Résumé

Contexte. L’expression de la CD133 humaine (prominine-1 humaine) dans les cellules cancéreuses a été postulée comme un marqueur de la tige et est considérée comme un marqueur présumé des cellules souches cancéreuses (CSC). Nous avons conçu une étude pour décrire le modèle d’expression de CD133 dans la peau normale et dans les néoplasmes cutanés épithéliaux. Méthode. L’expression immunohistochimique CD133 de quarante-trois tumeurs eccrines et apocrines a été comparée à celle observée dans d’autres tumeurs épithéliales de la peau. De plus, la cytométrie en flux a été utilisée pour détecter l’expression de CD133 de quatre néoplasmes cutanés épithéliaux, dont un porocarcinome. Résultat. Une immunoréactivité CD133 à la surface apicale ou apicolatérale des cellules formant des structures glandulaires a été observée. Les cellules des zones solides de tumeurs bénignes ou malignes n’étaient pas colorées. Les cellules de culture dérivées du porocarcinome ont montré 22% de cellules CD133 positives en cytométrie de flux, tandis que les cultures de carcinome épidermoïde en contenaient moins de 0,1%. Conclusion. Ces observations indiquent que CD133 est un marqueur spécifique de la différenciation glandulaire qui pourrait être inclus dans le panel de diagnostic des tumeurs cutanées avec une éventuelle différenciation eccrine ou apocrine. Cependant, l’utilisation de l’expression du CD133 comme marqueur des CSC doit être interprétée avec prudence dans les expériences sur la peau.

1. Introduction

Au cours des dernières années, un nombre croissant de preuves ont été rapportées soutenant l’idée que la capacité de soutenir la formation et la croissance tumorales réside exclusivement dans une petite population de cellules appelées cellules souches cancéreuses (CSC). La recherche de marqueurs qui démontrent le phénotype de type cellule souche de ces cellules initiatrices de tumeurs est un champ d’investigation actif, et plusieurs marqueurs de cellules souches ont été décrits récemment dans des tumeurs cutanées.

CD133 est l’homologue humain de la prominine-1 de souris, une glycoprotéine de surface cellulaire à cinq domaines transmembranaires qui a fait l’objet d’une attention particulière en raison de son expression limitée à diverses sous-populations de cellules souches somatiques. Cet antigène de surface a été découvert comme cible d’un anticorps monoclonal défini comme Mab AC133, un marqueur exprimé par une sous-population de cellules souches hématopoïétiques CD34 positives dérivées du foie fœtal humain et de la moelle osseuse. Par la suite, le CD133 a été détecté dans différents tissus humains normaux, y compris les reins, la prostate, le cerveau et le pancréas, et s’est avéré spécifiquement associé à des microvillosités et à d’autres protubérances de la membrane plasmique. De plus, cet antigène a également été identifié dans des tumeurs malignes hématologiques et dans plusieurs néoplasmes humains solides, notamment des tumeurs gliales, un carcinome de la prostate, un carcinome du rein, un hépatocarcinome, un carcinome colorectal et un mélanome malin. Le but de plusieurs de ces études était de déterminer l’existence de CSCs, définis comme un petit groupe de cellules cancéreuses qui ont la capacité d’auto-renouvellement, d’initiation tumorale et de maintien de la croissance tumorale. Les anticorps couramment utilisés pour la purification des cellules AC133 positives ciblent des épitopes glycosylés mal caractérisés de spécificité incertaine. Bien que l’activité fonctionnelle de CD133 soit encore controversée et que sa fonction physiologique ne soit pas encore déterminée, il devient clair que cette protéine de surface cellulaire est un marqueur unique des protubérances de la membrane plasmique et des microdomaines membranaires. Il a été suggéré que dans cette localisation cellulaire CD133 puisse agir comme régulateur de la composition lipidique membranaire ou qu’il puisse participer aux mécanismes de polarité et de migration cellulaires.

Dans des études antérieures qui rapportaient la coloration immunohistochimique de CD133 des épithéliums glandulaires humains, tels que les glandes salivaires, les glandes lacrymales, les canaux pancréatiques, les glandes endocervicales et les glandes sudoripares, un schéma particulier d’expression de CD133 a été décrit. Dans ces épithéliums, CD133 s’est avéré localisé aux protubérances de la membrane plasmique au niveau des zones apicales des cellules polarisées. Un schéma similaire de coloration cytoplasmique apicale CD133 des cellules entourant une lumière a également été observé dans les carcinomes de l’ovaire, du côlon ou du pancréas.

La découverte de la coloration des cellules des glandes sudoripares par l’anticorps CD133 nous a incités à concevoir une étude que nous rapportons maintenant, afin d’évaluer l’expression de CD133 dans les tumeurs eccrines et apocrines cutanées.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Cas

Une recherche rétrospective a extrait 43 tumeurs cutanées eccrines et annexales apocrines précédemment diagnostiquées des fichiers du Département de pathologie de l’Hôpital Universitaire d’Albacete. Des lames de verre, des blocs de paraffine et des rapports histopathologiques de tous les cas ont été obtenus. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Des cas de carcinome basocellulaire () et de carcinome épidermoïde () ont également été inclus dans cette étude afin de comparer les résultats obtenus dans ces néoplasmes avec ceux obtenus dans les tumeurs des glandes sudoripares. Pour évaluer l’expression du CD133 dans une peau normale, nous avons analysé la peau de différentes zones obtenues à partir des marges de six tumeurs réséquées chirurgicalement de la peau et de trois autopsies.

Pour la culture de cellules cancéreuses de la peau, sept échantillons de tumeurs de la peau humaine correspondant à un porocarcinome eccrine et à six carcinomes épidermoïdes ont été obtenus. Des tissus frais provenant de ces cas ont été inclus dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), additionné de pénicilline/streptomycine et de fungizone, immédiatement après la résection chirurgicale.

2.2. Immunohistochimie

Des sections de tissu fixées au formol et incrustées de paraffine de 4 µm de large ont été découpées, déparaffinées dans du xylène et réhydratées dans une série graduée d’éthanol. L’activité de la peroxydase endogène a été bloquée par 3% d’H2O2 pendant 5 minutes. Les lames ont été traitées avec une récupération d’épitope induite par la chaleur et immunostées avec trois anticorps monoclonaux anti-CD133 différents: Anticorps monoclonal AC133, anticorps monoclonal 293C3 et anticorps monoclonal AC141 (tous de Miltenyi Biotec, Allemagne). Les anticorps ont été testés à différentes dilutions et périodes d’incubation. La détection du CD133 a été effectuée en utilisant le système EnVision-HRP (Dako, Glostrup, Danemark) dans une plate-forme d’Autostainer de DakoCytomation, conformément aux instructions du fabricant. La diaminobenzidine (DAB substrat system, Dako, Glostrup, Danemark) a été utilisée comme chromogène. Parmi les trois anticorps anti-CD133 différents testés, un seul, l’anticorps monoclonal AC133, a fonctionné dans la paraffine. Les deux autres anticorps testés ont échoué parce que les coupes incubées avec ces anticorps ne présentaient aucune coloration ou parce que l’immunocoloration observée lorsque des concentrations élevées des anticorps étaient utilisées était considérée comme non spécifique (une coloration similaire a été observée chez les témoins négatifs). L’anticorps monoclonal AC133 a donné des résultats fiables sur les sections noyées de paraffine testées. Nous établissons pour cet anticorps une dilution 1:10 et 40 minutes d’incubation à température ambiante comme conditions de travail privilégiées. Par la suite, toutes les expériences ont été effectuées dans ces conditions.

Des sections de peau avec des glandes sudoripares normales ont été utilisées comme témoins positifs. De plus, lorsqu’elles sont présentes dans les sections, des glandes sudoripares normales de la peau adjacente aux néoplasmes ont été utilisées comme contrôles positifs internes. Des contrôles négatifs ont été réalisés en omettant l’anticorps anti-CD133 pendant l’incubation de l’anticorps primaire.

La coloration immunohistochimique des zones solides et des structures acineuses ou canalaires des tumeurs a été évaluée séparément. La coloration au CD133 a été graduée à l’aide d’une échelle semi-quantitative. Les structures acinaires ou canalaires ont été évaluées comme suit: (-) aucune coloration; (+) coloration du matériel sécrétoire dans la lumière des conduits isolés ou des acini et / ou coloration faible de la bordure apicale ou luminale de quelques conduits ou acini; (++) coloration claire de la bordure apicale ou luminale de la plupart des conduits ou des acini présents dans la tumeur; (+ ++) coloration de la bordure apicale ou luminale de tous les conduits ou acini présents dans la tumeur. L’expression du CD133 a été évaluée par deux pathologistes principaux (EP et SYNC) en aveugle, sans connaissance des informations cliniques et pathologiques. En cas d’évaluations divergentes, les lames ont été réévaluées par les deux pathologistes au microscope multi-têtes et un accord a été obtenu.

2.3. La culture de Cellules cancéreuses provenant de Tumeurs cutanées

Des fragments tumoraux ont été désagrégés mécaniquement et enzymatiquement par digestion avec de la collagénase de type IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C pendant 2 heures. Les cellules ont été filtrées à travers une maille de nylon de 40 µm et ont été dissociées par passage en série à travers des pipettes sérologiques. Le tissu digéré a été centrifugé à 1000 × g pendant 10 min et le culot lavé plusieurs fois pour obtenir une suspension unicellulaire. Des cellules isolées ont été plaquées dans des flacons de culture et cultivées à 37 °C dans des milieux DMEM/F12 contenant 10% de sérum fœtal bovin et complétées par de la pénicilline/streptomycine et de la fungizone.

2.4. Analyse de cytométrie en flux

Toutes les expériences ont été réalisées sur des suspensions cellulaires préparées au premier passage de culture primaire à partir de tumeurs. Les cellules ont été détachées à l’aide d’EDTA à 0,02% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 15 min à 37 °C et lavées avec du PBS avant coloration. Les suspensions cellulaires ont été ajustées à cellules/mL et incubées avec la dilution d’anticorps recommandée (1/10) pendant 20 min à l’obscurité (4°C). Des échantillons sans anticorps primaire ont été utilisés comme témoins négatifs. L’anticorps utilisé était l’anti-CD133/1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Les anticorps non liés ont été éliminés par lavage au PBS et les cellules ont été remises en suspension dans un volume de tampon approprié. L’analyse a été réalisée sur un cytomètre en flux LSRII (BD Biosciences). Les données ont été analysées à l’aide de Summit V5.0.1. logiciel 5170 (Dako).

3. Résultats

3.1. Résultats cliniques

La cohorte de patients était composée de 29 hommes et 23 femmes, âgés de 24 à 90 ans (médiane, 49 ans). Le site de présentation était variable, la plupart localisés sur la région de la tête et du cou. Les données cliniques sont résumées dans le tableau 1. Tous les patients ont subi une biopsie cutanée excisionnelle.

3.2. Résultats immunohistochimiques

À partir des trois anticorps monoclonaux différents testés sur des coupes tissulaires fixées au formol et incorporées à la paraffine, et conformément aux rapports précédents, seul l’AC133 a donné des résultats sensibles et fiables. Le schéma de coloration immunohistochimique global observé avec cet anticorps était étroitement lié à l’architecture tissulaire. La coloration était principalement localisée à la surface apicale des cellules qui formaient des structures canalaires ou glandulaires. Les résultats immunohistochimiques observés dans ces structures à l’aide de l’anticorps anti-CD133 sont résumés dans le tableau 1 et sont décrits ci-après. Les zones solides de l’une des tumeurs annexielles examinées ou des carcinomes basocellulaires et épidermoïdes testés n’ont pas démontré la positivité du CD133.

3.2.1. L’expression du CD133 dans les tissus normaux

a été observée à la surface endoluminale ou apicale des cellules des canaux acini et terminaux des glandes eccrines normales (Figure 1(a)). Les canalicules intercellulaires formés au niveau de la membrane latérale des cellules eccrines situées dans la partie sécrétoire des glandes sudoripares normales étaient clairement colorés (Figure 1 (b)), ainsi que la sécrétion trouvée dans la lumière des canaux eccrines. Une coloration des glandes apocrines normales au niveau des conduits terminaux a été observée à la bordure apicale des cellules, bien qu’avec une distribution inégale. Dans les zones acineuses de ces glandes, où la sécrétion de décapitation apocrine était évidente, CD133 ne présentait qu’une coloration faible ou négative.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.2.2. Tumeurs

CD133 n’a été exprimé dans aucun des carcinomes épidermoïdes ou basocellulaires testés. En utilisant l’anticorps AC133, les tumeurs annexes analysées dans ce travail ont montré le schéma de coloration suivant (résumé dans le tableau 1).

Tumeurs bénignes avec Différenciation Eccrine ou Apocrine. Tous les cas de spiradénome eccrine présentaient une immunoréactivité au CD133 au niveau de la membrane apicale des structures en forme de conduit présentes dans les nodules tumoraux. La surface luminale des cellules épithéliales formant les kystes uniloculaires de tous les cas d’hidrocystome eccrine analysés était également positive. Les conduits et les petits kystes présents dans trois des six cas de porome eccrine ont montré une coloration intense de la couche cellulaire interne des tubules proliférés, et cette coloration était située à la bordure endoluminale des cellules. Les trois autres cas de porome analysés présentaient le même schéma de coloration dans la plupart des tubules, mais avec un schéma de coloration (++) ou (+) de positivité CD133. Des structures en forme de conduit, présentes dans les quatre cas de cylindromes, ont également montré une immunoréactivité au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. La coloration des quatre syringomes chondroïdes était importante, et tous les conduits présents, qui formaient des structures ramifiées occasionnelles, montraient une positivité intense au niveau de la membrane apicale (Figure 2). Les canaux dilatés et tortueux, qui mènent dans les espaces kystiques de tous les cas de syringocystoadénome papillifère, ont montré une immunoréactivité au niveau de la partie apicale des cellules épithéliales ou à la surface luminale des kystes, avec une intensité allant de (++) à (+++) (Figure 3). Les cinq cas diagnostiqués comme un hidradénome nodulaire présentaient des structures isolées en forme de conduit positives pour le CD133 avec une coloration apicale des cellules formant les tubules (Figure 4) dont l’intensité variait de (++) à (+++). Les deux cas d’hidradenoma papilliferum ont également montré une expression de CD133 au niveau de la partie apicale des structures glandulaires. Seuls deux des six cas de syringome testés présentaient une coloration cohérente à la surface luminale des petits canaux qui formaient les tumeurs, qui étaient généralement tapissées de deux couches de cellules épithéliales cubiques. Les cas d’hidrocystome apocrinien n’ont pas démontré d’immunoréactivité positive.

Figure 2

CD133 positivité à la surface interne des tubules de branchement du syringome chondroïdien. Aucune coloration des cellules stromales ou des cellules épithéliales externes n’est notée.

Figure 3

Les projections papillaires du syringocystadénome papillifère tapissé d’épithélium colonnaire pseudostratifié sont CD133 positives. La positivité est très intense à la surface endoluminale.

Figure 4

Coloration CD133 linéaire des cellules colonnaires tapissant les tubules d’un cas d’hidradénome. Seules les cellules situées à la surface interne des tubules sont colorées.

Tumeurs malignes avec Différenciation Eccrine ou Apocrine. Aucune immunoréactivité n’a pu être démontrée à la surface luminale des kystes du cas diagnostiqué comme un carcinome apocrinien. Les deux carcinomes annexiens microcystiques analysés dans cette étude ont montré une forte positivité du CD133 à la surface apicale des cellules qui formaient la petite et la grande lumina des structures tubulaires. L’immunocoloration du CD133 a pu être démontrée au niveau des cellules très atypiques qui entouraient les structures tubulaires du cas de porocarcinome (Figure 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Caractérisation de Cultures Primaires à partir de Tumeurs de la Peau Humaine et Analyse de cytométrie en flux

Sept échantillons dérivés de tumeurs de la peau humaine ont été traités dans le but d’obtenir des suspensions unicellulaires. En raison d’un nombre insuffisant de cellules obtenues à partir des tumeurs ou d’une contamination fongique ou bactérienne, seuls quatre échantillons ont été cultivés avec succès et analysés pour l’expression de l’épitope CD133/ 1 à la surface cellulaire. Ces biopsies cultivées avec succès comprennent un porocarcinome eccrine et trois carcinomes épidermoïdes. L’examen microscopique des cellules cultivées a révélé différentes morphologies qui variaient de manière cohérente selon le type de tumeur histologique. Les cellules du carcinome épidermoïde présentaient une apparence épithélioïde ou fuselée, tandis que les cellules dérivées du porocarcinome eccrine avaient une forme plus arrondie et se regroupaient en îlots de cellules petites et atypiques. La présence de cellules épithéliales dans ces cultures a été confirmée par l’expression positive de l’E-cadhérine et de l’EpCam en tant que marqueurs épithéliaux.

Pour déterminer si les cultures de cellules tumorales cutanées contenaient une population de cellules CD133 positives, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour examiner l’expression du marqueur de surface CD133/1 avec l’anticorps AC133. Tous les échantillons de carcinome épidermoïde contenaient moins de 0,1% de cellules positives, tandis que près de 22% de cellules positives ont été détectées dans le porocarcinome eccrine. La figure 6 montre des histogrammes représentatifs des deux types de tumeurs cutanées évalués.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Le carcinome épidermoïde présente une coloration négative pour les cellules CD133 et 0% de cellules CD133 positives en cytométrie de flux.

4. Discussion

Les progrès de la biologie des cellules souches cutanées et de la compréhension de la carcinogenèse dépendent fortement de la disponibilité de marqueurs spécifiques pour des populations de cellules souches distinctes. Des marqueurs connus de cellules souches cutanées ou de cellules souches identifiées dans d’autres organes ou tumeurs peuvent être utilisés pour la détection des CSC cutanés. L’un de ces marqueurs qui peut être testé dans la peau est la protéine CD133 (prominine-1). Les premières données faisant état de l’expression de CD133 à l’aide de l’anticorps monoclonal AC133, produit contre un nouvel antigène de glycoprotéine de cellules souches, ont montré que CD133 était exprimé sélectivement sur des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34 dérivées du foie et de la moelle osseuse fœtales humaines, ainsi que du sang. Depuis lors, plusieurs rapports ont montré que la prominine-1 peut être utilisée pour identifier et isoler les cellules souches humaines de diverses sources, y compris le système hématopoïétique, la prostate, le pancréas ou le rein. De plus, des anticorps monoclonaux contre CD133 ont été utilisés pour l’identification et l’isolement d’une population présumée de cellules initiatrices de tumeurs ou CSCs dans un certain nombre de carcinomes humains et de mélanomes malins. Dans le gliome, le nombre accru de cellules cancéreuses CD133 positives, ainsi que la présence d’amas de ces cellules, ont été proposés comme facteur pronostique significatif, indépendant d’autres facteurs tels que le grade tumoral. Cependant, d’autres études, utilisant des clones anti-CD133 différents et nouveaux, ont suggéré que l’expression de CD133 ne se limite pas aux cellules souches et progénitrices et semble être exprimée dans les cellules épithéliales adultes des tissus de souris et humains. Par exemple, en utilisant un clone CD133, appelé 13A4, dérivé de la souris prominin-1, Weigmann et al. expression démontrée de la proéminine-1 à la surface apicale des cellules neuroépithéliales et des tubules proximaux rénaux adultes, et Karbanová et al. , en utilisant un anticorps monoclonal (80B258) généré contre un polypeptide prominine-1 humain, immunoréactivité observée dans les tissus humains adultes, en particulier dans les épithéliums glandulaires. Ces résultats indiquent la nécessité d’études supplémentaires pour clarifier si l’antigène AC133, précédemment trouvé en cytométrie de flux pour être limité aux cellules progénitrices positives CD34, est exprimé dans les cellules épithéliales adultes. Il a été suggéré que l’expression variable de CD133 observée est liée à l’affinité différentielle des divers anticorps contre diverses formes glycosylées de CD133. L’anticorps monoclonal AC133 reconnaît un épitope glycosylé de la proéminine-1 et, fait intéressant, la glycosylation de cette protéine peut changer en fonction de l’état de différenciation cellulaire, ou elle peut être modifiée au cours du processus de transformation maligne. Dans notre étude sur les tumeurs de la peau humaine, nous avons observé que l’expression de CD133 dépend grandement de la formation de conduits des glandes sudoripares et de la sécrétion des glandes sudoripares. L’immunoréactivité au CD133 a été principalement observée à la surface apicale / endoluminale des structures en forme de conduit ou des kystes de la plupart des tumeurs eccrines bénignes et malignes. Aucune des tumeurs étudiées, ni bénignes ni malignes, ne présentait d’amas isolés ou de petites cellules néoplasiques positives CD133 dans des zones solides. Un schéma similaire de coloration CD133 de la membrane cellulaire apicale des cellules sécrétrices a déjà été rapporté dans des structures tubulaires normales telles que les tubules proximaux du rein ou dans les glandes tumorales du cancer colorectal. Une coloration au CD133 a également été observée à la surface apicale / endoluminale des cellules formant une lumière dans les carcinomes ovariens. Dans ces cas, la localisation apicale de CD133 a été impliquée dans une fonction sécrétoire possible de cette molécule. La distribution morphologique de la coloration CD133 démontre une corrélation avec des structures sécrétoires bien reconnues des tissus et des glandes normaux, suggérant une relation fonctionnelle de CD133 avec la sécrétion. En fait, dans notre étude, les tumeurs soupçonnées d’être originaires des zones canalaires des glandes sudoripares, comme les syringomes, ont montré un schéma de coloration moins intense que celles provenant des parties acineuses.

L’expression de CD133 à la surface cellulaire de cellules tumorales différenciées est un argument contre CD133 en tant que marqueur spécifique de cellules souches cancéreuses dans la peau. Cependant, l’existence d’une petite population de CSC CD133 + ne peut pas être complètement exclue, comme cela a été démontré dans d’autres organes, où CD133 est exprimé à la surface cellulaire des deux, des CSC et des cellules tumorales différenciées.

Ensemble, nos résultats démontrent une expression immunohistochimique spécifique de l’anticorps AC133 à la surface sécrétoire des cellules normales et néoplasiques différenciées des glandes eccrines. Les expériences qui utilisent cet anticorps comme marqueur des CSC dans la peau doivent être interprétées avec prudence. L’anticorps AC133 est un marqueur sensible et spécifique de la différenciation glandulaire cutanée, utile pour le diagnostic de tumeurs avec une éventuelle différenciation eccrine ou apocrine.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à Pedro Javier Benito Castellanos et à Laura Abendaño pour leur soutien technique.