Notes de laboratoire pour BIO 1003
© 30 août 1999, John H. Wahlert &Mary Jean Holland
ENZYMES
Protéines Qui Agissent Comme Catalyseurs
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Les cellules n’ont pas les options de chaleur et d’agitation vigoureuse pour accélérer les réactions chimiques en faisant en sorte que les atomes et les molécules se heurtent les uns aux autres plus souvent et avec plus de force. Au lieu de cela, ils fabriquent des catalyseurs protéiques appelés enzymes qui fournissent des surfaces sur lesquelles les réactifs se rencontrent dans la bonne orientation, et les enzymes peuvent même affaiblir les liaisons qui doivent être rompues. Les enzymes ont une spécificité élevéeonly seuls des réactifs spécifiques s’adapteront à leurs surfaces et équilibreront les charges de surface locales du lieu appelé site actif. L’ensemble particulier de réactifs pour une enzyme est appelé son ou ses substrats. Les enzymes, comme tous les catalyseurs, ne sont pas modifiées par la réaction qu’elles catalysent; ainsi, lorsque tous les réactifs ont été convertis en produits, les molécules enzymatiques d’origine restent.
La fonction enzymatique dépend de l’environnement dans lequel la réaction se produit. Des facteurs tels que la température et le pH peuvent grandement influencer la capacité d’une enzyme à faire son travail. La série d’expériences suivante illustre les principes des réactions catalysées par voie enzymatique dans les systèmes biologiques. Nous utiliserons l’enzyme catécholase (ou catéchol oxydase) qui est courante chez les plantes; elle est présente dans le jus de pomme de terre fraîchement pressé qui a été fourni. Les substrats de la catécholase sont le catéchol et l’oxygène. Les substrats réagissent entre eux au sein du site actif de l’enzyme. Les produits formés par cette réaction sont la benzoquinone et l’eau; puisque la benzoquinone a une couleur brune, vous pouvez voir que la réaction a eu lieu. C’est ce qu’on appelle la réaction de brunissement des fruits. La benzoquinone inhibe la croissance des micro-organismes et empêche les fruits endommagés de pourrir. Dans les cellules non endommagées, la catécholase est stockée dans des vésicules et n’interagit pas avec le catéchol.
En présence de l’enzyme catacholase:
catéchol + ½O2 
benzoquinone + H2O
Dans toutes les expériences ci-dessous, mélanger les ingrédients comme spécifié et remuer le mélange avec un génie vortex ou en tapotant le côté du tube près du fond; incuber les mélanges à 40 degrés C, sauf indication contraire.
Si vous doutiez de la pureté de l’enzyme, comment pourriez-vous savoir s’il y a autre chose dans l’extrait de pomme de terre que la catécholase?
I.Formation et détection de la Benzoquinone
Cette expérience établit les normes d’apparence lorsque la réaction a eu lieu ou n’a pas eu lieu. Utilisez de l’eau distillée où H2O est indiqué.
| Mix | Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment) |
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| 10 drops potato extract with 10 drops H2O (control) |
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| 10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O(contrôle) |
Comment définiriez-vous les concepts d’un contrôle et d’une expérience?
II. Spécificité enzymatique
L’hydroquinone est structurellement similaire au catéchol, mais pas la même. Dans cette expérience, nous verrons si l’enzyme peut également la convertir en benzoquinone, ou si l’enzyme est simplement trop spécifique dans sa conception pour interagir avec la molécule similaire mais pas identique.
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Mix |
Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol |
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| 10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone |
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| 10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (contrôle) |
L’énxyme peut-il convertir l’hydroquinone en benzoquinone? Comment en êtes-vous arrivé à cette conclusion ?
REMARQUE: VOTRE GROUPE FERA III OU IV PAS LES DEUX.
Demandez à votre instructeur de laboratoire si votre groupe fera la température III ou le pH IV.
III.Effet de la température sur l’activité enzymatique
Les enzymes sont conçues pour fonctionner dans une plage de température spécifique. Vous pouvez faire quelques suppositions quant au résultat pour les températures suivantes ci-dessous. Gardez à l’esprit que les structures qui produisent l’enzyme sont les fruits et les pommes de terre; sur l’échelle de température Celsius, 0 degré gèle, 22 degrés sont la température ambiante et 100 degrés sont en ébullition. Plus il fait chaud, plus les molécules vibrent et se déplacent rapidement. Les collisions de molécules d’eau avec l’enzyme pourraient défaire sa structure repliée qui est maintenue en position par des liaisons hydrogène; lorsque cela se produit, la molécule est dite dénaturée. Qu’adviendrait-il du site actif dans ce cas ? À basse température, les molécules se déplacent très lentement et les risques de collision et de réaction entre elles sont très faibles. Notez que l’extrait de pomme de terre a été conservé sur de la glace. Pourquoi?
Écrivez votre hypothèse sur l’effet de la température sur l’activité enzymatique:
Installez 6 paires de tubes à essai avec 10 gouttes d’extrait de pomme de terre dans un ensemble et 10 gouttes de catéchol à 1% dans l’autre. Incubez-les pendant 5 minutes, une paire dans chacun des 5 environnements de température indiqués ci-dessous. Mélangez ensuite l’extrait de pomme de terre et le catéchol ensemble; enregistrez la couleur initiale et remettez ce tube dans les environnements à température contrôlée. Enregistrez à nouveau la couleur après 5 minutes.
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Température |
Couleur initiale |
Couleur changement |
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0 degrees C |
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22 degrees C |
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40 degrees C |
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60 degrees C |
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80 degrés C |
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100 degrés C |
Les résultats soutiennent-ils votre hypothèse initiale?
Quelles températures dénaturent l’enzyme de sorte qu’elle ne puisse pas se rétablir.
Quel est le précipité blanc qui se forme à 100 degrés C?
IV. Effet du pH sur l’activité enzymatique
L’échelle de pH mesure le nombre d’ions hydrogène (chacun avec une charge +1) présents en solution. L’échelle dans les systèmes biologiques va de 0 (fortement acide) à 14 (fortement basique). 7, le point neutre, est le pH de l’eau pure. Rappelons que la structure repliée des molécules de protéines est en grande partie due à la liaison hydrogène entre des parties chargées de manière opposée de la chaîne polypeptidique. D’autres ions en solution pourraient remplacer les parties correspondantes de la chaîne et la défaire. Lorsque cela se produit, que devient le site actif?
Écrivez votre hypothèse sur l’effet de la plage de pH sur l’activité enzymatique:
Installez 7 tubes à essai avec 40 gouttes d’une solution de pH tamponnée différente dans chacun. Ajouter 10 gouttes d’extrait de pomme de terre à chacune et remuer. Ajoutez ensuite 10 gouttes de catéchol à 1% et remuez.
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pH |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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pH 2 |
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pH 4 |
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pH 6 |
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pH 7 |
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pH 8 |
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pH 10 |
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pH 12 |
Do the results support your hypothesis?
À quel pH ou plage de valeurs de pH l’enzyme fonctionne-t-elle le mieux?
Pourquoi mettre du jus de citron sur des fruits fraîchement tranchés retarde-t-il son brunissement?
V. Nécessité des cofacteurs pour l’activité enzymatique
De nombreuses enzymes ne fonctionnent que si un cofacteur leur est associé. La catécholase nécessite du cuivre comme cofacteur. La PTU est un produit chimique qui a une affinité plus élevée pour le cuivre que la catécholase et qui éloigne le cuivre de l’enzyme. Vous pouvez observer ce qui arrive à la fonction de l’enzyme lorsque son cofacteur est retiré. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.
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Mix |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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Tube A |
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Tube B |
Quel tube, A ou B, est le contrôle dans cette expérience?
