Contribution de Paul Barber
Extraction d’ADN via Chelex
Chelex est réputé pour être aussi volage que bon marché et facile. Voici quelques conseils pour de bonnes amplifications: 1. Parfois, les échantillonstravaillent mieux s’ils sont utilisés immédiatement, parfois il est préférable d’attendre une nuit avant de les utiliser. Expérimentez et trouvez ce qui fonctionne pour votre espèce. Les résultats peuvent varier selon les taxons.2. Lorsque vous effectuez des PCR initiales, effectuez une dilution en série du gabarit.La quantité d’une extraction d’ADN Chelex utilisée dans une PCR peut être aussi élevée que la moitié du volume de la PCR ou aussi faible que 1 microlitre d’une dilution 1: 10 000. Je trouve que 1 microlitre d’un 1: 1 est bon pour la plupart des applications.3. Si vous n’obtenez pas d’amplifications de votre PCR la première fois avec un extrait de Chelex, répétez la procédure vortex, spin, incuber, vortex, spin, assis pendant la nuit décrite ci-dessus. Souvent, cela fera fonctionner une PCR négative.
Méthode¶
- Avec de l’eau de Javel, stériliser une spatule à réactif sec et une petite barre d’agitation magnétique.
- Préparer une suspension de 5 à 10% en poids de résine Chelex100 (partie Biorad 143- 3832,100-200 maille Chelex, forme sodique) et eau HPLC stérilisée aux UV. Le moyen le plus efficace de le faire est de prendre un tube falcon stérile de 50 ml, de le placer sur une balance à l’intérieur d’un petit bécher et de le mettre à zéro. Ajoutez ensuite 5 grammes de Chelex et remplissez à 50 ml d’eau.
La précision n’est pas critique. La technique stérile est.
- Placer l’agitateur stérile dans le tube et le placer sur l’agitateur magnétique. Chelex se dépose rapidement donc si la suspension n’est pas bien mélangée, vos concentrations et résultats seront variables. En maintenant la suspension bien mélangée, ajoutez 300 à 500 litres d’aliquote dans des tubes eppendorf de 0,6 ou 1,6 ml (encore une fois stériles) et coiffez immédiatement. Si vous avez accès à une hotte à flux laminaire, c’est un bon endroit pour faire tout cela. Vous voudrez peut-être essuyer la balance et l’agitateur avec une solution d’eau de Javel à 10% et / ou stériliser aux UV avant utilisation.
- Allumez le bloc chauffant. Régler à 95°C. Remplir les trous d’eau.
- À l’aide d’une pince stérile (plusieurs fois au-dessus du brûleur à alcool pour stériliser), retirez un petit morceau de tissu de votre échantillon. Ce morceau de tissu doit être assez grand pour être visible, mais pas assez grand pour être facilement visible. Imaginez couper une section de 0,2 mm d’une agrafe standard. C’est très gros. Une trop grande quantité de tissu peut inhiber vos réactions.
Stériliser les pinces entre les échantillons.
- Une fois terminé, effectuez un contrôle négatif du Chelex en plongeant votre pince stérilisée dans un tube de suspension de Chelex.
- Échantillon de vortex et suspension de chelex pendant 10-15 secondes.
Assurez-vous que les couvercles sont bien serrés avant de commencer.
- Essorez brièvement des échantillons à grande vitesse dans une microcentrifugeuse
- Incuber les échantillons pendant 20 minutes à 95°C
* La température du bloc peut légèrement baisser lors de cette étape. Cette goutte est normale. Vérifiez les tubes pendant l’incubation pour vous assurer que les couvercles ne se sont pas détachés.*
- Échantillonne à nouveau le Vortex pendant 10 à 15 secondes.
Car la vapeur peut éclater le couvercle du tube à centrifuger. Maintenez les couvercles enfoncés.
- Essorez à nouveau les tubes à grande vitesse dans la microcentrifugeuse.Les échantillons
- sont prêts à l’emploi.
Utilisez uniquement du surnageant pour les réactions de PCR. La perle Chlex inactive le Taq !
Cette méthode est basée, avec autorisation, sur un protocole original disponible ici.
