En 1838, bien qu’il ne soit pas encore un officier de ligne de marine chevronné, Wilkes avait de l’expérience dans le travail de levé nautique et travaillait avec des scientifiques civils. Dans ce contexte, il a reçu le commandement de l’expédition d’exploration du gouvernement « … dans le but d’explorer et d’arpenter l’océan Austral, … aussi bien pour déterminer l’existence de toutes les îles et hauts-fonds douteux, que pour découvrir, et fixer avec précision, la position de ceux qui se trouvent dans ou près de la trajectoire de nos navires dans ce quartier, et qui ont échappé à l’observation des navigateurs scientifiques. »L’Escadron d’exploration américain a été autorisé par une loi du Congrès le 18 mai 1836.

L’expédition Exploratoire, communément appelée « Expédition Wilkes », comprenait des naturalistes, des botanistes, un minéralogiste, des taxidermistes, des artistes et un philologue, et elle était transportée par l’USS Vincennes (780 tonnes) et l’USS Peacock (650 tonnes), le brick USS Porpoise (230 tonnes), le navire-magasin USS Relief, et deux goélettes, l’USS Sea Gull (110 tonnes) et l’USS Flying Fish (96 tonnes).

Au départ de Hampton Roads le 18 août 1838, l’expédition s’arrêta aux îles de Madère et à Rio de Janeiro; visita la Terre de Feu, le Chili, le Pérou, l’archipel des Tuamotu, les Samoa et la Nouvelle-Galles du Sud; de Sydney navigua dans l’océan Antarctique en décembre 1839 et rapporta la découverte « d’un continent antarctique à l’ouest des îles Balleny » dont il aperçut la côte le 25 janvier 1840. Après avoir cartographié 1500 milles de côtes antarctiques, l’expédition a visité les Fidji et les îles Hawaïennes. Aux Fidji, l’expédition a enlevé le chef Ro Veidovi, l’accusant du meurtre d’un équipage de baleiniers américains. Et, en juillet 1840, deux marins, dont l’un était le neveu de Wilkes, l’aspirant Wilkes Henry, ont été tués alors qu’ils échangeaient de la nourriture sur l’île de Malolo aux Fidji. La rétribution de Wilkes fut rapide et sévère. Selon un vieil homme de l’île de Malolo, près de 80 Fidjiens ont été tués dans l’incident.

De décembre 1840 à mars 1841, il employa des centaines de porteurs hawaïens et beaucoup de ses hommes pour transporter un pendule jusqu’au sommet du Mauna Loa afin de mesurer la gravité. Au lieu d’utiliser le sentier existant, il a tracé son propre chemin, prenant beaucoup plus de temps que prévu. Les conditions sur la montagne lui ont rappelé l’Antarctique. Beaucoup de ses membres d’équipage ont souffert de cécité des neiges, de mal de l’altitude et de blessures aux pieds dues à l’usure de leurs chaussures.

Il a exploré la côte ouest de l’Amérique du Nord, y compris le détroit de Juan de Fuca, le détroit de Puget Sound, le fleuve Columbia, la baie de San Francisco et le fleuve Sacramento, en 1841.

Il organisa la première célébration du Jour de l’Indépendance américaine à l’ouest du Mississippi à Dupont, dans l’État de Washington, le 5 juillet 1841.

L’expédition d’exploration des États-Unis passa par les îles Ellice et visita Funafuti, Nukufetau et Vaitupu en 1841. L’expédition revient par les Philippines, l’archipel de Sulu, Bornéo, Singapour, la Polynésie et le cap de Bonne-Espérance, atteignant New York le 10 juin 1842.

Après avoir complètement encerclé le globe (c’était la dernière mission navale toute voile à le faire), Wilkes avait parcouru quelque 87 000 milles et perdu deux navires et 28 hommes. Wilkes fut traduit en cour martiale à son retour pour la perte d’un de ses navires sur le fleuve Columbia, pour les mauvais traitements réguliers de ses officiers subalternes et pour la punition excessive de ses marins. Un témoin majeur contre lui était le médecin de bord Charles Guillou.Il est acquitté de tous les chefs d’accusation, à l’exception de la punition illégale des hommes de son escadron. Pendant une courte période, il est attaché au relevé de la côte, mais de 1844 à 1861, il s’occupe principalement de la préparation du rapport de l’expédition.

Son Récit de l’expédition exploratoire des États-Unis (5 volumes et un atlas) a été publié en 1844. Il a édité les rapports scientifiques de l’expédition (19 volumes et 11 atlas, 1844-1874) et a été l’auteur du vol. XI (Météorologie) et vol. XXIII (Hydrographie).Alfred Thomas Agate, graveur et illustrateur, était le portraitiste et botaniste désigné de l’expédition. Son travail a été utilisé pour illustrer le Récit de l’expédition d’exploration des États-Unis.

Le Récit contient beaucoup de matériel intéressant concernant les mœurs, les coutumes, les conditions politiques et économiques dans de nombreux endroits alors peu connus. La carte de Wilkes de 1841 du territoire de l’Oregon est antérieure à la première expédition de pionnier des sentiers de l’Oregon de John Charles Fremont, guidée par Kit Carson en 1842.

Les trois rapports de James Dwight Dana sur les zoophytes (1846), la géologie (1849) et les Crustacés (1852-1854) constituent d’autres contributions précieuses. De plus, les spécimens et les artefacts ramenés par les scientifiques de l’expédition ont finalement constitué la base de la collection de la Smithsonian Institution. En plus de nombreux articles et rapports plus courts, Wilkes a publié les principaux travaux scientifiques de l’Amérique occidentale, dont la Californie et l’Oregon en 1849 et Voyage round the world: embracing the principal events of the narrative of the United States Exploring Expedition en un seul volume: illustré de cent soixante-dix-huit gravures sur bois en 1849, et Theory of the Winds en 1856.