Résumé
Les essais de chimiotaxie existants ne génèrent pas de gradients chimiotactiques stables et ne mesurent donc — au fil du temps — fonctionnellement que des mouvements aléatoires non spécifiques (chimiokinèse). En comparaison, la technologie microfluidique a la capacité de générer un microenvironnement étroitement contrôlé qui peut être maintenu de manière stable pendant de longues périodes et peut donc être adapté pour le dosage de la chimiotaxie. Nous décrivons ici un nouveau dispositif microfluidique pour le dosage sensible de la migration cellulaire et montrons son application pour évaluer la chimiotaxie des cellules musculaires lisses dans un gradient de chimiokine.
1. Introduction
La migration cellulaire dirigée joue un rôle essentiel dans les troubles inflammatoires, les maladies vasculaires, la cicatrisation des plaies et les métastases tumorales. Un certain nombre d’approches in vitro ont été développées pour quantifier la migration cellulaire, notamment la fermeture des plaies monocouches (« scratch assay ») et la chambre de Boyden. Cependant, ces méthodes actuelles sont relativement peu sensibles. De plus, de telles approches peuvent en fait mesurer uniquement la chimiokinèse, c’est—à-dire un mouvement aléatoire accru, plutôt que la migration cellulaire dirigée par la chimiotaxie.
En effet, l’utilité du test de rayure et des puits de chambre de Boyden est limitée par leur conception méthodologique.
Pour le test de rayure, une « plaie » définie (rayure) est réalisée dans une monocouche de cellules confluentes ; les cellules aux bords du défaut comblent alors progressivement le vide, et le temps de confluence rétablie est quantifié. Une réparation plus rapide de la rayure a été interprétée comme reflétant une « chimiotaxie » accrue due à la manipulation cellulaire ou à la nature des agents solubles ajoutés au milieu. Bien que l’expérience soit conceptuellement simple et techniquement facile à réaliser, les cellules sont baignées dans une concentration uniforme d’agent, et il n’y a pas de gradient de concentration de chimioattractant pendant toute l’expérience; le mouvement qui comble l’écart ne représente donc qu’une « marche aléatoire. »Ainsi, la « migration » dans un test de scratch est en grande partie fonction de la seule chimiokinèse accrue. De plus, comme généralement effectué – en particulier sur plusieurs heures d’un essai prolongé — la fermeture d’une « plaie » à gratter comprend probablement également une composante importante de la prolifération cellulaire.
L’autre méthode la plus courante pour mesurer la « chimiotaxie » consiste à utiliser des puits de Boyden. Différentes concentrations de chimiokines spécifiques sont placées dans le compartiment inférieur du dispositif, tandis que les cellules à évaluer sont incubées dans l’insert supérieur; une membrane microporeuse sépare les deux chambres et forme un support pour la croissance cellulaire et une barrière partielle pour la migration. Les cellules qui sont comptées à la face inférieure de la membrane, ou qui s’accumulent dans la chambre inférieure, sont généralement évaluées à un seul point d’extrémité fixe. Ce dosage présente l’avantage d’une migration dirigée apparente, c’est-à-dire de la chambre supérieure vers la chambre inférieure mais reste problématique. Premièrement, il n’y a pas de « gradient » de chimiokines de haut en bas, mais plutôt une seule fonction en une seule étape des concentrations faibles aux concentrations élevées. Deuxièmement, il n’y a aucun moyen de maintenir le différentiel de chimiokine des chambres de haut en bas. Initialement, la concentration de chimiokine dans le compartiment inférieur est plus grande, mais en quelques minutes à quelques heures, les concentrations s’égalisent en raison de la diffusion, à quel point la chimiotaxie spécifique cesse. Au lieu de cela, les mesures à long terme reflètent plus probablement un élément significatif de la chimiokinèse. De plus, une fois que les cellules tombent à travers la membrane et dans la chambre inférieure, il n’y a aucune possibilité de migration inverse. Enfin, la chambre de Boyden est également limitée car le comptage cellulaire nécessite la fin de l’expérience ; un parcours temporel nécessite donc plusieurs dispositifs.
La technologie microfluidique peut surmonter ces limitations en générant un gradient stable et contrôlable à long terme de facteurs solubles qui peuvent être surveillés en continu dans le temps. Utilisant des cellules traitées pour bloquer la prolifération, un tel dispositif permet une véritable évaluation continue de la chimiotaxie par rapport à la chimiokinèse. La figure 1 représente un tel dispositif où les concentrations de source et de puits sont maintenues en créant des puits correspondants dont les volumes sont importants par rapport au flux diffusif à travers le canal hydrogel de connexion. À l’état stationnaire, un gradient de concentration linéaire se forme entre ces deux puits. Bien que l’écoulement interstitiel à travers la région d’hydrogel puisse perturber le gradient si les pressions hydrostatiques dans les deux puits ne sont pas égales, les gradients de pression sont éliminés en connectant les puits de source et de puits avec des canaux et des réservoirs supplémentaires qui servent de voies de faible résistance pour l’écoulement du fluide et l’équilibrage de la pression. Les gradients peuvent ainsi être maintenus pendant plusieurs jours et utilisés pour étudier la migration cellulaire de manière sensible et spécifique avec une variété de types de cellules. Les travaux présentés ici décrivent l’utilisation de tels dispositifs pour évaluer la chimiotaxie des cultures primaires de cellules musculaires lisses et la comparer aux techniques de scratch et de chambre de Boyden pour la sensibilité.
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Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) Les 3 puits inférieurs sont des puits de cellules et / ou de sources pour les chimiokines, et les 3 puits supérieurs servent de réservoirs pour maintenir des pressions équivalentes dans les puits inférieurs. Selon la conception expérimentale, les puits latéraux ou le puits central peuvent servir de puits de source; les cellules d’un puits central peuvent migrer vers différents stimuli de chimiokine de chaque côté, ou différentes populations cellulaires dans les puits latéraux peuvent migrer vers un stimulus de chimiokine central. (b, c) Les gradients de concentration sont schématisés après l’ajout d’un indicateur de colorant fluorescent de faible poids moléculaire au puits source et au réservoir source, à 2 heures (b) ou 72 heures (c). d) Affichage graphique des gradients de concentration de 0 heure à 72 h après l’ajout de colorant fluorescent au puits source et au réservoir.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Culture de Cellules Musculaires Lisses Primaires (CMM)
Les aortes ont été récoltées sur des souris C57/B6 de 8 semaines (Charles River, Wilmington, MA) avec des ciseaux de dissection stériles. La graisse adhérente a été éliminée et les aortes ont été incubées pendant 20 min à 37 °C dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) contenant 1% de pénicilline/ streptomycine, 2% de sérum fœtal bovin et 5 mg/mL de collagénase de type II (Invitrogen). Les aortes ont été rincées dans du DMEM froid et l’adventice a été soigneusement disséquée; elles ont ensuite été coupées en petits morceaux et incubées pendant 30 min à 37 ° C dans du DMEM contenant 1 mg / mL de collagénase de type I (Invitrogen) et 0,125 mg / mL d’élastase de type III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Après pipetage répété pour dissocier le tissu, le mélange cellulaire résultant a été mis en suspension dans un « milieu SMC » frais (DMEM avec 10% de sérum de bovin fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine; 2% d’acides aminés non essentiels, 1% de L-glutamine; tous les réactifs d’Invitrogen) et cultivé à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 sur des plaques enrobées de fibronectine à 1 mg / mL pendant 30 minutes. Une fois la culture cellulaire établie (généralement après le premier passage), les SMC sont cultivées sur des flacons en plastique non enrobés (Corning Incorporated, Corning, NY).
Les SMC ont été utilisés des passages 2 à 7 et étaient de 99.5% de pureté évaluée par cytométrie en flux après coloration de l’α-actine du muscle lisse. Pour la coloration, les cellules sont récoltées et fixées avec 1% de paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). L’anticorps α-actine musculaire antismooth conjugué FITC (Sigma-Aldrich) à dilution 1: 100 dans un tampon 10X BD perm / wash (BD Pharmingen, San Jose, Californie) a été appliqué pendant 10 min à température ambiante. Les cellules sont lavées deux fois avec 1% de sérum fœtal bovin dans du PBS et une fois avec 1% de sérum fœtal bovin dans du PBS contenant 1% de formaldéhyde et immédiatement analysées par cytométrie en flux (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). L’isotype IgG1 de souris conjugué FITC (BD Pharmingen) est utilisé comme contrôle d’isotype. Les cellules pour les dosages chimiotactiques ont été récoltées lorsqu’elles avaient atteint la confluence.
2.2. Traitement à la mitomycine-C
Les cellules ont été trypsinisées (0,25% de trypsine-EDTA; Invitrogène) pendant 2 min à 37 °C, lavées avec du milieu SMC, puis incubées sous forme de suspension unicellulaire dans 40 µg /mL de mitomycine-C (MMC; Sigma-Aldrich) en milieu SMC pendant 30 min à 37°C. Après deux lavages supplémentaires dans le PBS, la viabilité, la prolifération ou la capacité migratoire des cellules ont été évaluées. Pour le test de cicatrisation (scratch), le traitement MMC a été effectué après le placage SMC et lorsque les cellules étaient confluentes à 100%; les cellules ont été incubées dans 40 µg / mL de MMC en milieu SMC pendant 30 min à 37 ° C, puis lavées deux fois dans du PBS avant le test.
2.3. Essai d’inhibition de la prolifération du SMC
Après un traitement par MMC ou une incubation témoin en milieu SMC, les SMC ont été cultivées dans des plaques à 6 puits (Corning Incorporated). Les cellules ont été récupérées après 1 h, 24 h ou 48 h par trypsinisation et le nombre de cellules et la viabilité ont été évalués par comptage à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion de bleu de trypan.
2.4. Les SMC
ont été cultivés dans des plaques à 12 puits (Corning Incorporated) jusqu’à confluence, puis traités avec du MMC. Après lavage, du milieu SMC frais a été ajouté et la monocouche cellulaire a été rayée de manière reproductible à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 µL. Différentes concentrations de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF; R&D Systems, Minneapolis, MN) dans des supports SMC ont été ajoutés à chaque puits. La distance entre les bords du défaut de rayure a été mesurée et moyennée à partir de cinq points distincts à 3, 6 et 9 h, ou jusqu’à ce que le défaut de plaie se soit refermé.
2.5. Essai de Transwell à chambre de Boyden
100 µL de suspensions de SMC à 1,0–1,5 × 105 cellules / mL (1,0-1,5 × 104 cellules totales) ont été chargés dans les inserts de transwell supérieurs (Costar, Corning Incorporated) et 600 µL de milieux de SMC contenant différentes concentrations de PDGF ont été placés dans le compartiment inférieur. Après 6 h, 12 h ou 24 h d’incubation, la membrane de transwell a été colorée avec Hoechst 33342 (Invitrogen) selon la recommandation du fabricant, et les cellules transmigrées sur la face inférieure ont été comptées au microscope à fluorescence à l’aide du logiciel d’Automatisation de microscopie et d’Analyse d’images MetaMorph NX (BioCompare, South San Francisco, CA). Aucune cellule n’a jamais été identifiée dans le milieu dans la chambre inférieure. Dans des expériences visant à évaluer si la migration cellulaire représentait une chimiotaxie ou une chimiokinèse aléatoire en l’absence de gradient de concentration, le facteur de croissance dérivé des plaquettes -BB (PDGF) a été ajouté à la chambre inférieure, au puits d’insertion supérieur uniquement, ou à la fois à l’insert supérieur et à la chambre inférieure.
2.6. Dosage des Dispositifs microfluidiques
Les dispositifs microfluidiques (Figures 1(a) -1(c)) sont préparés comme décrit ailleurs. Comme le montre la figure 1(d), les gradients de réactifs ajoutés sont stables pendant au moins 72 h. Selon le protocole expérimental, les cellules à évaluer sont placées dans le puits central et différents gradients chimiotactiques se développent à partir des deux puits latéraux. Alternativement, la migration de deux populations de cellules différentes peut être évaluée à partir des puits latéraux, présentant des gradients de concentration identiques générés par les réactifs placés dans le puits central. Les concentrations cellulaires étaient toujours de 4-5 × 105/mL et 40 µL des suspensions cellulaires (1,6–2,0 × 103 cellules) ont été chargés dans des puits d’essai.
Des cellules ont été incubées dans les dispositifs pendant différents moments, puis colorées avec Hoechst 33342 (Invitrogen). L’emplacement de chaque cellule a été déterminé par microscopie à fluorescence (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), et la distance migrée a été évaluée à l’aide du programme Matlab (MathWorks, Natick, MA). La » migration totale » est définie comme la somme des distances migrées par toutes les cellules au-delà d’un emplacement de départ initial; cet indice de migration est utilisé pour l’analyse statistique (figure 2).
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(d)iv je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je n’ai pas de problème avec le fait que je ne suis pas en mesure de le faire.
Évaluation de la migration cellulaire dans les dispositifs microfluidiques. Les cellules ont été plaquées dans le puits inférieur central d’un dispositif microfluidique, avec 50 ng /mL de PDGF en milieu SMC placé dans le puits inférieur gauche et le milieu SMC seul placé dans le puits inférieur droit, suivi d’une incubation à 37 °C pendant 48 h. (a, b) Image à contraste de phase de la chimiotaxie cellulaire depuis le canal central en direction du PDGF de 50 ng / mL dans le canal gauche; les images sont divisées le long du canal entre le puits de puits et le puits de source de sorte que toute la longueur du canal peut être représentée à un grossissement suffisant pour permettre une résolution cellulaire. (c, d) Image à contraste de phase de la chimiokinèse cellulaire à partir du canal central en direction du milieu SMC uniquement. (e, f) Image de fluorescence de faible puissance du canal gauche (e) ou droit; (f) à 48 h après coloration avec Hoechst 33342. (g) Image de fluorescence à haute puissance du canal gauche dans le panneau (e); le carré noir sans cellules près du côté droit de l’image (astérisque) est un poteau structurel qui marque le point de départ de la migration. h) Exemple d’analyse des migrations. Une ligne rouge verticale indique le point de départ; la distance entre le point de départ et le centre de chaque noyau cellulaire est mesurée, et la somme de toutes ces mesures individuelles devient la distance totale de migration à l’aide de Matlab.
Le collagène de type I (Invitrogen) est utilisé pour remplir le canal entre les puits centraux et latéraux et est le substrat par lequel les cellules migrent. 1 mg / mL et 2 mg / mL de collagène peuvent être utilisés. Bien que 1 mg / mL de collagène entraîne une chimiokinèse cellulaire de fond non spécifique un peu plus élevée et que la charge de gel soit techniquement plus difficile qu’avec 2 mg / mL de collagène, la concentration de collagène inférieure permet une plus grande migration des cultures primaires de SMC et la sensibilité au test est meilleure. Sauf indication contraire, la concentration de collagène dans les canaux de migration était de 1 mg / mL pour toutes les expériences.
2.7. Analyse statistique
Des comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test de Student ou de l’ANOVA unidirectionnelle. La signification a été définie au niveau.
3. Résultats et discussion
Comme le montre la figure 3(a), la prolifération cellulaire est bloquée par un traitement MMC. Il n’y a pas de différence significative de viabilité cellulaire entre la CMM traitée (%) et la CMM non traitée (%) jusqu’à 48 heures après le traitement. Ainsi, l’accumulation cellulaire dans les différents tests de migration représente un véritable mouvement cellulaire sans aucune composante de la prolifération cellulaire. Ceci est important car sans traitement MMC, les indices de migration des incubations à long terme peuvent être confondus par une prolifération cellulaire coïncidente.
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Migration des cellules dans les tests de chambre scratch et de Boyden. (a) Inhibition de la prolifération de la mitomycine-C (MMC). Les SMC traités avec ou sans MMC (40 µg/mL pendant 30 min à 37°C) ont été plaqués dans des plaques à 6 puits puis récoltés. Les dénombrements cellulaires ont été effectués manuellement sur un hémocytomètre après 1 h, 24 h et 48 h; les dénombrements cellulaires sont exprimés comme la moyenne ± un écart type de triplicats. L’exclusion du bleu de Trypan n’a montré aucune différence de viabilité cellulaire au-delà de 48 heures (%). Le traitement par MMC conduit à un nombre stable de cellules collectées à 24 h et 48 h avec une prolifération significativement accrue dans les populations non traitées par MMC (). b) Analyse des rayures; aucune différence n’est observée dans l’étendue de la migration entre les cellules cultivées sans chimiokine par rapport à 25-100 ng / mL de PDGF; au cours des 3-6 heures de ce test, aucune différence significative n’est observée entre les cellules témoins et celles traitées par MMC. (c) Test Transwell; différentes concentrations de PDGF ont été ajoutées à la chambre inférieure des dispositifs transwell au temps zéro; les cellules sur la face inférieure de l’insert transwell ont été dénombrées après 6 h, 12 h ou 24 h. Par rapport à l’absence de PDGF dans la chambre inférieure, il y avait un nombre significativement plus important de cellules migrées dans le groupe PDGF à 10 ng / mL, 25 ng/ mL et 50 ng/ mL après 12 h (). Après 24 heures, le nombre de cellules migrées dans les puits transbordés avec 5-50 ng/mL de PDGF n’était pas significativement différent par rapport aux chambres sans PDGF. Après 24 heures, le nombre de cellules migrées lorsque 100 ng/mL de PDGF était présent dans la chambre inférieure était significativement réduit par rapport au groupe témoin 0 ng/mL de PDGF. d) Chimiokinèse dans les puits transbordés; la même concentration de 50 ng / mL de PDGF a été chargée dans la chambre inférieure, la chambre supérieure ou les deux chambres inférieure et supérieure; la migration cellulaire a été analysée après 6 h, 12 h ou 24 h. Par rapport à l’absence de PDGF dans l’une ou l’autre chambre, la migration cellulaire était significativement plus importante avec 50 ng / mL dans la chambre inférieure à 12 heures (); à 24 heures, il n’y avait pas de différence significative entre les chambres de contrôle et 50 ng / mL de PDGF. Notamment, l’ajout de PDGF dans la chambre supérieure, avec ou sans PDGF dans la chambre inférieure, a conduit à une migration significativement accrue à 12 heures par rapport au PDGF dans la chambre inférieure seule ().
Dans les essais de rayure (Figure 3(b)) avec des cultures primaires de SMC, les cellules ont migré aléatoirement (chimiokinèse) pour combler les défauts à des taux comparables quelle que soit la concentration de PDGF, y compris en l’absence de tout agent chimiotactique. Sans traitement MMC, les défauts de la plaie ont tendance à se refermer légèrement plus tôt, suggérant un élément de prolifération cellulaire.
La figure 3(c) montre les résultats de migration pour SMC en utilisant le test de Transwell à chambre de Boyden. Le premier point temporel (12 h) montre une migration faible mais significativement accrue en réponse à 10-50 ng / mL de PDGF par rapport à l’absence de chimiokine dans le puits de fond. Cependant, il n’y avait pas de différence de migration distinguable sur une plage de concentration de PDGF de 10 fois, ce qui suggère que le test est relativement insensible, du moins pour les cultures primaires de SMC. De plus, au bout de 24 heures, il n’y a aucune différence entre les concentrations de chimiokines (y compris le milieu témoin), ce qui suggère que la migration à ce moment n’est pas spécifique une fois que les concentrations de cytokines ont commencé à s’équilibrer entre les puits supérieur et inférieur.
Pour démontrer formellement que la migration à travers la membrane dans le puits supérieur n’est pas nécessairement due à une chimiotaxie dirigée, du PDGF a été ajouté au puits supérieur, avec ou sans PDGF dans le compartiment inférieur. Même en l’absence de gradient de chimiokine, le PDGF dans la chambre supérieure a entraîné une transmigration nettement accrue (Figure 3 (d)); cela ne peut être attribué qu’à une chimiokinèse accrue.
Les expériences de transwell suggèrent donc que, bien que les différences initiales de concentration de PDGF puissent induire un certain degré d’augmentation de la migration cellulaire vers des concentrations plus élevées dans les puits inférieurs, la diffusion ultérieure de PDGF conduit à une chimiokinèse aléatoire.
En comparaison, les expériences dose-réponse utilisant les dispositifs microfluidiques (figure 4) démontrent une chimiotaxie significative à des concentrations aussi faibles que 2.5 ng / mL de PDGF (Figure 4(b)), et montrent une augmentation dose-dépendante de la chimiotaxie avec un pic d’environ 25-50 ng / mL (Figure 4 (a)). Il est intéressant de noter que des concentrations plus élevées de PDGF (par exemple, 100 ng/mL) entraînent une migration moindre, ce qui correspond à un arrêt de chimiotaxie à forte dose (18). Il est à noter que sans traitement MMC préalable, l’indice de migration est plus élevé (Figure 4(a)), ce qui met en évidence la contribution non obligatoire de la prolifération à la chimiotaxie « apparente » survenant avec des temps de dosage plus longs. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or « gold standard » Boyden chamber approaches.
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Microfluidic device assay. a) Courbes dose-réponse avec et sans traitement MMC préalable. Des SMC traités par MMC et non traités ont été placés dans des puits à cellules latérales, avec différentes concentrations de PDGF (5 ng / mL, 10 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL et 100 ng / mL) présentes dans les puits de source centrale. La migration a été mesurée après coloration Hoechst 33342 et microscopie à fluorescence après 48 h, en utilisant le programme Matlab pour calculer la migration totale. Les témoins (milieu SMC uniquement) et chaque concentration de PDGF ont été évalués dans des dispositifs en trois exemplaires. Des différences significatives peuvent être observées de 5 ng / mL à 100 ng / mL PDGF par rapport au témoin (). (b) Chimiokinèse par rapport à la chimiotaxie dans les dispositifs microfluidiques. Des SMC traités par MMC avec ou sans 2,5 ng / mL de PDGF ont été plaqués dans le puits de cellule centrale; 2,5 ng / mL ou 50 ng / mL de PDGF ont été ajoutés aux puits de source latéraux. En l’absence de PDGF présent dans le puits de cellule centrale, le test montre une migration totale significativement plus importante après 48 h avec 50 ng/mL dans le puits source (« 0-50 ») contre 2,5 ng/mL dans le puits source (« 0-2,5 »). La présence de 2,5 ng/mL de PDGF dans le puits de cellule centrale entraîne une migration totale significativement plus importante lorsqu’il existe un gradient de concentration (« 2,5–50 »).; ) attribuables à un effet de chimiokinèse local. En l’absence de gradient (« 2,5–2,5 »), il y a une migration associée à la chimiokinèse qui est significativement inférieure à la migration observée lorsqu’un gradient est présent (« 0-2,5 »;). (c) Expérience de parcours temporel effectuée en tant que panel (b).
Non seulement le dispositif microfluidique peut être utilisé pour mesurer la chimiotaxie, mais il peut également distinguer spécifiquement les contributions de la chimiokinèse et de la chimiotaxie à la migration (figure 4(b)). Ainsi, en l’absence de gradient de chimiokine (par exemple, 2.5 ng / mL PDGF dans les puits centraux et latéraux), l’indice de migration reflète la chimiokinèse. En comparaison, en l’absence de PDGF dans le puits central et de 2,5 ng/mL dans le puits latéral, l’indice de migration reflète la chimiotaxie dirigée. Le dispositif microfluidique peut également évaluer la chimiotaxie en présence de chimiokinèse existante, comme lorsque le puits central contient 2,5 ng / mL de PDGF et que le puits latéral contient 50 ng/mL. Il y a une migration faible mais statistiquement plus importante lorsque le stimulus est un gradient chimiotactique plutôt qu’une simple chimiokinèse.
Comme le gradient de chimiokine est établi en 2 heures (17) et est stable pendant plusieurs jours, les cellules peuvent migrer continuellement vers le haut du gradient de concentration au fil du temps (Figure 4(c)). En comparaison, d’autres méthodes classiques n’ont pas de gradient de concentration (test de scratch) ou n’ont qu’un gradient transitoire de chimiokine, de sorte que la chimiokinèse — plutôt que la chimiotaxie dirigée — est de plus en plus contributive.
Le dispositif microfluidique rapporté dans ce travail est supérieur à plusieurs égards par rapport à d’autres approches in vitro précédemment utilisées pour étudier la chimiotaxie. En particulier, la chambre de Boyden — impliquant un gradient de chimiokine à travers une membrane poreuse — est un test chimiotactique standard depuis les années 1950. Cependant, ce dispositif présente des limites importantes en ce sens que les gradients ne sont ni stables ni linéaires, avec une augmentation de concentration initiale forte qui se détériore progressivement avec le temps. Plus récemment, des technologies de systèmes micro-électromécaniques (MEMS) ont été développées qui utilisent des biopuces microfluidiques pour imiter les conditions in vivo; dans ces dispositifs, les cellules sont continuellement exposées à des forces de cisaillement sous flux contrôlé. Cependant, le flux continu de ces dispositifs présente un défi pour le maintien de gradients stables de chimiokines. Bien que les hydrogels entre le canal de source et de puits puissent créer des gradients de concentration linéaires, des variations subtiles dans les puits et les canaux peuvent engendrer des gradients de pression qui perturbent les gradients par écoulement interstitiel; de plus, le flux continu des dispositifs a tendance à diluer les chimioattractants sécrétés par les sources cellulaires. Dans le nouveau dispositif microfluidique décrit précédemment et validé pour la migration des cellules musculaires lisses dans cet article, les puits de source et de puits à grand volume maintiennent des gradients de chimiokine stables dans l’hydrogel de connexion; tout écoulement interstitiel est éliminé en connectant les puits de source et de puits avec des canaux et des réservoirs supplémentaires qui servent de circuit résistance-condensateur. Les gradients de concentration sont donc stables et linéaires pendant plusieurs jours. Les travaux en cours ont encore affiné l’application, en incorporant un traitement à la mitomycine-C pour réduire toute contribution confondante de la prolifération et en démontrant comment la chimiotaxie et la chimiokinèse peuvent être évaluées dans la même configuration expérimentale.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention du BWH-BRI Fund to Sustain Research Excellence -Bridge Research Grant. Chen Zhang a été soutenu par le China Scholarship Council pendant 18 mois. Ovid C. Amati et Richard T. Lee a été soutenu en partie par le NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
