Figure 1

Topologie transmembranaire de la sous-unité α 1C. Pour illustrer les sites de diversité moléculaire, la séquence polypeptidique est schématiquement segmentée selon la carte génomique CACNA1C et les exons invariants (noirs) et alternatifs (bleus) correspondants sont délimités par des barres noires et numérotés (1-50). On pense que quatre régions d’homologie (I–IV), chacune composée de 6 segments transmembranaires (numérotés), sont repliées autour du pore central. le domaine d’interaction α (AID) d’un site de liaison β constitutif est représenté en vert. Les motifs LA et IQ (rouge) constituent le domaine de liaison à la calmoduline (CBD).

2.2. Les défis dans la sélection de la Cellule hôte

La diversité naturelle de Cav1.2 complique l’interprétation des données obtenues à partir de cellules natives, sans parler des données à canal unique. Ceci sous-tend l’importance de la recherche Cav1.2 dans les systèmes d’expression recombinants où la composition moléculaire du canal et la structure de ses constituants sont prédéfinies. Cependant, cette approche expérimentale a rencontré le problème majeur de la sélection d’une cellule hôte appropriée.

La plupart des études des canaux calciques ont été réalisées à l’aide de cellules HEK293. Ces cellules fournissent une grande efficacité d’expression des canaux Ca2+ recombinants mais contiennent malheureusement des canaux calciques endogènes présentant des courants Ca2+ allant jusqu’à 3 pA/pF. Ainsi, les cellules HEK293 ne permettent l’étude adéquate des canaux recombinants de Ca2+ que lorsque l’amplitude du courant est suffisamment grande pour ignorer la contribution des canaux endogènes. Une évaluation correcte des déterminants fonctionnels des canaux Ca2+ nécessite cependant l’utilisation de cellules hôtes totalement exemptes de sous-unités endogènes de canaux Ca2+. Les cellules COS1 ou COS7 répondent bien à cette exigence car elles ne génèrent aucun courant calcique appréciable, ne contiennent pas de sous-unités endogènes du canal Ca2+ ni leurs précurseurs, et ne présentent aucune induction de sous-unités Cav1.2 endogènes en réponse à l’expression des cellules recombinantes. Les paramètres cinétiques et la dépendance en tension de l’activation et de l’inactivation des courants de canal Cav1.2 mesurés dans les cellules COS1 sont cohérents avec les données obtenues dans d’autres systèmes d’expression. Un avantage important des cellules COS est leur taux de division relativement lent qui permet un meilleur contrôle de l’efficacité d’expression et d’assemblage des sous-unités de canal Cav1.2 de tailles différentes.

2.3. Problèmes de marquage fluorescent et de mesure

La fusion des fluorophores de type GFP aux terminaisons N et/ ou C de l’a1C recombinant ou à la terminaison N de β ne modifie pas notablement les propriétés électrophysiologiques des canaux exprimés, permet l’application de la microscopie fluorescente et FRET (fluorescent resonance energy transfer) à l’étude de la distribution et de l’assemblage subcellulaires de Cav1.2 ainsi que des aspects complexes de l’architecture moléculaire et de la dynamique du canal. Le canal conserve les caractéristiques électrophysiologiques majeures inchangées lorsque la séquence C-terminale A1c codée par les exons distaux 46-50 (Figure 1, résidus 1833-2138 dans a1C, 77) est remplacée par ECFP. Cependant, l’a1C fusionné par ses terminaisons N ou / et C à l’EYFP est très sensible au photoblanchiment qui l’inactive irréversiblement. Connue sous le nom d’inactivation lumineuse assistée par fluorophores (FALI), cette propriété intéressante limite l’applicabilité du photoblanchiment accepteur pour les mesures de FRET dans Cav1.2 en raison de l’incertitude de l’état fonctionnel du canal. Cependant, l’analyse ratiométrique des FRETTES corrigées entre les fluorophores, fusionnées aux queues des sous-unités a1C et/ou β, reflète les réarrangements structurels réversibles dépendants de l’état du canal induits par les changements de tension transmembranaire sous patch clamp.

2.4. Cav1.2 Recombinant: De quoi A-t-Il Besoin pour L’Expression Fonctionnelle et Comment Apparaît-Il?

Les propriétés typiques d’une Cav1.2 recombinante de type « sauvage » sont illustrées à la figure 2(A) en utilisant un exemple de l’isoforme humaine ubiquitaire a1C,77 (GenBank no. z34815). Lorsque l’a1C marqué par l’EYFP était exprimé dans les cellules COS1 seules, la protéine de canal marquée par fluorescence était distribuée de manière diffuse sur le cytoplasme et ne générait pas de courant calcique mesurable (Figure 2(A), panneau a). L’analyse quantitative de la distribution de l’a1C entre les PARTICULES et le cytoplasme (Figure 2(B)) a confirmé l’absence de ciblage significatif des PARTICULES par a1C indépendamment de la présence de α2δ (barres a et b). L’expression de Cavß en l’absence de α2δ a stimulé le ciblage des PM de a1C, mais le canal est resté silencieux (Figure 2 (A), panneau c) à moins que α2δ ne soit coexprimé (panneau d). Ainsi, les sous-unités β et α2δ sont suffisantes pour le canal fonctionnel ; dans ces conditions expérimentales, les sous-unités β stimulent le ciblage PM du complexe de canal et, en présence de α2δ, facilitent le déclenchement en tension du canal Cav1.2.

Figure 2

Rôle des sous-unités auxiliaires Cav1.2. (A) Des images épifluorescentes des cellules exprimant COS1 montrant la distribution de l’EYFPN-α 1C obtenue avec le filtre YFP (barres de mise à l’échelle, 4 µm) et des traces du courant de calcium maximal enregistrées en réponse à des pas de 600 ms à +30 mV à partir du potentiel de maintien mV (à gauche). (B) Distribution relative de l’EYFPN-α 1C dans la membrane plasmique (PM) sur le cytoplasme en l’absence (a) ou en présence de α 2δ(b), β 2d(c) ou α 2δ + β 2d(d). Le rapport de l’intensité de fluorescence dans les PARTICULES sur la zone sous les PARTICULES a été moyenné après soustraction de fond dans chaque cellule. Le rapport inférieur à 1.0 indique l’absence de ciblage significatif des PM par α 1C. *.

3.1. Inactivation dépendante du Ca2+ et Domaine de liaison à la Calmoduline de l’a1C

Il existe plusieurs déterminants différents du CDI, mais ce n’est qu’en 1997 que le site de détection du Ca2+ du CDI a été réduit à un tronçon de la séquence C-terminale de 80 acides aminés de l’a1C codée par les exons 40-42 (Figure 2) marqué par un bloc rouge dans la Figure 3 (A) (panneau a). Une variation d’épissure naturelle dans cette région en a1C, 86 (Figure 3(B)) a complètement inhibé le CDI, comme en témoigne l’absence de décélération du courant avec Ba2 + comme support de charge (panneau c, trace noire) par rapport à (trace rouge). Une autre caractéristique du CDI inhibé était l’absence de dépendance de la taille actuelle de la tension (Figure 3 (B), panneau d, symboles ouverts) qui contraste avec la dépendance en forme de U de la constante de temps d’inactivation rapide () sur le potentiel membranaire dans la Cav1.2 de type sauvage (voir Figure 3 (A), panneau d). Deux séquences distinctes, L et K, ont été identifiées au sein de cet étirement de 80 acides aminés dont les mutations de type a1C, 86 dans l’a1C sauvage sont conformes aux mêmes caractéristiques, suggérant l’existence de deux capteurs CDI adjacents. L’un d’eux a été décrit dans la région K comme le motif IQ de liaison à la calmoduline (CaM-) et, plus tard, le lien du motif IQ avec CDI en tant que site de liaison fonctionnel au Ca2 +-CaM a été confirmé dans trois études indépendantes par l’utilisation de mutants CaM dépourvus d’affinité pour le Ca2+. En conséquence, le motif LA a été lié au CDI en tant que site de liaison apo-CaM doté par l’état de repos du canal. Une seule molécule de CaM attachée à ce domaine de liaison à la CaM (CBD) dépendant du Ca2+ de l’a1C est le principal capteur de Ca2+ du canal.

La variation d’épissure de a1C dans la région CBD de a1C,86 inhibe non seulement complètement le CDI, mais supprime également le SI (Figure 3(B), panel c) et prive le canal de sensibilité différentielle à la modulation des sous-unités β (Figure 3 (B), panel e) malgré le fait que β reste associé à a1C, 86 (Figure 3(B), panel b). Cela indique que les trois propriétés du canal – la modulation CDI, SI et β— sous-unité – sont liées entre elles.

3.2. Inactivation lente

Un certain nombre de preuves ont été présentées que les acides aminés confinés à la partie distale des segments S6 dans a1C jouent un rôle important dans le SI. L’étude systématique de cette région a décrit le « déterminant annuel de l’inactivation lente » (ADSI) comme une structure composée de quatre acides aminés hautement conservés de quatre segments transmembranaires S6, constituant l’extrémité cytoplasmique du pore (Figure 3(A), panneau a). Leur mutation simultanée (S405I dans IS6, A752T dans IIS6, V1165T dans IIIS6 et I1475T dans IVS6) génère le canal a1C, IS-IV. L’analyse de la cinétique actuelle du canal a1C, IS-IV a montré une accélération considérable de la composante rapidement inactivante (≤ 10 ms) qui représente environ 50% de l’amplitude totale (ou). Inactivation lente dépendante de la tension d’a1C, IS-IV est complètement inhibée et le canal reste conducteur pendant toute la durée de la dépolarisation. Le remplacement de Ca2+ par Ba2 + en tant que porteuse de charge (panneau c) n’a pas modifié de manière significative ce schéma d’inactivation, tandis que l’analyse de la dépendance en tension de pour la composante inactivante de via le canal a1C, IS-IV (panneau d) a confirmé l’absence de CDI. Le remplacement de ß1a par ß2a (panel e) n’a pas modifié l’inactivation du courant de canal a1C, IS-IV suggérant l’absence de modulation différentielle des sous-unités β, tandis que l’analyse de co-immunoprécipitation (panel b) a fourni une preuve directe d’association entre a1C, IS-IV et β.

Pris ensemble, les résultats présentés à la figure 3 suggèrent qu’il existe un dialogue croisé entre ADSI, CBD et β, soutenu par des interactions directes entre eux et/ ou un repliement conformationnel spécifique des constituants du faisceau polypeptidique sous-jacent au pore. En effet, tant l’interaction de β avec le CBD que l’importance de la conformation fonctionnelle ont été directement démontrées dans des cellules vivantes exprimant la Cav1.2 recombinante.

3.3. La microscopie quantitative de FRET dépendante de la tension combinée à une pince de raccordement dans la cellule vivante a montré que la queue de la borne C de la sous-unité A1c est sujette à des réarrangements conformationnels réversibles en fonction de la tension. L’ancrage de la queue C d’a1C à la foliole interne de la membrane plasmique via le domaine d’homologie de pleckstrine (PH) fusionné à l’extrémité C d’a1C (a1C-) a aboli ce réarrangement conformationnel et inhibé à la fois le SI et le CDI (Figure 4 (A)) d’une manière très similaire à celle observée avec a1C, IS-IV (Figure 3 (C)). Cette modification limitant la mobilité de l’extrémité carboxylique a1C a eu une implication majeure sur la transduction du signal Ca2+. L’activation transcriptionnelle CREB-dépendante associée à l’activité de Cav1.2 a été complètement supprimée malgré la robustesse générée par le canal « ancré en C » en réponse à la dépolarisation. La libération de la queue C-a1C par activation de l’hydrolyse de PIP2 lors de l’activation de la phospholipase C restaure complètement toutes ces fonctions déficientes, y compris SI, CDI et le couplage efficace de à la transcription CREB-dépendante. Ainsi, c’est le pliage fonctionnel spécifique de la queue du terminal C a1C qui est crucial pour l’inactivation. Il est crucial pour la transduction du signal car il est conçu pour mettre en cage le Ca2+ pénétrant dans la CAME attachée au CBD et pour déplacer efficacement ce Ca2 + en cage vers des cibles de signalisation en aval associées à la transcription dépendante du CREB ou à la contraction du muscle cardiaque. Surtout, cette fonction se produit en coordination étroite avec les stimuli extracellulaires activant le canal. En termes de transduction de signal, SI est un verrou à l’intérieur du canal qui est libéré par le Ca2+ pénétrant pour accélérer sa fermeture et initier le mouvement de la queue de la borne C.

Figure 4

Rôle différentiel des queues carboxyle et amino-terminales de α 1C dans l’inactivation de Cav1.2. On a représenté (a) des images épifluorescentes illustrant le ciblage membranaire du α 1C marqué par l’EYFP (barres de mise à l’échelle, 4 µm) et (b) des traces superposées du maximum (noir) et (rouge) mises à l’échelle à la même amplitude pour α 1C-/β 1a/α 2δ, (A) PHN-α 1C/α 2δ(B), et ΔN-α 1C/α 2δ(C).

3.4. Rôle du N-Terminus A1c

Toutes les fonctions mentionnées ci-dessus dépendent également de l’intégrité du N-terminus a1C. Les propriétés d’inactivation du canal recombinant a1C/β/α2δ ne sont pas fortement altérées par des modifications structurelles de la partie proximale de la queue N d’a1C, par example par fusion d’une protéine fluorescente, par domaine PH, ou par épissage alternatif d’exons 1/1A générant l’isoforme longue d’a1C. La toute première analyse fonctionnelle de l’effet de délétion partielle de l’extrémité N-terminale a1C a montré qu’elle est impliquée dans l’inactivation tandis que β empêche l’inhibition du canal par la queue N. En utilisant la microscopie à FRET combinée à une pince à patch, nous avons constaté que l’inactivation provoque une forte réorientation mutuelle des terminaisons a1C et ß1a NH2, mais que leur distance vis-à-vis de la membrane plasmique n’est pas sensiblement modifiée. Ce manque relatif de mobilité est conféré par β de manière à faciliter la réponse du canal à la commutation de tension. Des expériences de découplage de la queue N-terminale de la sous-unité a1C de la régulation du canal ont été réalisées en l’absence de β. L’ancrage de la queue N-a1C dans la foliole interne de la membrane plasmique via le domaine de PH attaché a créé des conditions lorsque PHN-a1C et α2δ étaient suffisants pour générer un courant vers l’intérieur robuste (Figure 4(B)). Ce canal est cependant privé de CDI et de toute inactivation dépendante de la tension. En effet, ni le courant Ba2+ ni le courant Ca2+ n’ont montré de décroissance appréciable (voir traces superposées). La libération de la queue N-a1C lors de l’hydrolyse de PIP2 par activation de la phospholipase C a complètement inhibé le canal déficient en β. Des propriétés similaires, à l’exception d’une activation beaucoup plus lente du courant, ont été observées sur la délétion de la queue N-terminale entière (mais de 4 acides aminés) de l’a1C (Figure 4(C)). Avec l’un ou l’autre type de découplage de la queue N-terminale a1C — que ce soit par suppression ou par ancrage PM, un retard dans l’activation du courant de cellule entière semble être associé à un allongement de la première latence. Les enregistrements à canal unique ont révélé que la suppression de la queue N stabilisait essentiellement l’état ouvert du canal ΔN-a1C / α2δ, qui montrait des ouvertures plus longues lors d’une dépolarisation de longue durée.

Ainsi, le CDI est médié par les déterminants CBD de la queue C de l’a1C, par l’ADSI dans la région des pores cytoplasmiques et par le repliement des terminaisons C et N de l’a1C. La calmoduline intègre ces déterminants, fournissant un commutateur dépendant du Ca2+ qui met fin à l’inactivation lente, libère la queue C-a1C et fait la navette entre le Ca2 + / calmoduline associé agissant comme un stimulus activateur de la transduction du signal Ca2 +.

3.5. Expression et inactivation de Cav1.2 en l’absence des sous-unités β et α2δ

Les sous-unités β et α2δ sont-elles essentielles à l’expression fonctionnelle du canal Cav1.2 ? L’analyse des effets de la CaM exogène (CaMex) sur l’expression et les propriétés de Cav1.2 en l’absence de β ou de α2δ a clairement démontré que ni β ni α2δ n’est essentiel. La surexpression de CaMex ne modifie que légèrement la gâchette de tension du canal a1C / ß2d / α2δ en décalant la dépendance en tension de l’activation et de l’inactivation vers des potentiels plus négatifs, facilitant (mais non accélérant) l’inactivation et augmentant la densité d’environ 2 fois. Le CDI est conservé, comme le montre l’effet du remplacement de Ca2+ par Ba2+ en tant que porteur de charge qui a considérablement augmenté le cours temporel d’inactivation du courant (figure 5 (A)). Une nouvelle compréhension des rôles de β et α2δ vient avec la découverte que CaMex rend l’expression et l’activité du canal a1C en l’absence de β (Figure 5(B)) ou de α2δ (Figure 5(C)), mais pas ces deux sous-unités auxiliaires. Bien que CaMex ne soit pas structurellement lié à β et α2δ, il prend en charge le trafic, le CDI et la barrière de canaux. L’analyse quantitative a montré que CaMex ne stimulait pas la redistribution de l’a1C dans les PARTICULES sur le cytoplasme, mais augmentait significativement le ciblage membranaire plasmatique des canaux a1C/α2δ. En revanche, CaMex n’a pas amélioré la distribution relative des canaux a1C/ß2d et a1C/ß2d/α2δ dans la membrane plasmique sur le cytoplasme. Ainsi, en fonction de la sous-unité auxiliaire présente, l’activité des canaux supportés par CaMex de a1C/ß2d et a1C/α2δ est sous contrôle de différents mécanismes. Malgré cela, les canaux à une seule sous-unité auxiliaire facilités par CaMex présentent des propriétés assez similaires, notamment une cinétique d’inactivation significativement plus lente du courant calcique et un fort déplacement de la dépendance en tension de l’activation et de l’inactivation vers des potentiels plus négatifs. Semblables aux canaux A1C / ß2d / α2δ classiques, ces canaux conservent le CDI et une sensibilité élevée aux inhibiteurs calciques de la dihydropyridine. Cependant, seul le canal a1C/β/CaMex montre une facilitation du courant calcique par forte prépulse de dépolarisation (données non représentées).

Figure 5

Activité de Cav1.2 exprimée en l’absence de sous-unités β ou α 2δ. On a représenté (a) des images épifluorescentes illustrant la localisation prédominante des PM de l’EYFPN-α 1C (barres de mise à l’échelle, 4 µm) dans les cellules COS1 et (b) des traces superposées du maximum (noir) et (rouge) mises à l’échelle à la même amplitude pour le canal α 1C/β 2d/α 2δ/CaMex (A), α 1C/α 2δ/CaMex (B) sans β et α 1C/β 2d/CaMex (C) sans α 2δ.

Comme la CaM associée au CBD est impliquée dans le CDI, il est clair que l’effet de CaMex est médié par différents sites de liaison à la CaM. Un des candidats potentiels d’un tel site est présent dans la partie distale de la queue N-terminale a1C. Il reste à voir si ce site joue effectivement un rôle d’intégration dans le faisceau régulateur de plusieurs déterminants moléculaires soutenant l’inactivation de la Cav1.2. Une autre possibilité limite le rôle de CaMex à l’activation de la Cav1 silencieuse.2 dans les grandes grappes, où la disponibilité locale limitée de la CAM peut être la raison de la faible activité fractionnaire décrite à la section 2.5. Quels que soient les mécanismes associés à la régulation de la Cav1.2 par la CaM, ils semblent avoir peu d’implications pratiques pour une utilisation en médecine à l’heure actuelle exactement parce que la CaM est un peptide ubiquitaire et multifonctionnel qui régule de nombreuses autres fonctions cellulaires, alors que sa présence dans la Cav1.2 est vitale pour le CDI.

4. modulation β-Sous-unité de Cav1.2

La variabilité moléculaire remarquable des sous-unités β, reflétée dans les propriétés d’inactivation altérées de la Cav1.2 modulée différentiellement, illustrée à la figure 3 (A) (panneau e), présente une nouvelle opportunité pour le développement d’approches innovantes pour le traitement des maladies associées à une mauvaise manipulation du Ca2+. Plusieurs observations récentes fournissent une base pour une telle vision optimiste. Premièrement, les sous-unités β présentent une tendance à former des homo- et des hétéro-oligomères qui a été directement démontrée par diverses techniques biochimiques dans les cellules natives et dans le système d’expression recombinant. Alors qu’une augmentation de l’homooligomérisation β augmente significativement la densité de, l’hétérooligomérisation des variants d’épissure β2 avec d’autres sous-unités β peut également modifier la cinétique de dépendance en tension et d’inactivation de Cav1.2. La β-oligomérisation est médiée par plusieurs déterminants moléculaires et nécessite donc de multiples interventions à gérer, par exemple en cas de surexpression pathogène de β2. Cependant, il semble plus possible de cibler β2 lui-même; le déterminant moléculaire de l’inactivation lente et incomplète spécifique de β2 (voir Figure 2 (A), panneau d) a été identifié comme le déterminant C-terminal des 40 acides aminés (ß2CED) présent dans les 7 variantes d’épissure β2 naturelles connues. Le découplage de son interaction indépendante du Ca2+ et de la CaM avec le CBD (Figure 3 (A), panel a) récupère les propriétés d’inactivation caractéristiques de la Cav1.2 modulée par ß1b / β3 présentant une inactivation rapide et complète de, comme cela a été montré dans les expériences de délétion. À mon avis, un tel découplage sélectif du ß2CED de la liaison à son récepteur dans le CBD est une nouvelle stratégie attrayante pour gérer la surcharge de Ca2 + car les autres sous-unités β ne doivent pas être affectées. De plus, une conversation croisée entre Cav1.2 et la protéine kinase II Ca2+/CaM-dépendante cible la plus proche sera préservée.

5. Conclusions

Cet article a démontré que nous savons accélérer l’inactivation de la Cav1.2 à moins de 10 ms (Figure 3(C)), la priver complètement de son inactivation (Figures 4(B) et 4(C)), ou éliminer la dépendance de son expression à partir de β ou α2δ sans conséquences significatives pour l’inactivation. Nous avons décrit les rôles ultimes des termini a1C et de la CaM pour l’inactivation, et pourtant aucune de ces études ne nous a rapprochés de l’objectif ultime de gérer la mauvaise manipulation du calcium associée à la Cav1.2 sauf des bloqueurs des canaux calciques anciens et, malheureusement, pas trop sélectifs. La seule nouvelle cible réalisable est la modulation β2 pathogène de Cav1.2, où l’interaction effecteur-récepteur est établie.

En termes de biologie moléculaire, Cav1.2 est certainement parmi les systèmes de régulation les plus compliqués connus. Diversité moléculaire remarquable de chacun des Cav1.les constituants 2 donnent lieu à de multiples variantes génétiques / d’épissure du canal qui sont soumises à une ségrégation en grappes larges et diverses et à un changement fonctionnel continu par homo- et hétéro-oligomérisation de β et d’autres composants de signalisation, sans parler des espèces, des tissus et de la variabilité du développement. Nous sommes surpris par la redondance des propriétés de multiples isoformes Cav1.2 et sommes encore plus surpris lorsque certaines d’entre elles, ne montrant que des propriétés électrophysiologiques « conventionnelles », s’avèrent associées à une maladie. En cherchant une explication, notre perspicacité ne doit pas se concentrer intuitivement uniquement sur les caractéristiques de la dépendance courant-tension du calcium, de l’amplitude et de la durée. La réponse finale, telle que l’organisation spatiale et temporelle des événements de signalisation CREB associés à une isoforme spécifique de Cav1.2, et sa compétition avec d’autres mécanismes de signalisation (par exemple dépendants de l’AMPc), ou d’autres isoformes de Cav1.2 présentes, peuvent fournir de nouvelles idées et ouvrir de nouvelles frontières pour l’étude des rôles des variantes d’épissure individuelles de Cav1.2 dans les cellules et tissus normaux et malades.

Abbreviations

ADSI:	Annual determinant of slow inactivation
CaM:	Calmodulin
CBD:	Calmodulin-binding domain
CDI:	Ca-dependent inactivation
ECFP:	Enhanced cyan fluorescent protein
EYFP:	Enhanced yellow fluorescent protein
FALI:	Fluorophore-assisted light inactivation
FI:	Fast inactivation
FRET:	Fluorescent resonance energy transfer
GFP:	Green fluorescent protein
SI:	Slow voltage-dependent inactivation.