Résultats

Modulation des niveaux cellulaires de p107 par Protéolyse contrôlée. Nous avons précédemment montré que la p107 endogène, membre de la famille des protéines RB, qui n’est pas un substrat naturel de SCFßTrCP, peut être éliminée dans les cellules de carcinome cervical C33A par l’expression ectopique d’une ligase chimérique de protéine ubiquitine ßTrCP (ßTrCP–E7N) qui porte un peptide de liaison à la p107 dérivé des résidus N-terminaux 35-aa de l’oncoprotéine HPV, E7 (E7N) (1). Cependant, les fonctions de nombreuses protéines cellulaires sont dictées par leur abondance intracellulaire, et pas simplement par leur présence ou leur absence. Jusqu’à présent, il n’existe pas de méthode fiable pour moduler précisément les niveaux de protéines intracellulaires dans les cellules de mammifères.

Nous avons d’abord cherché à savoir si les taux de p107 pouvaient être systématiquement réduits par l’expression contrôlée de différentes quantités de ßTrCP-E7N. Les cellules de carcinome cervical C33A humaines ont été infectées par des doses croissantes d’adénovirus recombinant porteur de ßTrCP-E7N ou de l’adénovirus témoin pendant 24 h. L’infection était de 100%, même à la dose la plus faible utilisée, comme en témoigne l’expression de la GFP portée par l’adénovirus dans toutes les cellules receveuses (données non montrées). Comme le montre la Fig. 1 (Supérieur), les niveaux endogènes de p107 ont été systématiquement réduits à 78%, 25% et 5% des niveaux à l’état d’équilibre lorsque des cellules C33A ont été transduites avec un adénovirus ßTrCP-E7N recombinant à des mois de 10, 35 et 80, mais pas les mêmes doses de virus témoin Ad1. Par conséquent, le SCFßTrCP-BP conçu offre un moyen simple et reproductible de réduire les quantités globales de protéines cibles à des niveaux définis pour le dosage des effets posologiques sur les activités biologiques.

P107 s’associe de manière stable à la cycline A et au Cdk2 à travers un site de liaison à haute affinité dans les cellules en prolifération (13-15). Pour examiner si ces protéines associées à la p107 sont également soumises à une dégradation ciblée par ßTrCP-E7N, un immunoblot a été réalisé dans des cellules C33A infectées par le virus Ad-F-TrCP-E7N. Comme le montre la Fig. 1, les niveaux endogènes de cycline A et de Cdk2 sont restés inchangés, tandis que p107 a été considérablement régulé à la baisse. De plus, les taux de β-actine non ciblée n’ont pas été affectés par le F-TrCP-E7N (Fig. 1). Ce résultat a fourni des preuves solides que la ligase ubiquitine-protéine ßTrCP–E7N modifiée dégrade spécifiquement le substrat ciblé p107, mais pas les protéines associées.

Dégradation sélective d’une Sous-Population Spécifique de Protéines Cibles Modifiée Post-traductionnellement. La modification d’une protéine cellulaire au niveau post-traductionnel, telle que la phosphorylation, est un moyen fondamental que les cellules utilisent pour réguler la fonction ou conférer de nouvelles activités à la protéine. Les outils expérimentaux pour disséquer la fonction associée à un événement de modification posttranslationnelle spécifique sont actuellement limités. Parce que protein knockout fonctionne au niveau posttranslationnel qui reconnaît directement les protéines cibles, une application consiste à concevoir un E3 spécifique capable de sélectionner une sous-population de protéines modifiées posttranslationnellement pour la dégradation, au lieu de détruire la population entière.

Le HPV16 E7 se lie sélectivement à la forme hypophosphorylée de RB(16). Nous avons étudié si la ligase chimérique de la protéine ubiquitine ßTrCP-E7N pouvait distinguer le RB hypo et hyperphosphorylé et sélectionner uniquement l’hypoforme pour la dégradation. Les cellules humaines de l’ostéosarcome U2OS expriment les deux formes de RB qui peuvent être facilement identifiées, en fonction de leur mobilité électrophorétique différente sur SDS/PAGE (Fig. 2A, voie 1) (17). L’identité de ces deux espèces de RB a également été vérifiée par immunoblotage à l’aide d’anticorps spécifiques des formes hypo ou hyperphosphorylées de RB (Fig. 2A, voies 2 et 3). Les cellules U2OS ont été infectées par l’Ad-F-TrCP-E7N recombinant ou les adénovirus témoins Ad1 pendant 48 h, et les taux à l’état d’équilibre de RB-P et de RB ont été analysés simultanément par Western blot, à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-RB qui reconnaît les deux formes. Conformément à la liaison préférentielle de E7N au RB hypophosphorylé, l’expression ectopique du F-TrCP-E7N a entraîné l’élimination du RB hypophosphorylé, alors que le RB-P hyperphosphorylé a été laissé intact (Fig. 2B En haut, comparez les voies 4-6 avec les voies 1-3). Ce résultat met en évidence la capacité de l’ubiquitine-protéine ligase F-TrCP–E7N à sélectionner une sous-population spécifique de RB pour la dégradation, qui était basée sur l’état de certaines modifications post-traductionnelles de la protéine cible.

HPV16 E7 pleine longueur a pu interagir avec les inhibiteurs de kinase dépendants de la cycline p21Waf1 et p27Kip1, mais le domaine de liaison a été mappé au domaine C-terminal (résidus 40-98), au lieu du fragment E7N (résidus 18-20). Pour examiner plus en détail la spécificité du F-TrCP-E7N, les mêmes extraits de cellules U2OS ont également été sondés avec des anticorps dirigés contre p21Waf1 et p27Kip1. Comme on le voit sur la Fig. 2B (milieu), les niveaux à l’état d’équilibre de p21Waf1 et de p27Kip1 sont restés inchangés. Pris ensemble, le F-TrCP-E7N modifié a démontré une spécificité protéolytique vis-à-vis des protéines de la famille RB, mais pas d’autres régulateurs du cycle cellulaire tels que Cdk2, la cycline A, p21Waf1 et p27Kip1.

Mutagénèse Basée sur la Structure pour Générer une Ligase de Protéine Ubiquitine-Protéine ßTrCP–E7N Hautement spécifique. Le ßTrCP-E7N chimérique est toujours capable de lier les substrats ßTrCP endogènes, y compris l’IkB, la β-caténine et l’ATF4 (3-7). La surexpression de ßTrCP-E7N pourrait interférer avec la dégradation de ces substrats natifs. Inversement, la liaison du substrat endogène au ßTrCP-E7N pourrait interférer avec le positionnement correct du substrat prévu pour accepter l’ubiquitine de l’enzyme conjuguant l’ubiquitine, et donc réduire l’efficacité de la dégradation ciblée (Fig. 3AUpper). De plus, ßTrCP interagit avec un pseudo substrat hnRNP-U, qui attache ßTrCP et ses dérivés dans le noyau et empêche leur interaction avec les substrats (21). En introduisant des mutations spécifiques des résidus d’acides aminés sur ßTrCP pour éliminer sa liaison à la β-caténine, à l’IkB ou à la hnRNP-U, nous prévoyons d’améliorer non seulement la spécificité mais également la disponibilité du ßTrCP-E7N modifié pour recruter le substrat prévu (Fig. 3 Plus bas).

Le domaine de liaison au substrat de ßTrCP contient sept répétitions WD40 dans la région C-terminale, qui se replient dans la structure typique d’hélice β à sept pales conservée parmi les protéines WD40 (3-7). Étant donné que l’intégrité globale de la structure β-hélice des protéines WD40 est essentielle pour leurs fonctions, l’approche standard de mutagenèse par délétion induira probablement des altérations structurelles grossières et, par conséquent, n’est pas applicable pour définir des sites de liaison au substrat sur ßTrCP. Cependant, la structure cristalline connue des protéines WD40 peut être exploitée pour identifier les résidus de surface impliqués dans la liaison des substrats ßTrCP. Une approche de mutagenèse basée sur la structure a été conçue pour identifier et muter cinq résidus chargés positivement (R285, K365, R474, R521 et R524), prévus pour résider sur la surface supérieure de l’hélice β WD40, qui sont impliqués dans la liaison aux protéines associées à WD40 (Fig. 3B) (22). Cette approche a été détaillée dans Méthodes d’appui, qui est publiée en tant qu’information d’appui sur le site Web du PNAS. Aussi, voir Fig. 6, qui est publié à l’appui sur le site Web du PNAS. De plus, les substitutions de ces résidus Lys/Arg ne modifieront probablement pas la structure ßTrCP globale.

En utilisant le kit de mutagenèse multisite dirigé par QuikChange (Stratagene), nous avons simultanément muté ces résidus en Glu. Ce mutant composé marqué par un DRAPEAU, désigné F-TrCP(m1)-E7N, a été testé pour sa liaison à la fois aux cibles endogènes (IkB) et aux cibles knockout prévues (p107). Les cellules HeLa ont été transitoirement transfectées avec F-TrCP(m1)-E7N ou F-TrCP-E7N, et leurs interactions avec IkB et p107 ont été déterminées par coimmunoprécipitation. F-TrCP-E7N et F-TrCP présentaient des affinités similaires à la protéine IkB phosphorylée, tandis que les mutations du composé m1 abolirent la liaison F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3C Milieu). En revanche, des niveaux similaires de p107 ont été détectés dans les immunocomplexes de F-TrCP-E7N ou de F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3C Plus bas), indiquant que la ligase de protéine ubiquitine-protéine F-TrCP(m1)–E7N conçue est pleinement fonctionnelle dans le recrutement des cibles cellulaires prévues. Ces résultats sont en accord avec les prédictions structurelles de la Fig. 3B, et définir en outre les résidus d’acides aminés sur ßTrCP critiques pour la reconnaissance du substrat endogène.

Le F-TrCP(m1)-E7N d’ingénierie a été analysé plus avant pour sa puissance dans la dégradation de la p107 endogène. Les cellules C33A ont été cotransfectées avec du F-TrCP, du F-TrCP-E7N ou du F-TrCP(m1)-E7N, avec un plasmide d’expression CD19. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été récoltées et enrichies pour celles recevant les plasmides transfectés en utilisant les billes immunomagnétiques conjuguées à l’anticorps monoclonal anti-CD19. Les taux endogènes de p107 ont ensuite été déterminés par immunoblot. Comme le montre la Fig. L’expression ectopique 3D du F-TrCP(m1)-E7N a entraîné une réduction de 95 % des niveaux endogènes de p107, tandis qu’une régulation à la baisse de 82 % de p107 a été observée pour le F-TrCP-E7N (Fig. 3D Supérieur, comparer les voies 4 et 3). De plus, l’expression de F-TrCP(m1)-E7N n’a eu aucun effet observable sur la dégradation induite par le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α de l’IkB par le SCFßTrCP natif, ni sur la destruction de p27kip1 par les ligases de protéine–ubiquitine SCFSkp2 (données non montrées). Par conséquent, l’expression ectopique du F-TrCP(m1)-E7N modifié n’interfère pas avec l’activité globale d’ubiquitination du SCF en étouffant les composants centraux du SCF (Skp1, CUL-1 et Rbx1/Roc1) partagés par les protéines endogènes de la F-box.

La dégradation ciblée de la p107 a ensuite été évaluée dans des cellules C33A individuelles par immunofluorescence indirecte. De manière constante, le p107 a été largement éradiqué dans les cellules C33A exprimant le F-TrCP-E7N ou le F-TrCP(m1)-E7N, mais pas le F-TrCP seul (Fig. 3E). Collectivement, ces résultats indiquent qu’en éliminant les sites de liaison des substrats ßTrCP endogènes, la ligase d’ubiquitine-protéine F-TrCP(m1)–E7N modifiée a démontré une spécificité accrue et une activité protéolytique robuste vis-à-vis de la cible visée.

Domaine de Liaison Minimal en tant que Peptide de Ciblage pour un Recrutement Efficace du Substrat. Pour obtenir une spécificité élevée du recrutement du substrat et minimiser le ciblage non spécifique d’autres protéines cellulaires, nous avons testé si le domaine d’interaction minimal p107 / RB de E7N (désigné E7m), qui englobe les résidus 21-29 de E7 couvrant le motif LXCXE (23), pouvait obtenir une liaison et une dégradation efficaces de p107. Une ligase chimérique ubiquitine–protéine a été construite dans laquelle ßTrCP et E7m étaient liés de manière covalente par un espaceur flexible de 20 aa composé de 10 copies de répétitions Gly-Ser (désignées 10GS). Les cellules F-TrCP-E7N ou F-TrCP-10GS-E7m ont été transitoirement transfectées en cellules C33A, et leur liaison au p107 endogène a été évaluée par immunoprécipitation dans des extraits préparés après traitement avec l’inhibiteur du protéasome MG132 pour inhiber la dégradation en conséquence de cette interaction. Comme le montre la Fig. 4A (voies 2 et 3), le F-TrCP-10GS-E7m avait une affinité légèrement accrue avec le p107 par rapport à celle du F-TrCP-E7N original. Le F-TrCP-E7N et le F-TrCP-10GS-E7m ont été évalués en outre pour leur efficacité dans la dégradation du p107 par transfection transitoire dans les cellules C33A comme sur la Fig. 3D. Comme le montre la Fig. 4B, F-TrCP-E7N et F-TrCP-10GS-E7m ont induit jusqu’à 92% et 95% de régulation descendante de p107, ce qui indique que le ßTrCP modifié portant le domaine minimal de liaison à p107 fonctionne aussi efficacement que le F-TrCP-E7N original dans la dégradation des protéines cibles.

Administration par Voie rétrovirale du ßTrCP modifié pour une Dégradation Soutenue des Cibles endogènes. Nous avons ensuite examiné si les ligases ubiquitine–protéines modifiées pouvaient être exprimées de manière stable pour obtenir une dégradation soutenue de la cible visée. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 ont été transduites avec les rétrovirus recombinants exprimant PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N, ou le F-TrCP-E7N témoin (ΔDLYC), dans lesquels le site de liaison RB/p107 a été supprimé (1). Les cellules infectées avec des transgènes chimériques F-TrCP intégrés sur le plan chromosomique ont été isolées par tri FACS, sur la base de l’expression de la GFP à partir des virus, et la dégradation de la p107 endogène a été évaluée à partir de cellules HL-60 infectées immédiatement après l’infection (Fig. 5A), ou après 3 mois de culture en milieu de croissance (Fig. 5B). De plus, étant donné que deux autres membres de la famille des protéines RB, RB et p130, sont également exprimés dans les cellules HL-60, nous avons examiné si un seul F-TrCP-E7N peut cibler simultanément la dégradation de toute la famille de protéines RB qui interagissent avec le même motif LXCXE d’E7N. L’expression ectopique du F-TrCP-E7N transduit rétroviralement induit une régulation descendante spectaculaire de la forme hypophosphorylée de RB, ainsi que du p107 (Fig. 5A) et p130 (données non représentées) dans les cellules HL-60, soit immédiatement après l’infection et le tri FACS (Fig. 5A), soit 3 mois après l’infection et la culture continue (Fig. 5B, voie 3). En revanche, l’expression stable de F-TrCP-E7N (ΔDLYC) dans les cellules HL-60 n’a eu aucun effet sur la modification de p107, RB (Fig. 5A, voie 3), et les niveaux p130 (données non représentées). En accord avec l’observation que le F-TrCP-E7N dégrade préférentiellement le RB hypophosphorylé dans les cellules U2OS (Fig. 2), la réduction des espèces de RB hyperphosphorylées par expression stable de F-TrCP-E7N était moins prononcée, comparée à celle de la forme hypophosphorylée dans les cellules HL-60 (Fig. 5A, comparer la voie 2 de pRB et pRB-P).

Sous traitement à l’acide rétinoïque tout-trans (ATRA), les cellules HL-60 sortent du cycle cellulaire et subissent une différenciation terminale. Une accumulation de RB hypophosphorylé a été observée, ce qui contribuait auparavant à l’arrêt de la croissance induit par l’ATRA, alors que le RB hyperphosphorylé n’était pas détectable (24, 25). Pour examiner si la machinerie SCFßTrCP peut également être exploitée pendant la sortie du cycle cellulaire, des cellules HL-60 exprimant de manière stable F-TrCP-E7N ou F-TrCP(m1)-E7N ont été traitées avec un ATRA de 1 µM pendant 72 h, et la dégradation des protéines de la famille RB a été évaluée. Les cellules HL-60 exprimant de manière stable le F-TrCP-E7N ont entraîné une diminution de 95%, 98% et 85% des taux de RB, p107 et p130 respectivement, par rapport aux cellules infectées par le virus témoin pBMN-GFP (Fig. 5B, voie 2). Étant donné que l’ATRA active également la transcription des gènes sous le contrôle du virus de la leucémie murine Moloney LTR de pBMN-GFP (26), l’expression accrue de F-TrCP-E7N lors du traitement par l’ATRA a probablement contribué à la réduction efficace de la régulation de la p107, de la p130 et de la RB hypophosphorylée (Fig. 5B).

L’effet des protéines de la famille RB sur la progression normale du cycle cellulaire a été examiné dans des fibroblastes embryonnaires de souris présentant des perturbations dans les gènes RB, p107 et p130, et s’est avéré ne pas répondre aux signaux induisant l’arrêt de G1, tels que le retrait du facteur de croissance ou des dommages à l’ADN (27, 28). Cependant, les effets collectifs des membres de la famille RB sur la prolifération des cellules tumorales n’ont pas été étudiés, en raison du manque d’outils génétiques inverses efficaces. Les cellules HL-60 stables exprimant le F-TrCP(m1)-E7N de cette étude nous ont permis d’évaluer comment les cellules tumorales déficientes pour les trois protéines de la famille RB répondaient aux signaux d’arrêt de G1. Dans des cellules HL-60 à croissance exponentielle exprimant le F-TrCP(m1)-E7N induisant une dégradation constitutive des protéines de la famille RB, une accélération marquée de la progression du cycle cellulaire a été observée par rapport à celles infectées par le virus témoin pBMN-GFP (Fig. 5C à gauche). Ce résultat est cohérent avec le contrôle altéré des transitions G1–S observées dans les fibroblastes d’embryons de souris à triple knockout RB–/–, p107–/– et p130–/– (27, 28).

Le traitement par ATRA a inhibé la transition de la phase G1 à la phase S dans les cellules HL-60 infectées par le pBMN-GFP témoin (Fig. 5C) ou le virus F-TrCP-E7N (ΔDLYC) (données non représentées), ce qui est cohérent avec ce qui a été rapporté pour les cellules HL-60 non infectées (Fig. 5C) (24). Un retard initial dans la transition G1–S a également été observé dans les cellules pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 à 48 h après l’ATRA. Cependant, un arrêt complet de G1 n’a pas pu être réalisé au stade ultérieur (72-96 h) et les cellules ont continué le cours de la progression du cycle cellulaire (Fig. 5C). En revanche, les cellules témoins pBMN-GFP / HL-60 ont toutes été bloquées dans G1 entre 72 et 96 h. Ces observations suggèrent que la dégradation médiée par le F-TrCP(m1)-E7N des membres de la famille du RB altère un événement de réponse ATRA tardive nécessaire à la fin de l’arrêt de la croissance, alors que l’atténuation précoce de la progression du G1-S n’était en grande partie pas affectée. De plus, une réduction spectaculaire du nombre de cellules a été observée entre 72 et 96 h après le traitement par ATRA en raison de la mort cellulaire massive lors de la sortie et de la différenciation du cycle cellulaire induite par l’ATRA (29). De manière frappante, les cellules HL-60 exprimant le F-TrCP(m1)-E7N ont présenté une augmentation moyenne de 2 à 3 fois dans les populations subG1 par rapport à celle des cellules HL-60 infectées par le virus témoin (données non montrées), ce qui est cohérent avec l’augmentation de la mort cellulaire dans les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris à triple élimination RB-/-, p107–/– et p130–/– dans des conditions inhibitrices de croissance (28). Collectivement, l’expression constitutive du F-TrCP(m1)-E7N induit une régulation descendante de l’ensemble des protéines de la famille RB, ce qui conduit à une inhibition de l’arrêt de la croissance et à une augmentation de la mort cellulaire sous traitement ATRA.

L’arrêt G1 induit par l’ATRA implique la régulation coordonnée de plusieurs signaux / composants cellulaires qui contrôlent négativement le cycle cellulaire (examiné en réf. 30). Dimberg et coll. (31) ont rapporté que l’ATRA déclenche une séquence d’événements dans les cellules myéloïdes impliquant une augmentation précoce de l’expression de p21waf1, une stabilisation de p27kip1 et, plus tard, une déphosphorylation de RB au début de l’arrêt de G1. Étant donné que le ßTrCP(m1)-E7N ne dégrade que les membres de la famille des RB et n’a aucun effet sur la stabilité des cellules p21waf1 et p27kip1, il est probable que seule la réponse ATRA tardive et dépendante du RB soit affectée, ce qui est compatible avec la résistance des cellules pBMN-F-TrCP (m1)-E7N / HL-60 à terminer l’arrêt g172-96 h (Fig. 5C). L’inhibition précoce de la croissance observée par ATRA à 48 h (Fig. 5C) pourrait être attribuée, au moins en partie, à la régulation ascendante de p21waf1 et p27kip1, dont la stabilité n’est pas affectée par l’expression constitutive de F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 2 et 5).