Deux jours après le passage, le support a été remplacé par un support NutriStem hPSC XF fraîchement préchauffé et changé quotidiennement.

Différenciation monocouche hPSC-RPE

Un protocole étape par étape décrivant le protocole de différenciation peut être trouvé à l’échange de Protocole36. hESC ou hiPSC ont été plaqués à une densité cellulaire de 2,4 × 104 cellules / cm2 sur des boîtes enrobées de laminine (20 µg /mL) en utilisant le milieu NutriStem hPSC XF. Un inhibiteur de Rho-kinase (Y-27632, Millipore) à une concentration de 10 µM a été ajouté pendant les 24 premières heures, tandis que les cellules étaient maintenues à 37 °C, 5% CO2 / 5% O2. Après 24 h, le milieu hPSC a été remplacé par un milieu de différenciation NutriStem hPSC XF sans facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) et facteur de croissance transformant -β (TGFß) (Industries biologiques) et les cellules ont été placées à 37 ° C, 5% CO2 / 21% O2. À partir du jour 6 après le placage, 100 ng / mL d’Activine A (systèmes R&D) ont été ajoutés au support. Les cellules étaient nourries trois fois par semaine et conservées pendant 30 jours. Les monocouches ont ensuite été trypsinisées à l’aide de TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) pendant 10 min à 37 °C, 5% de CO2. L’enzyme a été soigneusement éliminée et les cellules ont été collectées dans un milieu NutriStem hPSC XF frais préchauffé sans bFGF et TGFß par pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules ont été centrifugées à 300 × g pendant 4 min, le culot a été remis en suspension, passé à travers une passoire cellulaire (ø 40 µm, BD Biosciences), et les cellules ont été ensemencées sur des boîtes laminées (hrLN-111 et hrLN-521 à 20 mg / mL) à différentes densités cellulaires allant de 1,4 × 106 à 1,4 × 104 cellules / cm2. Les cellules replantées ont été nourries trois fois par semaine au cours des 30 jours suivants avec du milieu NutriStem hPSC XF sans bFGF et TGFß. Pour la différenciation in vitro hPSC-RPE dans la suspension 3D EBs, nous avons suivi notre protocole précédemment publié10. Brièvement, des cellules souches pluripotentes ont été cultivées jusqu’à confluence sur rhLN-521 et grattées manuellement pour produire des EBs à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 µL. Les EBs ont ensuite été cultivés en suspension dans des plaques de fixation basses (Corning) à une densité de 5-7 × 104 cellules/cm2. La différenciation a été effectuée sur un support NutriStem hESC XF sur mesure dans lequel bFGF et TGFß ont été éliminés avec un changement de support deux fois par semaine. Dix micromoles d’inhibiteur de Rho-kinase (Y-27632, Millipore) ont été ajoutés aux cultures en suspension uniquement pendant les 24 premières heures. Après 5 semaines de différenciation, des zones pigmentées ont été découpées mécaniquement des EBs à l’aide d’un scalpel. Les cellules ont ensuite été dissociées à l’aide de TrypLE Select, suivi d’un rinçage à l’aide d’une aiguille et d’une seringue de 20 G. Les cellules ont été ensemencées à travers une passoire cellulaire (ø 40 µm, BD Biosciences) sur des boîtes enrobées de LN à une densité cellulaire de 0.6-1,2 × 104 cellules / cm2 et nourris deux fois par semaine avec le même milieu de différenciation mentionné ci-dessus. Des images en champ lumineux ont été acquises avec un microscope Nikon Eclipse TE2000-S et un appareil photo Canon SX170 IS a été utilisé pour capturer la pigmentation du haut des puits.

PCR quantitative en temps réel

L’ARN total a été isolé à l’aide du kit RNeasy Plus Mini et traité avec de la DNase sans RNase (toutes deux de Qiagen). L’ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé à l’aide de 1 µg d’ARN total dans un mélange réactionnel de 20 µL, contenant des hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse Exposant III (Gibco, Invitrogen), selon les instructions du fabricant.

Cytométrie en flux

Le tri des cellules a été effectué sur des cultures hPSC-RPE après 21 ou 30 jours de différenciation. Les cellules ont été incubées avec les anticorps conjugués mentionnés sur de la glace pendant 30 min. Des contrôles FMO ont été inclus pour chaque condition afin d’identifier et d’identifier les cellules gate négatives et positives. Les cellules colorées ont ensuite été triées à l’aide d’un trieur de cellules à fusion BD FACS Aria (BD Biosciences) à l’aide du logiciel FACSDiva v8.0.1.

Juste après le tri, 70 000 cellules diluées dans 100 µL de FBS à 2% et d’EDTA (Sigma) de 1 mM ont été cytospinées pendant 5 min à 400 tr/min sur des lames de verre. Les lames ont été laissées sécher pendant une nuit à température ambiante, puis fixées avec du formaldéhyde sans méthanol à 4 % à température ambiante pendant 10 min et colorées par immunofluorescence.

Immunofluorescence

Histologie et immunomarquage tissulaire

Immédiatement après l’euthanasie par injection intraveineuse de 100 mg/kg de pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg /mL, Omnidea), les yeux ont été énucléés et la zone d’injection de bleb marquée avec un colorant vert de Marquage des tissus (TMD) (Produits Histolab). Une injection intravitréenne de solution de fixation à 100 µL (FS) constituée de formaldéhyde tamponné à 4% (Solvenco AB) a été réalisée avant fixation dans FS pendant 24-48 h, et incorporation dans de la paraffine. Des sections sérielles de quatre micromètres ont été produites à travers la zone marquée par le TMD et toutes les quatre sections ont été colorées avec de l’hématoxyline-éosine.

Pour l’immunocoloration, les lames ont été deparaffinisées dans du xylène, déshydratées dans des alcools gradués et rincées avec du ddH2O et une solution saline tamponnée Tris (SCT, pH 7,6). La récupération de l’antigène a été réalisée dans un tampon citrate de 10 mM (citrate trisodique dihydraté, Sigma-Aldrich, pH 6,0) avec du Tween-20 1: 2000 (Sigma-Aldrich) à 96 ° C pendant 30 min, suivi d’un refroidissement de 30 min à température ambiante. Les lames ont été lavées avec du SCT et bloquées pendant 30 min avec du sérum d’âne normal à 10% (Abcam) dilué dans du SCT contenant 5% (p/v) d’IgG et de l’albumine sérique bovine sans protéase (Jackson Immunoresearch) dans une chambre humidifiée. Des anticorps primaires dilués dans un tampon bloquant ont été incubés pendant une nuit à 4 °C : protéine d’appareil mitotique nucléaire humain (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) et CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone) (Données supplémentaires 2). Des anticorps secondaires (IgG anti-lapin d’âne (H+L) Alexa Fluor 555 A31572 et IgG anti-souris d’âne (H+L) Alexa Fluor 647 A31571, tous deux de Thermo Fisher Scientific) (Données supplémentaires 2) dilués au 1:200 dans du tampon bloquant ont été incubés 1 h à température ambiante. Les sections ont été montées avec Vectashield vectoriel avec du support de montage DAPI ((4′, 6-diamidino-2-phénylindole)) (Laboratoires Vectoriels) sous une lamelle de 24 × 50 mm2.

Pour l’immunohistochimie, les lames ont été deparaffinées, suivies d’une récupération d’antigène (solution ER2, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) et d’une coloration (Protocole IHC F) pour les anticorps CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) et CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone) (Données supplémentaires 2) sur l’instrument Bond RXm (Leica Biosystems ).

Les images ont été prises avec le microscope inversé à fluorescence Olympus IX81 ou le microscope confocal à balayage ponctuel Zeiss LSM710-NLO. L’analyse post-acquisition des images a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ.

Essai de phagocytose

Des POSS bovins marqués à l’isothiocyanate de fluorescéine ont été isolés et aimablement administrés par le Dr E.F. Nandrot de l’Institut de la Vision, Paris37. Les cellules hPSC-RPE ont été cultivées sur membrane transwell (0,33 cm2, Corning) enduite de hrLN-521 20 µg/mL pendant 1 mois après l’ensemencement. Les cellules ont été incubées à 37 °C ou 4 °C pendant 16 h avec un POS/Transwell décongelé 2,42 × 106 dilué dans du DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco) ou un milieu indépendant du CO2 (tous deux de Thermo Fisher Scientific), respectivement. Après incubation, les cellules ont été trempées avec une solution bleue de Trypan 0.2% (Gibco, Invitrogen) pendant 10 min à température ambiante, fixé avec du formaldéhyde sans méthanol à 4% (Polysciences) à température ambiante pendant 10 min, et perméabilisé avec du Triton X-100 à 0,3% dans du D-PBS pendant 15 min. La coloration de la phalloïdine à la rhodamine (1:1000, 20 min à température ambiante, Biotinum 00027) (Données supplémentaires 2) a été utilisée pour visualiser les limites cellulaires. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33342 (1:1000, 20 min à température ambiante, Invitrogène).

Les images ont été acquises avec le microscope confocal à balayage ponctuel Zeiss LSM710-NLO. L’analyse post-acquisition des images a été réalisée à l’aide d’Imaris (Bitplane) et les quantifications POS ont été effectuées avec le logiciel CellProfiler 2.1.1. Modules utilisés : LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages et ExportToSpreadsheet. Les objets ont été identifiés par un diamètre typique de 10 à 40 unités de pixels en utilisant deux classes, la méthode de seuillage de variance pondérée globale, Otsu, avec des limites inférieures et supérieures de 0,01 et 1,0 et un facteur de correction de 2,1, avec des objets groupés distingués par leur intensité.

Dosage immuno-enzymatique

Des cellules hPSC-RPE ont été cultivées sur des membranes Transwell (0,33 cm2, Millipore) enrobées de différents substrats. Les surnageants des côtés apical et basal du hPSC-RPE (c’est-à-dire les compartiments supérieur et inférieur du puits trans, respectivement) ont été collectés 60 h après le changement du milieu. Les niveaux de sécrétion de PEDF ont été mesurés en triplicats pour chaque condition avec des kits ELISA PEDF humains disponibles dans le commerce (BioVendor RD191114200R) ont été utilisés, conformément aux instructions du fabricant, après 60 jours de culture. Les lectures de densité optique ont été mesurées à l’aide du lecteur de microplaques SpectraMax 250 (Molecular Devices). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM.

Mesures TEER

Les cellules RPE de résistance électrique transépithéliale plaquées sur des puits transversaux (0,33 cm2, Millipore) ont été mesurées à l’aide du volt-ohmmètre du Système de résistance électrique Millicell (Millicell ERS-2, Millipore), conformément aux instructions du fabricant. Des cultures de soixante jours ont été équilibrées à l’extérieur de l’incubateur à température ambiante pendant 15 à 20 minutes avant l’expérience. Des mesures ont été effectuées dans des milieux de culture inchangés en trois exemplaires pour chaque condition, à trois positions différentes de chaque puits. Des moyennes ont été utilisées pour une analyse plus approfondie. La résistance de fond a été déterminée à partir d’un insert de culture vierge dans le même milieu recouvert du substrat correspondant mais sans cellules, et soustraite de la condition d’expérience respective. Les mesures sont rapportées sous forme de résistance en ohms multipliée par la surface en centimètres carrés (Ω × cm2). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM.

Microscopie électronique à balayage

Des cellules hPSC-EPR ont été cultivées sur des inserts transwell enrobés de LN521 (20 µg/mL) pendant 60 jours. Ils ont été fixés par immersion dans du glutaraldéhyde à 2,5% dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. La membrane transwell a été découpée et lavée dans de l’eau MilliQ avant déshydratation progressive de l’éthanol et séchage au point critique à l’aide de dioxyde de carbone (Leica EM CPD 030). Des inserts ont été montés sur des talons de spécimen à l’aide de languettes adhésives en carbone et de pulvérisateurs recouverts d’une fine couche de platine (Quorum Q150T ES). Des images en microscopie électronique à balayage ont été acquises à l’aide d’un microscope électronique à balayage à émission de champ Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Allemagne) à 3 kV et du détecteur SE2.

Microscopie électronique à transmission

Des cellules hPSC-EPR ont été cultivées sur des inserts transwell enrobés de LN521 (20 µg/mL) pendant 60 jours. Ils ont été fixés par immersion dans du glutaraldéhyde à 2,5% dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. La membrane transwell a été découpée et en fines lanières, rincée dans du tampon phosphate 0,1 M, suivie d’une post fixation dans du tétroxyde d’osmium à 2% dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4, à 4 °C pendant 2 h. Les bandes membranaires ont été soumises à une déshydratation progressive de l’éthanol et finalement noyées à plat dans le LX-112. Des coupes ultraminces (~50-60 nm) ont été préparées à l’aide d’un Leica EM UC7 et contrastées avec de l’acétate d’uranyle, suivi de citrate de plomb. L’imagerie par microscopie électronique à transmission a été réalisée sur un microscope électronique à transmission Hitachi HT7700 (Hitachi High-Technologies) fonctionnant à 80 kV et les images numériques ont été acquises à l’aide d’une caméra CCD Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions).

Analyse bioinformatique de séquençage d’ARN unicellulaire

Des cellules hPSC-RPE de soixante jours ont été dissociées à l’aide de TrypLE Select et passées à travers une passoire cellulaire (ø 40 µm, BD Biosciences). Ils ont été remis en suspension à une concentration de 1000 cellules/µL dans 0,04% de BSA dans du PBS. Les cellules ont été transportées à 4 °C jusqu’à l’Installation de Génomique unicellulaire Eucaryote (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Suède) où une bibliothèque d’ADNc 3′ a été préparée pour le séquençage d’ARN unicellulaire avec la plateforme de génomique 10x (Génomique 10x) à l’aide du logiciel NovaSeq 6000. Cell Ranger 2.1.Un pipeline 1 (10x Génomique) a été utilisé pour convertir les fichiers d’appel de base Illumina au format fastq, aligner les lectures de séquençage sur le transcriptome hg19 à l’aide du STAR aligner38 et générer des matrices de codes-barres. Des cellules filtrées par contrôle de qualité de Cell Ranger (718, 810, 931 et 1129 gouttelettes contenant des cellules ont été capturées pour des échantillons CD140b + GD2-, CD140b + CD184-, replés 1: 20 et hESC, respectivement) ont été analysées dans la version R 3.5.1 (équipe de base R) 39, en utilisant la version 2.3.440, 41 de la suite Seurat. Comme autre mesure de contrôle de la qualité, des cellules RPE avec des gènes exprimés de manière unique (≥2000 à ≤5000), des UMI (≥10 000 à ≤30 000) et un pourcentage de mappage UMI aux gènes MT (≥0,025 à ≤0,10) ont été sélectionnés. De même, hESC avec des gènes exprimés de manière unique (≥2000 à ≤8000), des UMI (≥10 000 à ≤80 000) et un pourcentage de mappage UMI sur les gènes MT (≥0,025 à ≤0,10). Cette étape de filtration a abouti à un ensemble de données final de 616, 725, 779 et 905 cellules pour les échantillons CD140b + GD2−, CD140b + CD184−, replés 1: 20 et hESC, respectivement. Avant la réduction de la dimensionnalité par analyse en composantes principales (PC), la variation cellulaire de l’expression génique entraînée par les UMI, l’expression génique mitochondriale et les étapes du cycle cellulaire ont régressé au cours du processus de mise à l’échelle des données42. Les gènes variables dans les échantillons d’EPR ont été sélectionnés en fonction de leur expression et de leur dispersion moyennes normalisées (seuil d’expression = 0,0125-5 et seuil de dispersion inférieure = 0,5). Pour la sélection de PC, les résultats de PCHeatmap, de jackStraw, d’écarts types de PC et d’analyse de Clustree ont été évalués43. Les 15 premiers PC ont été utilisés pour la projection tsne44 et l’analyse de clustering (résolution = 0,1, perplexité = 40).

Les amas de cellules ont été analysés par deux approches. Les gènes différentiels supérieurs ont d’abord été identifiés pour chaque groupe en utilisant le test de somme de rang de Wilcoxon. L’expression des gènes signatures secondaires (scores des modules) a été calculée pour les CSEH indifférenciés et plusieurs types cellulaires présents dans la rétine humaine. Les cellules exprimant les marqueurs du mésoderme ont été subdivisées manuellement dans un cluster séparé à l’aide des fonctions de traçage interactif de Seurat. Les données sont téléchargées dans ArrayExpress (EMBL-EBI) — voir les détails ci-dessous.

Animaux

Après approbation par le Comité d’éthique de l’expérimentation Animale du Nord de Stockholm (DNR N25/14), 10 lapins albinos blancs de Nouvelle-Zélande (fournis par Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Suède) âgés de 5 mois et pesant de 3,5 à 4,0 kg ont été utilisés dans cette étude. Toutes les expériences ont été menées conformément à la Déclaration pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

Transplantation sous-rétinienne

Les monocouches hPSC-RPE ont été lavées avec du PBS, incubées avec du TrypLE et dissociées en suspension unicellulaire. Des cellules ont été dénombrées dans une chambre d’hémocytomètre de Neubauer en utilisant du bleu de Trypan à 0,4% (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugées à 300 × g pendant 4 min, et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du PBS fraîchement stérilisé par filtre à une concentration finale de 1000 cellules / µL. La suspension cellulaire a ensuite été aliquotée aseptiquement en unités de 600 µL et maintenue sur la glace jusqu’à la chirurgie.

Les animaux ont été placés sous anesthésie générale par administration intramusculaire de 35 mg / kg de kétamine (Kétaminol, 100 mg /mL, Intervet) et de 5 mg/ kg de xylazine (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), et les pupilles ont été dilatées avec un mélange de 0,75 % de cyclopentolate / 2,5% de phényléphrine (APL). Des microchirurgies ont été réalisées sur les deux yeux à l’aide d’une technique transvitréenne pars plana à 2 ports de 25 G (Alcon Accurus, Alcon Nordic) telle que décrite précédemment 45. La suspension cellulaire a été aspirée dans une seringue de 1 mL reliée à un tube d’extension et à une canule polytip de 38 G (MedOne Surgical Inc). Sans vitrectomie préalable, la canule a été insérée à travers le trocart temporal supérieur. Après un positionnement correct de la pointe, constaté par une éruption rétinienne focale, 50 µL de suspension cellulaire (équivalent à 50 000 cellules) ont été injectés lentement sous-rétinienne ~ 6 mm sous la marge inférieure de la tête du nerf optique, formant un bléb uniforme clairement visible au microscope opératoire. On a pris soin de maintenir la pointe à l’intérieur du bleb pendant l’injection afin de minimiser le reflux. Après le retrait de l’instrument, une légère pression a été appliquée sur les sclérotomies sans suture auto-obturantes. Deux microgrammes (100 µL) de triamcinolone intravitréenne (Triescence, Alcon Nordic) ont été administrés 1 semaine avant la chirurgie et aucun antibiotique post-chirurgical n’a été administré.

Statistiques et reproductibilité

Pour les analyses statistiques, une analyse bidirectionnelle de la variance et des comparaisons multiples post hoc à l’aide de la correction de test de Tukey ont été effectuées pour évaluer les différences in vitro des différentes densités évaluées et le tri par rapport aux conditions répétées dans les tests de sécrétion TEER et PEDF.

Toutes les quantifications ont été effectuées à l’aveugle. Paramètres statistiques, y compris les définitions et la valeur exacte de n (par exemple, nombre total d’expériences, réplications, etc.), les écarts, les valeurs de P et les types de tests statistiques sont rapportés dans les figures, les légendes de figures correspondantes et dans cette section. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de Prism 7 (logiciel GraphPad, version 7.0c). Dans tous les cas, une analyse statistique a été effectuée sur les données d’au moins trois réplicats expérimentaux biologiquement indépendants. Des comparaisons entre les groupes ont été planifiées avant les tests statistiques et les tailles d’effets cibles n’étaient pas prédéterminées. Les barres d’erreur affichées sur les graphiques représentent la moyenne ± SEM d’au moins trois expériences indépendantes. Toutes les micrographies montrées sont des images représentatives de trois expériences indépendantes, sauf indication contraire (par exemple, Fig. 1c).

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le Résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.