La CPZ atténue la colite indépendamment de la TRPV1

Pour contester le mécanisme par lequel les lavements CPZ atténuent la colite expérimentale, nous avons induit la colite au sulfate de dextrane sodique (DSS) chez les WT) et des souris déficientes en TRPV1 (chaque groupe n = 8). Bien que des rapports contradictoires existent, les souris déficientes en TRPV1 ont développé une colite DSS et une perte de poids au même degré que les souris WT congénitales de notre laboratoire, ce qui est conforme à nos résultats du modèle de colite TNBS que nous avions précédemment publié7,8,9,10,11,12. Pour les traitements de lavement par CPZ, nous avons utilisé la même concentration de CPZ (531 µM) que celle précédemment signalée pour atténuer la colite DSS (5 %) chez les rats8. L’évolution de la colite a été surveillée quotidiennement par des mesures de poids corporel et une endoscopie. Des applications deux fois par jour de lavements CPZ (531 µM) ont atténué la colite DSS au même degré chez les souris WT et TRPV1-/−, ce qui s’est traduit par une amélioration du score endoscopique et une réduction de la perte de poids corporel (Fig. 1 BIS à C). Les taches de H&E du côlon distal à la fin de l’expérience DSS de 7 jours ont révélé une architecture de tissu muqueux détruite avec de nombreuses cellules immunitaires infiltrantes dans les deux points des témoins. Cela contrastait fortement avec une muqueuse largement intacte et l’absence d’infiltration significative des cellules immunitaires dans les deux-points des souris traitées par CPZ des deux génotypes (Fig. 1D). Conformément à ces résultats, le score histologique a été fortement réduit chez les souris traitées par CPZ des deux génotypes (Fig. 1E).

La CPZ active la TRPA1

L’observation in vivo selon laquelle les lavements à la CPZ inhibaient efficacement la colite chez les souris mutantes nulles de la TRPV1 a imposé la question des effets neuronaux indépendants de la CPZ de la TRPV1. Comme il a été démontré que TRPA1 était crucial dans divers modèles d’inflammation, y compris la colite 6, 12, 14, nous avons testé si la CPZ agissait sur TRPA1.

Des courants ioniques induits par la CPZ à travers hTRPA1

Des expériences de Patch clamp ont été réalisées en mode pince de tension sur des cellules HEK293t exprimant de la hTRPA1 recombinante (cellules hTRPA1-HEK293t). À un potentiel de maintien de -60 mV, CPZ (10 µM) a induit un courant entrant qui a été presque complètement inhibé (inhibition de 93%, n = 5) par l’antagoniste sélectif du TRPA1 HC-030031 (HC, 10 µM) (Fig. 2 BIS). Dans toutes les cellules dans lesquelles un courant entrant induit par la CPZ a été enregistré, le carvacrol (100 µM), un agoniste TRPA1 établi, a également évoqué de grands courants entrants au même potentiel de maintien, démontrant l’expression fonctionnelle de hTRPA1. Ces cellules hTRPA1-HEK293 ont également été soumises à des rampes de tension de -100 à +100 mV d’une durée de 400 ms toutes les 4 s (Fig. 2B). La relation courant-tension induite par la CPZ affichait une légère rectification vers l’extérieur et un potentiel d’inversion proche de 0 mV (Fig. 2C). Les courants évoqués par CPZ (10 µM) ont été inhibés par HC (10 µM). L’effet était plus prononcé aux potentiels négatifs (89 % ± 5 % d’inhibition à -80 mV, moyenne ± SD, n = 7) qu’aux potentiels positifs (80 % ± 9 % d’inhibition à +80 mV).

L’influx calcique induit par la CPZ par hTRPA1

L’action sélective de la CPZ sur la TRPA1 a été confirmée en utilisant la technique de microfluorimétrie calcique. Les cellules hTRPA1-HEK293 ont été stimulées par deux applications de CPZ (50 µM) pendant 10 s à intervalles de 5 min (Fig. 2D). Les antagonistes sélectifs HC (20 µM) et A-967079 (10 µM) ont été appliqués pendant 1 min avant et pendant le premier défi CPZ. La réponse CPZ a été complètement abolie par les deux antagonistes. Il est à noter que l’élimination de HC a entraîné un afflux de calcium, probablement dû à l’action résiduelle de CPZ, alors que cet effet off était absent dans le cas de l’A-967079 qui peut se détacher plus lentement (Fig. 2D). Nous avons ensuite analysé la dépendance à la concentration des effets de la CPZ. Des concentrations croissantes de CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM et 50 µM) ont été appliquées aux cellules hTRPA1-HEK293 pendant 20 s chacune à des intervalles de 3 min. À partir de 100 nM, toutes les concentrations de CPZ évoquaient des transitoires de calcium avec des amplitudes de plus en plus grandes (Fig. 2E). Le Carvacrol (100 µM) a été appliqué à la fin de l’expérience pour contrôler l’expression fonctionnelle de TRPA1, mais la réponse du carvacrol après une CPZ de 50 µM était remarquablement faible, suggérant une désensibilisation croisée. Les cellules HEK293 non transfectées ont été soumises aux mêmes applications CPZ et seule la concentration la plus élevée testée (50 µM) a induit une augmentation minimale du calcium. Nous nous attendions à ce que la CPZ engage les trois résidus critiques de cystéine dans le domaine N-terminal du canal car il s’agit d’un composé électrophile. Les cellules HEK293 exprimant WT hTRPA1 et les cellules exprimant le mutant triple cystéine hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) ont été soumises à une application CPZ (1 µM, 20 s) suivie de l’agoniste non électrophile carvacrol (100 µM, 20 s) et de l’AITC hautement électrophile (50 µM, 30 s). L’ionomycine a été appliquée à la fin de l’expérience comme témoin positif. L’amplitude du transitoire calcique évoqué par 1 µM CPZ a été sensiblement réduite (> 80%) dans les cellules exprimant hTRPA1-3C par rapport aux cellules exprimant WT hTRPA1 (Fig. 2F), tandis que la différence de sensibilité CPZ entre les génotypes a été abolie à une concentration de CPZ de 100 µM (Fig. 2G). La réponse AITC a été diminuée dans les cellules mutantes, tandis que le carvacrol a évoqué de grands transitoires d’ions calcium chez les mutants WT et 3C. Prises ensemble, ces réponses cellulaires indiquent que la puissance relativement élevée de la CPZ dépend des trois cystéines critiques. Cependant, lorsque la concentration de CPZ est 100 fois plus élevée, d’autres sites de liaison prennent en charge l’activation de hTRPA1. Cette forte concentration de CPZ lipophile pourrait également interagir avec la membrane lipidique cellulaire, activant indirectement TRPA1, comme montré précédemment pour le composant lipidique A des lipopolysaccharides16. De plus, en présence de la N-acétyl cystéine (NAC) piégeuse électrophile à une concentration saturante (15 mM) de 50 µM, la CPZ n’a pas pu susciter de réponse. Lors de l’élimination du NAC, CPZ a évoqué de grands transitoires de calcium dans les cellules hTRPA1-transfectées HEK293t (Fig. 2H) qui confirme que CPZ agit comme un agoniste électrophile pour hTRPA1.

La CPZ active une sous-population de neurones du ganglion racinaire dorsal (DRG) sensibles à l’AITC

Les neurones DRG ont été maintenus en culture primaire et étudiés par microfluorimétrie calcique. Les cellules ont été stimulées par la CPZ (50 µM, 20 s), suivie de l’AITC (100 µM, 30 s), de la capsaïcine (CAP, 1 µM, 10 s) et de la KCl (60 mM, 30 s). La figure 3A illustre des exemples de neurones DRG répondant à ces quatre stimuli. Une fraction typique des neurones DRG a été activée par l’AITC (301 neurones sur 906, 33%, n = 8 souris) indiquant l’expression fonctionnelle de TRPA1. Une sous-population de ces neurones sensibles à l’AITC a également été activée par CPZ (185 neurones sur 301, 61%). La sensibilité à la CPZ était presque complètement limitée aux neurones sensibles à l’AITC. Sur un total de 200 neurones sensibles à la CPZ, 185 (93%) ont également été activés par l’AITC, ce qui indique une forte concordance des sensibilités à la CPZ et à l’AITC (Fig. 3). Comme dans le cas des cellules HEK293 exprimant hTRPA1, les transitoires de calcium évoqués par la CPZ dans les neurones DRG dépendaient de la concentration avec une valeur EC50 estimée à 30 µM de CPZ et la faible réponse AITC après 100 µM de CPZ suggérait à nouveau une désensibilisation croisée (Fig. 3B, C). La figure 3D montre le chevauchement de la réactivité CPZ, CAP et AITC dans les neurones DRG en POIDS à des concentrations données: 14% des neurones DRG ont répondu à l’AITC mais pas à la CAP (125/906), 16% ont répondu à la CAP mais pas à l’AITC, tandis que la CPZ a induit des transitoires de calcium dans 78% des neurones qui ont répondu à la fois à l’AITC et à la CAP (137 sur 176). Pour démontrer la spécificité des effets observés, les neurones TRPV1−/− et TRPA1−/−DRG ont été exposés au protocole ci-dessus. Environ 90% des neurones DRG déficients en TRPV1 qui étaient sensibles à l’AITC ont également répondu à la CPZ (509/572 cellules), tandis qu’aucun des 448 neurones DRG déficients en TRPA1 testés n’a montré d’afflux de calcium en réponse à la CPZ (100 µM) comme illustré par des exemples représentatifs de la Fig. 3E, F.

La désensibilisation systémique par TRPA1 atténue la douleur

Après avoir découvert que la CPZ est un puissant agoniste de la TRPA1, nous avons compris pourquoi les premiers lavements de CPZ (deux fois par jour) étaient évidemment douloureux chez les souris WT. Nous avons ensuite quantifié le comportement nocifenseur induit par le lavement CPZ (531 µM) chez des animaux sains (chacun n = 6) en comptant les réactions de torsion et en enregistrant les réponses réflexes viscéromotrices (VMR) grâce à l’électromyographie intégrée (EMG) de la paroi musculaire abdominale (Fig. 4 BIS, B). Au cours de la répétition des traitements CPZ deux fois par jour, nous avons noté que les knock-out TRPA1 ne présentaient aucun comportement lié à la douleur à aucun moment. De plus, les souris WT ont présenté une diminution progressive des réponses à la douleur initialement fortes avec une forte baisse vers le jour 3, ce qui a conduit à une désensibilisation finalement complète des deux paramètres nocifensifs. Cette perte de perception de la douleur colique chez des souris par ailleurs normales a soulevé l’espoir que les lavements auraient pu délivrer une quantité pharmacodynamique de CPZ suffisante pour induire une hypoalgésie systémique. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé le test d’essuyage oculaire en utilisant AITC (100 µM) et CAP (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Les deux tests ont montré une nette atténuation du nombre de frottements oculaires chez les souris WT qui avaient été traitées avec des lavements CPZ (jusqu’à 12-16 h avant le test). Ces effets ont probablement été médiés par la désensibilisation de TRPA1 plutôt que par le bloc TRPV1, car les souris déficientes en TRPV1 étaient insensibles à l’instillation d’huile de moutarde (AITC, 100 µM) dans l’œil au même degré que les souris WT (Fig. 4C). Inversement, les lavements CPZ étaient inefficaces chez les souris TRPA1−/-, lorsque ces souris étaient mises au défi par des instillations de CAP dans l’œil (Fig. 4D).

Comme les lavements répétés sont une voie d’administration désagréable, nous avons testé un éventuel effet anti-nociceptif de la CPZ perorale (531 µM) dans l’eau potable. Le régime de consommation d’alcool sur 10 jours a été bien toléré sans effets indésirables évidents. Au cours de l’administration orale continue de CPZ, la latence de retrait de la patte à la stimulation par la chaleur rayonnante (méthode Hargreaves) a progressivement augmenté dans les deux pattes postérieures (Fig. 4E). Le temps de tolérance a été environ doublé au jour 7 et est resté significativement élevé du jour 2 au jour 10. Après 2 semaines de récupération avec de l’eau potable pure, les latences de sevrage étaient revenues au niveau de référence. La réactivité mécanique à la stimulation par la force croissante linéairement d’un filament électrodynamique de von Frey n’a pas été significativement affectée pendant les dix jours de consommation de CPZ (Fig. 4F). La question s’est posée de savoir si l’hypoalgésie thermique et chimique représentait un effet de classe des agonistes désensibilisants du TRPA1 ou s’il était spécifique de la CPZ. Ainsi, nous avons administré de l’AITC à une concentration similaire et bien tolérée (500 µM) via l’eau potable. Le même schéma posologique pour l’AITC que celui décrit pour la CPZ a entraîné une augmentation progressive de la latence de retrait des pattes à la stimulation par la chaleur rayonnante qui était significativement plus faible que celle induite par la CPZ (Fig. 4E). La réactivité mécanique n’a pas été modifiée sous le régime de consommation d’alcool de l’AITC (Fig. 4F).

La CPZ provoque une désensibilisation soutenue des neurones sensoriels peptidergiques exprimant TRPA1 /TRPV1

Nous avons ensuite posé la question de savoir si la désensibilisation d’animaux entiers par la CPZ pouvait être reproduite au niveau cellulaire. À cette fin, nous avons réalisé des expériences d’imagerie calcique avec des neurones DRG isolés obtenus à partir de souris témoins et d’animaux traités pendant 7 jours deux fois par jour avec des lavements CPZ. Ces neurones ont nécessairement été maintenus en culture pendant 16 à 24 h, en présence de NGF. Au total, 399 neurones de souris témoins et 584 neurones de souris traitées au lavement ont été chargés de Fura-2 et des transitoires de calcium évoqués par l’AITC, le carvacrol, le CAP et une solution riche en KCl ont été enregistrés. Les réponses à ces agonistes TRPA1 (AITC et carvacrol) et TRPV1 (CAP) n’étaient pas significativement différentes dans les neurones DRG des animaux témoins et des animaux traités au lavement (Fig. S1). Cependant, l’expression de l’ARNm de TRPA1 (qPCR) était environ deux fois régulée à la hausse dans le DRG lombo-sacré préparé immédiatement après le lavement final de CPZ (Fig. S2) alors qu’aucun changement dans l’expression de TRPA1 n’a été détecté lorsque 24 h se sont écoulés in vivo après le lavement final. L’ARNm TRPV1 n’a pas changé dans les deux cas. Ainsi, la régulation transcriptionnelle de l’expression du gène TRPA1 avait eu lieu, en raison des lavements multiples de CPZ, mais elle a été rapidement inversée lorsque l’approvisionnement en CPZ a été interrompu. Dans des conditions de culture de DRG, le même renversement épigénétique avait probablement eu lieu et toutes les CPZ résiduelles étaient probablement éliminées, de sorte qu’aucune désensibilisation résiduelle ne pouvait réellement être attendue. Comme les modèles cellulaires ne reflétaient pas la désensibilisation induite par la CPZ sur la durée de vie des animaux entiers in vivo, nous avons cherché un autre indicateur fort de l’effet systémique surprenant. La majorité des neurones nociceptifs est peptidergique, exprimant principalement le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) et la substance P (SP) 15,17. Lors de la dépolarisation, comme par KCl et l’afflux de calcium, en raison de l’activation des canaux calciques voltage-gated, ces neuropeptides sont libérés des fibres nerveuses dans une fonction quasi efférente (inflammation neurogène). D’autre part, les canaux TRP activés sont par eux-mêmes de très bons conducteurs de calcium et ne nécessitent pas de support par des canaux sodiques ou calciques en tension pour évoquer une exocytose vésiculaire de CGRP18. Ainsi, la libération stimulée de CGRP peut servir d’indice d’activation des nocicepteurs (peptidergiques). De même, les neuropeptides vasoactifs ont divers effets sur le processus d’inflammation en soi et il a été démontré que la déplétion ou la désensibilisation de la population de neurones sensoriels peptidergiques atténue la colitise19,20,21. Pour déterminer si les lavements CPZ (531 µM) désensibilisent par TRPA1, localement et systémiquement, nous avons utilisé des préparations isolées du côlon et de la peau de souris. Des deux-points de souris saines C57BL/6 (n = 8) ont été exposés à la CPZ (100 µM) qui a induit une libération massive de CGRP (Fig. 5); applications ultérieures d’AITC (100 µM) 5 min ou 15 min après CPZ (Fig. 5A, B) ne pouvait plus induire la libération de CGRP, suggérant une désensibilisation croisée fonctionnelle aiguë profonde à l’agoniste TRPA1. Cet effet ne peut pas être dû à l’épuisement, car la réponse KCl (60 mM) qui en a résulté était normale. Les deux-points de souris qui avaient été traités à plusieurs reprises avec des lavements CPZ (531 µM) in vivo, deux fois par jour pendant 7 jours ont été isolés et testés 12 à 16 h après le dernier lavement. Ni CPZ (100 µM) ni AITC (100 µM) n’ont induit de libération de CGRP dans cette condition (Fig. 5C, D) ; notamment, la libération de CGRP induite par le CAP (30 nM) a été fortement réduite mais n’a pas été abolie (Fig. 5E). En revanche, la libération de CGRP induite par le KCl (60 mM) par dépolarisation non spécifique n’a pas seulement été réduite, mais en fait améliorée après les lavements CPZ. Cela indique que les fibres nerveuses du côlon n’étaient pas appauvries en CGRP, mais plutôt trop remplies, mais essentiellement désensibilisées de manière soutenue à l’activation chimique par TRPA1 ainsi que par TRPV1 (n = 6). Enfin, la préparation cutanée, isolée 12-16 h après le dernier lavement CPZ, a également montré que la libération de CGRP induite par l’AITC (100 µM) et le CAP (1 µM) était fortement réduite conformément à la désensibilisation à l’échelle du corps observée dans les tests comportementaux (Fig. 5F, G, voir Fig. 4A-F) (n = 6).