Résultats

Caractérisation des cellules Dendritiques Plasmacytoïdes de l’Intestin grêle.

Nous avons appliqué des procédures standard pour isoler les cellules immunitaires situées dans l’épithélium (intraépithélial, c’EST-à-dire) et la LP de l’intestin. Dans les deux préparations cellulaires, nous avons trouvé une population distincte de cellules CD11c + B220 + Ly6C + qui représentaient jusqu’à 1% de toutes les cellules. Contrairement au pDC, les DC myéloïdes (m) (CD11c + MHCII + CD3-B220-Ly6C-− n’étaient présents qu’en très faible nombre dans la préparation IE (Fig. 1 Bis). Le pDC de la préparation LP et IE a montré de faibles niveaux d’expression superficielle du CMH de classe II (Fig. 1 Bis). Une analyse plus poussée a révélé que les cellules CD11c + B220 + Ly6C+ des deux préparations expriment uniformément les marqueurs pDC PDCA1 ainsi que 120G8 (Fig. 1 B). Les cytospines du pDC trié (CD11c + B220 + Ly6C+) et du DC myéloïde (mDC) de la préparation IE ont révélé une morphologie ronde et lisse de pDC ressemblant à une cellule plasmatique, tandis que le mDC a montré les dendrites caractéristiques (Fig. 1 C). Pour caractériser davantage la localisation de la pDC dans l’intestin, nous avons appliqué l’anti-B220, l’anti-120G8 et l’anti-CD3 mAb en immunohistologie. Les micrographies ont été prises au hasard à partir de coupes et, comme représenté à la Fig. 1 D, le positionnement des cellules 120G8 + B220 + CD3- a été déterminé par rapport aux cellules épithéliales en utilisant une analyse d’image (Analyse; Olympus, Hambourg, Allemagne). En évaluant le positionnement de ≈150 pDC, nous avons observé que 4,9% de ces cellules étaient clairement situées à l’intérieur de la couche cellulaire épithéliale alors qu’un autre 6,7% étaient situés à une distance de 5-10 µm de l’extrémité apicale des cellules épithéliales (Fig. 1 D). Ces données démontrent qu’une certaine quantité de pDC se situe à l’intérieur ou à proximité de l’épithélium intestinal, alors que > 80% des cellules analysées étaient positionnées à des distances > de 15 µm, ce qui les rend comme des cellules LP (Fig. 1 D). Étant donné que des nombres similaires de pDC étaient présents dans la préparation d’IE et de LP suivant les procédures d’isolement standard, il n’est actuellement pas clair si les pDC de la LP contaminent la préparation d’IE ou si la localisation des pDC dans l’épithélium est plus efficacement isolée. Parce que nous ne trouvons guère de mDC dans la préparation IE, nous privilégions cette dernière possibilité. Cependant, il reste à déterminer si les deux populations remplissent des fonctions différentes ou appartiennent à une population cellulaire commune. Étant donné que le pDC de la préparation d’IE, contrairement au pDC de la préparation de LP, peut être isolé par des procédures plutôt douces, exclusivement le pDC de la préparation d’IE a été utilisé pour les dosages fonctionnels dans cette étude.

Expression CCR9 sur la pDC intestinale.

Pour identifier les mécanismes moléculaires qui permettent la migration de la pDC vers l’intestin, nous avons analysé l’expression des molécules d’origine. Bien qu’il soit bien établi que l’intégrine aE (CD103) médie l’adhésion des lymphocytes aux cellules épithéliales de l’intestin, nous n’avons pas réussi à identifier l’expression de cette intégrine sur la pDC intestinale. De même, CCR7 (Fig. 1 E), essentiellement impliqué dans l’introduction des lymphocytes dans les organes lymphoïdes périphériques n’est pas exprimé par la pDC de l’intestin. En revanche, nous avons observé des niveaux élevés de CD18 (β2-intégrine) et des niveaux intermédiaires de α4β7 alors que ≈50% de pDC expriment des ligands P-sélectine (Fig. 1 E). Il est intéressant de noter que la grande majorité des pDC intestinaux ont exprimé des quantités élevées du récepteur de la chimiokine CCR9 (Fig. 1 E), alors que le mDC du LP a exprimé des niveaux non ou faibles de CCR9.

Expression CCR9 de pDC Isolée à partir de Différents Organes Lymphoïdes.

En considérant l’expression uniforme de CCR9 sur la pDC intestinale, nous avons analysé l’expression de CCR9 sur la pDC isolée d’organes lymphoïdes secondaires, y compris la rate, la LN drainante de la peau, la LN mésentérique et les plaques de Peyer (PP; Fig. 2a) et des thymocytes CD4+CD8+ utilisés, connus pour exprimer des taux élevés de CCR9, comme témoin positif (11); Fig. 2 B). Fait intéressant, seule une fraction de pDC présente dans l’un de ces organes exprimait CCR9 (Fig. 2a), alors que ≈95% du pDC isolé du BM portait ce récepteur (Fig. 2 C). La plupart des pDC BM expriment également CCR5 et CXCR3 alors que CCR2 n’est présent que sur environ 25% des cellules. CXCR4, connu pour retenir les cellules au BM, n’est que très faiblement exprimé (Fig. 2 C). Ensemble, ces données démontrent que les pDC sont équipés de divers récepteurs de chimiokines avant d’être libérés du BM. Cette caractéristique permet vraisemblablement de se diriger non seulement vers les lieux d’inflammation, mais également vers l’intestin non enflammé.

Analyse chimiotaxique du pDC expansé Flt3L.

Sur la base de la forte expression de CCR9 sur la BM et la pDC intestinale, nous avons comparé la capacité de migration de pDC et de mDC vers la chimiokine CCL25/TECK, qui est le seul ligand connu pour ce récepteur (12). La fréquence de pDC varie entre les différentes souches de souris et il est bien connu que, par example, les souris C57BL/6(B6) hébergent beaucoup moins de pDC que les souris 129SV (13). Cependant, quel que soit le contexte génétique, le nombre de pDC pouvant être isolés des tissus de souris est insuffisant pour effectuer des tests de chimiotaxie in vitro standard. Pour surmonter cette limitation, nous avons élargi la population de DC in vivo en implantant une lignée de cellules tumorales sécrétant du Flt3-L (B16-FL) chez des souris B6 pendant 14 jours (14).

Pendant cette période, le pourcentage de cellules CD11c+ présentes dans la rate est passé de 3% à 30-35 % (données non présentées). Quatre-vingt pour cent du pDC expansé in vivo a exprimé CCR9, avec des niveaux très similaires à ceux présents sur le pDC BM (Fig. 2c et Fig. 4c) alors que le mDC expansé in vivo n’exprimait que de faibles quantités de ce récepteur (SI Fig. 6B). Les pDC de la rate ont été enrichis par le tri des MACS CD11c+, ce qui donne une pureté de 95% pour les cellules CD11c+ contenant ≈15% de PDC Ly6C + B220+. Les tests de migration de transwell in vitro ont révélé une forte réponse chimiotactique de pDC à CCL25, ainsi qu’à CXCL9, un ligand pour CXCR3 et à CXCL12, qui est un ligand pour CXCR4. Seule une réponse faible a été observée envers CCL19, qui sert de ligand pour CCR7. mDC a montré peu de réponse chimiotactique vers CCL25 et CXCL9 et une réponse modérée vers CXCL12 et CCL19 (Fig. 3 Bis).

Réduction du nombre de pDC dans l’intestin grêle des Souris déficientes en CCR9.

Sur la base de ces observations, nous avons caractérisé la distribution du pDC chez des souris déficientes en CCR9. Nous avons trouvé des pourcentages similaires de pDC dans les poumons et le foie (SI Fig. 7) ainsi que dans les ganglions lymphatiques inguinaux et mésentériques alors que le nombre de pDC spléniques a été légèrement augmenté chez les souris CCR9-/-. En revanche, nous avons observé une > diminution de 90% de l’intestin et une réduction de 50% de PP pDC (Fig. 3 B).

Les pDC Migrent préférentiellement vers l’intestin grêle.

Sur la base des résultats décrits jusqu’à présent, il semblait probable que le pDC nécessite CCR9 pour atteindre l’intestin grêle. Pour prouver cette hypothèse, nous avons transféré de manière adoptive des cellules de donneurs B6 et CCR9−/- porteurs d’une tumeur sécrétant du Flt3-L pendant 14 jours. Sous l’influence de Flt3L, le pDC s’est développé dans une mesure similaire chez les souris B6 et CCR9−/− (Fig. 4 A et SI Fig. 8) et étaient indiscernables en ce qui concerne l’expression de CCR2, CCR5 et CXCR3 alors que CCR9 n’a été détecté que sur des pDC dérivés de B6 mais pas de donneurs déficients en CCR9 (Fig. 4 C). Sans autre purification, les splénocytes de ces donneurs ont été marqués par l’ester de N-succinimidyl diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (CFSE) et l’ester de N-succinimidyl de 5(6)-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement. Un mélange de cellules déficientes en poids et en CCR9, ajusté pour contenir un nombre égal de pDC, a été transféré i.v. chez des receveurs B6. Après 18 h de transfert, nous avons d’abord analysé la composition des cellules en POIDS transférées de manière adoptive présentes dans l’IE ainsi que dans la préparation de LP et avons remarqué que 54% et 25% de toutes les cellules récupérées de la fraction d’IE et de LP étaient respectivement des pDC (Fig. 4 B). Ces résultats démontrent que parmi les diverses populations cellulaires, le pDC a été transféré le plus efficacement dans l’intestin. Ces transferts concurrentiels ont également révélé que le pDC déficient en CCR9 est largement altéré dans sa capacité à se loger dans l’intestin, comme en témoigne le faible rapport de migration du pDC déficient en CCR9 par rapport au pDC en POIDS trouvé dans la préparation d’IE et de LP (Fig. 4 D). En revanche, les pDC déficients en CCR9 et en B6 ont migré avec une efficacité similaire vers les ganglions lymphatiques périphériques et mésentériques (Fig. 4 D). La nature du marquage cellulaire n’a eu aucun impact sur ces expériences car l’échange des colorants entre les cellules B6 et CCR9−/− a donné des résultats identiques (données non représentées). Bien que ces données démontrent clairement que le pDC nécessite le CCR9 pour un guidage efficace vers l’intestin, il convient de mentionner que les propriétés de trafic du pDC provenant de souris traitées au ligand Flt3 peuvent être différentes de celles présentes dans des situations physiologiques.

Les pDC Sont Recrutés dans l’Intestin Enflammé.

Parce qu’il est connu que le pDC joue un rôle important dans l’immunité anti-virale (4, 10), nous avons émis l’hypothèse que le pDC pourrait être recruté dans l’intestin lors de processus inflammatoires pour renforcer la défense de première ligne. La toxine cholérique (CT) est connue pour induire une inflammation intestinale lorsqu’elle est administrée par voie orale et il a été rapporté que dans les 2 h suivant l’application orale, le nombre de mDC recrutés transitoirement dans l’intestin augmente de 4 fois (15). Nous avons observé qu’en plus du mDC, les nombres de pDC augmentaient également de 3 fois lors de l’alimentation de souris B6 avec 10 µg de CT (Fig. 4 E). Il est intéressant de noter que la configuration expérimentale identique n’a jamais entraîné d’augmentation de pDC ni dans l’IE ni dans la préparation de LP de souris déficientes en CCR9 après 1, 2 ou 3 h de traitement CT (Fig. 4 E et données non représentées). L’exigence spécifique de CCR9 sur pDC pour leur recrutement dans l’intestin au cours des processus inflammatoires a été confirmée par un transfert adoptif de pDC déficient en WT et en CCR9 à des receveurs déficients en CCR9 suivi d’une application de CT comme décrit ci-dessus. Alors que les pDC en POIDS transférés par adoption étaient largement présents dans la préparation d’IE et de LP, les pDC déficients en CCR9 étaient presque complètement exclus de ces compartiments (Fig. 4 F). Ensemble, ces résultats montrent que lors d’événements inflammatoires, le pDC peut être recruté sur la muqueuse intestinale et que ce mécanisme repose largement sur le CCR9.

Un rôle de la pDC intestinale pour la Mobilisation rapide de la DC myéloïde LP.

Il a été montré récemment que l’application orale du ligand resiquimod TLR7/8 (R848) entraîne une mobilisation rapide du LP DC et que le TNFa, éventuellement libéré par le pDC, est impliqué dans ce processus (16). Nous avons donc émis l’hypothèse que le pDC intestinal pourrait être la source du TNFa qui déclenche potentiellement la mobilisation du mDC voisin. Pour tester cette hypothèse, nous avons stimulé in vitro le pDC B6 de la préparation IE et LP pendant 16 h avec R848. En effet, le pDC a sécrété des quantités considérables de TNFa mais n’a produit aucune quantité détectable d’IL-2, IL-4, IL-5 ou IFNy (Fig. 5 Bis). Nous avons ensuite analysé la mobilisation de LP mDC in vivo après application orale de R848. Alors que les souris B6 et CCR9-/- non traitées ne différaient pas en ce qui concerne la présence de mDC intestinale (Fig. 5 B), en 2 h de R848 par voie orale, a induit la mobilisation de ≈60% de mDC en POIDS mais seulement 10,8% chez les souris CCR9−/−. Il est important de noter qu’une fois que des souris déficientes en CCR9 i.v. ont reçu un pDC splénique de donneurs WT traités par Flt3L 16 h avant l’application orale de R848, ce déficit de mobilisation intestinale du mDC a pu être complètement sauvé (Fig. 5 C). Ces expériences montrent qu’un homing de pDC dépendant du CCR9 dans l’intestin est impliqué dans la mobilisation rapide de la mDC intestinale après application orale d’un ligand TLR7 / 8. Parce qu’il a été démontré par d’autres dans le modèle chez le rat que l’application de LPS induit également la mobilisation de LP mDC (17), nous avons appliqué 50 µg de LPS i.p. aux animaux déficients en poids et en CCR9. Il est intéressant de noter que dans ces conditions expérimentales, nous n’avons observé aucune différence entre les animaux déficients en poids et en CCR9 concernant la mobilisation de la LP mDC (SI Fig. 9).