La carotte (Daucus carota) est une plante bisannuelle assaisonnée en hiver qui est cultivée pour sa racine pivotante comestible. C’est l’un des légumes les plus consommés et les plus produits en raison de sa variété alimentaire en couleur, saveur, fibres et vitamine A, ainsi que de sa consommation sous forme crue et cuite. Plus de 20 millions de tonnes sont produites chaque année pour la consommation humaine.

Les pratiques de culture tissulaire ont été très populaires dans le clonage des plantes. La première étude de la culture de tissus de carottes a été rapportée en 1939 par Gautheret et Nobecourt. Cependant, Steward et coll. et Reinert a rapporté la première étude de « l’embryogenèse de la carotte »; ils ont essayé de faire pousser les racines en utilisant des cultures de suspension cellulaire et de cals.

L’embryogenèse somatique est une méthode efficace pour comprendre et étudier les aspects biochimiques, physiologiques et génétiques de la culture de cellules végétales.

De nombreuses études sur la culture de tissus de carottes ont conduit au développement d’une méthode simple d’embryogenèse chez les carottes. Selon la méthode, la croissance des cultures de carottes peut être induite par le simple retrait de l’hormone 2,4-D des cultures de suspension cellulaire. Maintenant, la carotte est souvent utilisée comme modèle expérimental pour l’analyse de l’embryogenèse somatique dans divers laboratoires du monde entier.

Matériel et équipement nécessaires à l’établissement de la Culture

Matériaux stérilisés

• 5 Culture de cals friables de carottes, non contaminées et maintenues à 25 ℃.
• 5 flacons Erlenmeyer (250 ml), contenant du milieu de culture avec 5 x 10-8 g /ml 2, 4-D.
• 5 cylindres de mesure (100 ml) avec bouchons en aluminium.
• 2 spatules.
• 25 feuilles de papier d’aluminium (100 x 100 mm).
• 2 morceaux de tamis en nylon ou en acier inoxydable d’une porosité de 250 µm, qui peuvent être insérés dans l’ouverture des cylindres de mesure.
• 5 boîtes de pétri.

Matériaux non stérilisés

• Stylo de marquage étanche
• Agitateur rotatif
• Brûleur Bunsen
• 1 flacon Erlenmeyer (150 ml) contenant 95% d’éthanol
• Parafilm

Procédure d’initiation et d’établissement de la Culture

1. Prélever les tubes de culture de cal, stériliser la bouche des 5 tubes et transférer le cal dans la boîte de Pétri séparément (5 calli dans 5 boîtes de Pétri).
2. Prendre un flacon canonique de 250 ml contenant le milieu de culture et 2, 4-D.
3. Transférez les 5 calli de la boîte de Pétri dans 5 flacons canoniques, séparément.
4. Enflammer/stériliser l’embouchure des flacons et les recouvrir du bouchon. Fixez le capuchon à l’aide d’un parafilm.
5. Placez tous les flacons contenant la culture sur la machine à secouer rotative dans une intensité lumineuse sombre ou faible à 25 ℃.
6. Après 7 jours, transférer les flacons du shaker dans une pièce stérile.
7. Retirer le parafilm et le capuchon de chaque flacon et enflammer/stériliser l’embouchure des flacons.
8. Transférer séparément la suspension de chaque flacon dans un cylindre stérile de 100 ml en la passant au tamis.
9. Laisser reposer le contenu pendant 10 minutes, puis jeter le surnageant.
10. Transférer les résidus de cellules laissées dans le cylindre de mesure dans un ballon de 250 ml contenant 60 ml de milieu frais.
11. Répétez l’étape 10 pour chaque flacon de culture.
12. Remettez les cinq flacons sur le shaker.
13. Après 7 jours, répétez la procédure que vous avez effectuée auparavant (de l’étape 6 à 10). Cependant, cette fois, ne prenez que 1 / 5ème des cellules résiduelles comme inoculum.
14. Répétez la procédure environ 3-4 fois. Ce faisant, seules des cellules individuelles ou de petits agrégats resteront dans la suspension de carottes.
15. Pour la suspension de cellules de carotte, le nombre de cellules appropriées varie entre 105 et 3 x 105 cellules / ml ou 100 et 300 mg (poids frais) d’inoculum dans un volume de 60 ml de milieu frais contenant des milieux et 5×10-8 g / ml, 2,4-D.
16. Une période de transfert de 7 jours est appropriée pour que la carotte obtienne des cellules uniques dans la culture en suspension.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Voici quelques points à retenir tout en notant vos résultats.

• Date et durée de l’expérience.
• Le nombre de cultures et de traitements appliqués.
• Enregistrez la morphologie et le nombre de cultures infectées à un intervalle de trois semaines.
• Déterminer le PCV (volume cellulaire emballé) au début et à la fin du transfert de la culture.
• Estimez le nombre total de cellules après 3 sous-cultures, aux jours 1, 2, 4 et 7, et tracez un graphique en fonction du temps.
• Étudiez la relation entre la densité de l’inoculum et le modèle de croissance.

La culture en suspension présente un avantage par rapport aux autres cultures car elle permet le mouvement du tissu dans le milieu de culture, ce qui facilite les échanges gazeux. En outre, il supprime toute polarité du tissu et du gradient nutritif à l’intérieur et au niveau des milieux.

Application de Culture tissulaire pour la Carotte

1. Pour cloner les racines pivotantes.
2. Pour étudier la forme mutante des carottes.
3. Étudier les réponses physiologiques de la carotte qui peuvent également faciliter la compréhension d’autres plantes.
4. Pour étudier la croissance et le développement de la carotte à partir d’une cellule unique.
5. Pour étudier la réponse au stress de la carotte qui fournit également un aperçu des réponses d’autres plantes.
6. Pour générer des centaines de plantes transgéniques à partir de la suspension de cellules uniques à des fins expérimentales.

1. Reinert J. et Yeoman M. M. (1982). Culture de cellules et de tissus végétaux: Manuel de laboratoire. La société Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York.
2. Hardegger M., Shakya R. (2004) Transformation de la carotte. Dans: Curtis I.S. (eds) Cultures transgéniques du monde. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22.
3. Croissance et division des cellules de carottes en culture en suspension. (1970). Physiologie végétale et cellulaire. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.PCP.a074564.
4. https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot -…