Séquençage automatisé de l’ADN par électrophorèse capillaire
La séparation des produits d’une réaction de séquençage didéoxy marquée radioactivement ou fluorescente s’est historiquement faite dans un gel de dalle de poly-acrylamide, par example du type utilisé dans un ABI 377 à 96 voies. Les inconvénients de cette méthode incluent la nécessité de préparer un gel frais pour chaque cycle de séquençage, le chargement manuel des échantillons dans le gel, des temps de traitement relativement longs (8 à 10 heures pour la résolution d’un fragment d’ADN de 1 Ko) et des difficultés de suivi automatisé et / ou manuel des voies.
Une méthode de séparation alternative utilise l’électrophorèse capillaire. Une série de réactions standard de séquençage de l’ADN didéoxy sont préparées, chacune dans un puits d’une plaque de 8 rangées x 12 colonnes à 96 puits. Une série de tubes capillaires ultra-minces (0.alésage intérieur de 1 mm, longueur de 50 à 80 cm) sont remplis d’un mélange de billes de résine et placés dans un réseau multi-capillaires. Une extrémité du réseau est montée dans une plaque de cathode chargée négativement de sorte que leurs extrémités s’alignent avec chaque puits de la plaque d’échantillon. L’application d’une haute tension fait que l’ADN marqué dans chaque puits d’échantillon pénètre dans le capillaire correspondant et migre vers le réservoir d’anode chargé positivement. En raison des tensions élevées utilisées, la séparation électrophorétique ne nécessite que 1 à 3 heures. Comme dans l’électrophorèse sur dalle-gel, les fragments plus petits se déplacent plus rapidement que les plus gros. Les colorants d’étiquette d’extrémité sont activés par un laser dans la fenêtre du détecteur, et la longueur d’onde de fluorescence de chaque fragment est lue par un photomètre lorsqu’il passe un point fixe. Contrairement au système de gel de dalle, le laser et le photomètre sont fixes et immobiles, et peuvent activer et lire simultanément plusieurs capillaires côte à côte en tant que flux de données séparés: cela évite le problème de suivi de voies séparées dans un gel de dalle. Des données de mobilité sont envoyées à un ordinateur, et un chromatogramme est généré pour chaque échantillon qui est essentiellement identique à ceux du système de gel de dalle.
Les séquenceurs capillaires utilisent généralement un robot pour charger automatiquement une pile de plaques d’échantillons. Le réseau capillaire est rincé avec un tampon entre les plaques, de sorte que la machine peut être laissée sans surveillance pendant de nombreuses courses. Dans les plus grandes installations, les réactions de PCR peuvent également être liées directement aux plaques de séquençage dans des postes de travail robotisés qui desservent des dizaines ou des centaines de séquenceurs capillaires. Les données du chromatogramme sont placées sur un serveur et peuvent être téléchargées par des utilisateurs à des centaines ou des milliers de kilomètres. Les économies d’échelle peuvent rendre moins coûteux l’externalisation du séquençage de l’ADN plutôt que l’achat, la maintenance et la dotation en personnel d’une machine interne.
