keuhkojen etäpesäkkeiden Sarjapäästäminen in vivo rikastuttaa metastaattisen potentiaalin
PDX-linja WU-BC3 syntyi liittämällä rintasyöpäkasvainsoluja potilaalta, jolla oli metastaattinen TNBC: n humanisoituihin nisäkäsrasvatyynyihin (MFPs) NOD/SCID mice-hiiriä.26,27 me suunniteltu nämä kasvainsolut vakaasti ilmaista Click Beetle Red Luciferase (CBR-Luc), mCherry, ja shRNA erityinen p53 (shA2) luoda PDX linja BC3_A2 (aiemmin tunnettu nimellä BC3-p53KD28) (täydentävä Kuva. 1 A). Osoitimme, että kasvainsolut etäpesäkkeitä MFPs fysiologisesti merkityksellisiä sivustoja kuten keuhkojen, maksan, luun, Aivot, ja imusolmukkeet.28 keuhkometastaasia (P0) eristettiin replikoituneista hiiristä, yhdistettiin ja yhdistettiin Vastaanottajahiirien Monitoimihiiriin. Tuloksena saadut keuhkometastaasit (P1) eristettiin, yhdistettiin ja yhdistettiin ylimääräisten hiirien MFP: iin. Näiden hiirten keuhkometastaaseja (P2) kerättiin myös ja yhdistettiin (täydentävä viikuna. 1b). Suoritimme bioluminesenssi kuvantaminen (BLI) keuhkojen, luut, ja maksa ruumiinavauksessa kvantifioida suhteellinen suuruus etäpesäkkeiden kunkin passage (täydentävä Kuva. 1c). Serial passaging rikastettu kasvainsolujen Lisääntynyt kapasiteetti metastasize kaikille sivustoille (täydentävä Kuva. 1d-f, h)ja vaadittiin hiiriä lopetettavaksi aikaisemmin (täydentävä Kuva. 1). Sen sijaan, sarja passaging kasvaimia välillä MFPs ei johtanut lisääntyneeseen keuhkojen etäpesäke(täydentävä Kuva. 1g), mikä viittaa siihen, että lisääntyneen metastaattisen kapasiteetin hankkiminen ei ollut pelkästään seurausta sarjatason läpäisevistä kasvaimista in vivo. Lisäksi kasvainsolut, joilla on parannettu metastaattinen kapasiteetti, eivät osoittaneet merkittävää kasvua kasvuominaisuuksissa, kun ne eristettiin monitoimilaitteista ja sijoitettiin takaisin Vastaanottajahiirien monitoimilaitteisiin (täydentävä Kuva. 1J). Yhdessä, nämä tulokset osoittavat, että sarja passaging kasvainsolujen keuhkoista MFPs tässä mallissa rikastaa metastasoituneen potentiaalin, mutta ei Elinkohtainen homing.
mesenkymaalisen geenin ekspressio vähenee keuhkometastaaseissa verrattuna MFP-kasvaimiin
tunnistaaksemme muutokset geenin ilmentymismalleissa, jotka liittyvät etäpesäkkeisiin, suoritimme RNA-sekvensoinnin (rnaseq) keuhkojen etäpesäkkeisiin (P0 ja P2) ja MFP (P0 ja P2) – kasvaimiin (Fig. 1a ja täydentävä Taulukko 1). Kun rnaseq lukee kartoituksen hiiren transkriptomiin, jatkoanalyyseissä käytettiin vain ihmisen transkriptiolukuja. Pääkomponenttianalyysi (PCA) paljasti vähentyneen epäsovun biologisten rinnakkaisnäytteiden välillä toistuvilla läpäisyillä in vivo, koska P2-kasvainnäytteiden biologiset toisinnot ryhmittyivät tiiviimmin toistensa kanssa kuin muiden analysoitujen alapopulaatioiden kanssa (kuva. 1b). Geeni Set Rikastusanalyysi (GSEA) paljasti, että EMT oli merkittävin downregulated reitti sekä P0 ja P2 keuhkojen etäpesäkkeitä suhteessa MFP kasvaimia (Fig. 1c). TGF-β-signalointi, joka säätelee EMT: tä, oli myös merkittävästi alaspäin sekä P0-että P2-keuhkojen etäpesäkkeissä(Kuva. 1c).
PDX-keuhkojen etäpesäkkeet tunnistavat etäpesäkkeissä säädeltyjä geenejä. Kaavamainen esitys MPF-kasvaimista ja keuhkojen etäpesäkkeistä, jotka on eristetty rnaseq: lle. b Pääkomponenttianalyysit (PCA) tässä tutkimuksessa käytetyistä MFP-kasvaimista ja keuhkometastaaseista tuotetuista RNAseq-tiedoista. Jokainen datapiste edustaa yhtä näytettä yksittäisestä hiirestä. c gsea-reittianalyysi rikastetusta keuhkojen etäpesäkkeestä (P2); top 5 alas (sininen)- ja ylös (punainen)säännellyt prosessit on esitetty. NES, normalisoitu rikastusaste. Ruuduissa FDR <0.1 tilastolliselle merkitsevyydelle. Oikeanpuoleisessa paneelissa esitetään väkevöintikäyrät epiteelin mesenkymaaliseen siirtymälle (EMT) ja TGF-β-signaloinnille P0: lle ja P2: lle. p < 0, 001 EMT: lle ja TGF-β-signaloinnille P0: ssä ja P2: ssa. d QRT-PCR analysis of vimentin expression in bc3_a2 MFP tumors and metastasated subpopulations isolated from lung. Parilliset t-testit, p = 0, 02 P0-keuhkoille, p < 0, 001 P2-keuhkoille. Jokainen datapiste edustaa yhtä hiirtä. Virhetangot edustavat biologisten toisintojen SEM: ää. KS.myös täydentävä Kuva. 2. IHC-värjäys tehtiin ilmoitetuille kudososille käyttäen vasta-ainetta, joka tunnisti vimentiinin ihmisaspesifisen muodon. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. F vesiputous juoni osoittaa ilmentymistä EMT geenien P0 ja P2 keuhkojen etäpesäkkeitä verrattuna vastaaviin MFP kasvaimia. p-arvot on esitetty täydentävässä taulukossa 1. Rnaseq-analyyseissä
kvantitatiivinen reaaliaikainen (qRT-PCR) suoritettiin VIMENTIININ, mesenkymaalimarkkerin, ilmentymisen seuraamiseksi MFP-kasvaimissa ja keuhkometastaaseissa koko sarjan läpäisyn ajan. Vimentin expressionilla oli dynaaminen kuvio, jolla oli suurempi ilmentymä MFP-kasvaimissa suhteessa vastaaviin keuhkometastaaseihin kussakin kohdassa (Kuva. 1d) ja maksan etäpesäkkeisiin P0: ssä (täydentävä Kuva. 2 a). Vimentinin proteiinitasot kertasivat tämän dynaamisen kuvion (Kuva. 1 e). Myös muita EMT-geenejä säädeltiin keuhkojen etäpesäkkeissä suhteessa vastaaviin MFP-kasvaimiin (Kuva. 1). Mesenkymaalimerkin CDH2 (n-cadherinia koodaava geeni) ilmentyminen noudatti samaa kaavaa kuin vimentin (täydentävä viikuna. 2B), kun taas epiteelin merkkiaineen CDH1 (e-cadherinia koodaava geeni) ilmentyminen esiintyi käänteisessä suuntauksessa (täydentävä Kuva. 2c). Ihmisen stroomafibroblastit puhdistuivat kasvainsadon aikaan mennessä (täydentävä viikuna. 3a-f), sulkien pois sen mahdollisuuden, että ne edistivät mesenkymaalisten markkereiden ilmentymistä MFP-kasvaimissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvaimet downregulate ilmentymistä mesenkymaalinen geenien kerran perustettu metastaattinen sivustoja.
kirjaston monimutkaisuuden määrittäminen toimintonäytön suuritehoiselle vahvistukselle
suuritehoinen toimintonäyttö (Gof)-näyttö suunniteltiin tunnistamaan toiminnalliset etäpesäkkeiden ajurit P2-keuhkoetäpesäkkeistämme. Etäpesäkkeiden kuljettajana tunnettu HOXA1, 29 toimi positiivisena kontrollina näytön optimoinnissa ja GFP: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Bc3_a2 solut transduced kanssa lentivirus koodaus joko HOXA1 tai GFP, ja tartunnan kasvainsolut sekoitettiin eri suhteissa (täydentävä Kuva. 4 A). Sekapopulaatiot kasvainsolujen sitten engrafted osaksi MFP vastaanottajahiiret, ja BLI käytettiin pisteet keuhkojen etäpesäkkeitä aikaan ruumiinavaus (täydentävä Kuva. 4b). Toisessa kokeissa metastasoitunutta kuljettajaa ID19 käytettiin yhdessä GFP: n kanssa, mutta tässä tapauksessa kasvainsolujen sekapopulaatiot ruiskutettiin vastaanottajahiirien häntälaskimoon mallintamaan etäpesäkkeiden loppuvaiheita (täydentävä Kuva. 4c). Merkittävä fotonivuon lisääntyminen havaittiin kasvaimista, joiden HOXA1: GFP-tai ID1:GFP-suhde oli 1: 10. Nämä monimutkaisuus testit osoittivat, että bona fide etäpesäke kuljettaja voitaisiin havaita meidän näyttö, jos yhdistetty 9 ei-kuljettaja avoin lukukehyksiä (ORFs), mutta pool yhden kuljettajan kanssa 19 ei-kuljettajat peitti kykymme havaita kuljettaja. Näiden tulosten perusteella rajoitimme allaskokomme 12 ORF: iin.
korkean suoritustehon gain-of-function-seulonta in vivo tunnistaa TNBC: n etäpesäkkeiden
ehdokkaat toiminnalliset ajurit selvittääksemme, mitkä P2: n keuhkojen etäpesäkemerkinnän yläsäädetyistä geeneistä kykenivät ajamaan keuhkojen etäpesäkkeitä, suunnittelimme mukautettuja viivakoodattuja lentiviraalisia kirjastoja, jotka koodaavat 230: n etäpesäkkeissä eniten yläsäädettyjä geenejä. ORF: t ilmaistiin yksittäin bc3_a2-soluina siten, että jokainen solulinja ilmaisi yhden ORF: n, solut yhdistettiin sitten 12: n ryhmiksi ja poolit istutettiin vastaanottajahiirien (n = 10 hiirtä poolia kohti, Fig. 2 a). Jokaisessa poolissa oli GFP: tä ilmentävä kontrolliplasmidi, jolla mitattiin tässä TNBC-mallissa luontaista etäpesäkettä. Jokaiseen ORF: ään liittyi yksilöllinen DNA-viivakoodi. Yhdistetyistä soluista koostuva vertailuselletti jäädytettiin, jotta voitiin varmistaa, että jokainen ORF oli yhtä edustava kasvaimen implantointihetkellä. Kolmetoista viikkoa valittiin tutkimuksen päätetapahtumaksi, koska HOXA1, mutta ei GFP: tä ilmentävät kasvaimet, metastasoituivat keuhkoon tässä vaiheessa (täydentävä Kuva. 5 a). Kolmetoista viikkoa engraftment, keuhkot altistettiin BLI ex vivo (Supplementary Fig. 5A), metastaattinen leesiot eristettiin, ja genomien DNA (gDNA) uutettiin ja käytetään mallina qPCR monistaa ainutlaatuinen viivakoodi alueet liittyvät kunkin ORF (täydentävä Kuva. 5b). Myös MFP-kasvaimia eristettiin ja niille tehtiin nämä analyysit (Fig. 2 a). Kunkin viivakoodatun ORF: n edustus suhteessa vertailunäytteeseen määritettiin kullekin poolille (Kuva. 2b; täydentäviä viikunoita. 5c, d). Edustus keuhkoissa normalisoitiin sitten rikastukseksi monikäyttöisissä yksiköissä vs. viite (Kuva. 2b, c). Etäpesäkkeet kuljettajat jaotellaan kolmeen ryhmään, mukaan lukien rikastettu molemmissa keuhkoissa ja MFPs (Kuva. 2b, yläoikealla kvadrantti ja täydentävä Kuva. 5c), jotka on rikastettu yksinomaan monitoimilaitteilla (Kuva. 2B, alempi oikea kvadrantti) ja yksinomaan keuhkoissa rikastetut (Kuva. 2b, vasemmassa yläneljänneksessä ja Kuvassa. 2c). GFP: tä ilmentävät solut rikastuivat keuhkometastaaseissa joissakin altaissa ja GFP: n keskimääräinen rikastumispistemäärä keuhkoissa oli noin 5 (täydentävä Kuva. 5 e). Siksi käytimme tätä rikastumispisteen katkaisuna määritelläksemme todellisen osuman näytöllämme ja tunnistimme 44 geeniä, jotka rikastuivat valikoivasti keuhkojen etäpesäkkeissä suhteessa ensisijaisiin kasvaimiin. Nämä osumat rankattiin rikastuspisteillä (Kuva. 2c ja täydentävä Taulukko 2). Viiden suurimman osuman joukossa CEACAM5 oli ainoa, jonka ilmentymän primaarisissa kasvaimissa havaittiin ennustavan huonoa selviytymistä rintasyöpäpotilailla (Supplementary Fig. 6 A). Siksi selvitimme edelleen CEACAM5: n toiminnallista roolia rintasyövän etäpesäkkeissä.
korkean suoritustehon gain-of-function-seulonta in vivo tunnistaa funktionaalisia etäpesäkkeitä aiheuttavia tekijöitä. kaavamainen kuvaava muoto, jota käytetään gain-of-function (GOF) – näytölle. KS.myös täydentävä Kuva. 5. ORF, avaa lukukehys. Kuhunkin kohorttiin istutettiin kymmenen hiirtä. b Hajontakaavio, joka osoittaa kunkin ORF: n suhteellisen edustuksen MFP-kasvaimissa normalisoinnin jälkeen referenssiin (x-akseli) ja keuhkoissa suhteessa MFP-kasvaimiin (y-akseli). QPCR-tietojen kvantifiointiin käytettiin ΔΔCT-menetelmää. CEACAM5 on merkitty punaisella. keuhkojen etäpesäkkeissä rikastetut C-geenit, mutta ei MFP-kasvaimia, asetettiin alenevaan rikastumisjärjestykseen keuhkoissa. Katkoviiva osoittaa rikastuksen pisteet cutoff. KS.myös täydentävä Kuva. 5 ja täydentävä Taulukko 2
tehostetun CEACAM5: n ilmentymisen vahvistus ylimääräisissä metastasoituneissa PDX-malleissa
havaitsimme, että CEACAM5: n ilmentymistä säädeltiin dynaamisesti, koska metastasoituneet alapopulaatiot siirtyivät sarjamaisesti keuhkojen ja MFP: n välillä in vivo (Kuva. 3a), jossa vahvistetaan rnaseq: n havainnot (täydentävä Taulukko 1 ja täydentävä Kuva. 6b). Vastaavasti CEACAM5: n ilmentyminen oli suurempi maksassa (täydentävä viikuna. 7a)ja aivot (täydentävä Kuva. 7b) etäpesäkkeet suhteessa vastaaviin MFP-kasvaimiin. CEACAM5-proteiinipitoisuudet olivat myös korkeammat keuhkometastaaseissa verrattuna MFP-kasvaimiin (Kuva. 3b). Ceacam5: n ekspression lisääntyminen metastaattisissa leesioissa ei ollut riippuvainen p53: n hiljentymisestä tässä PDX-linjassa, koska isogeenisen PDX-linjan keuhkometastaaseissa,jotka ilmentävät villiä tyyppiä p5326, 30, esiintyi myös korkeampia ceacam5: n ilmentymistasoja (täydentävä Kuva. 7c).
CEACAM5 on ylisääntynyt etäpesäkkeissä, ja sen ilmentyminen korreloi kääntäen vimentiinin kanssa TNBC: n PDX-malleissa. CEACAM5: n ilmentyminen MFP-kasvaimissa ja bc3_a2-kasvaimilla peitettyjen hiirten metastaattisissa leesioissa määritettiin QRT-PCR: llä. Parilliset t-testit, p < 0.001 P0-keuhkoille, P2-MFP-kasvaimille ja P2-keuhkoille. Jokainen piste edustaa yksittäistä hiirtä. Virhetangot edustavat biologisten toisintojen SEM: ää. KS.myös täydentävä Kuva. 7. IHC analysoi BC3_A2-kasvaimilla peitettyjen hiirten MFP-kasvaimet ja vastaavat etäpesäkkeet CEACAM5-vasta-aineen avulla. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. C Ceacam5: n ilmentyminen PIM001-P-kasvaimilla peitettyjen hiirten MFP-kasvaimissa ja metastaattisissa leesioissa määritettiin QRT-PCR: llä. Tiedot esitetään lokiasteikolla. Pari t-testi, p < 0,001. Jokainen piste edustaa yksittäistä hiirtä. Virhetangot edustavat biologisten toisintojen SEM: ää. IHC analysoi PIM001-P-kasvaimilla peitettyjen hiirien MFP-kasvaimet ja vastaavat keuhkometastaasit CEACAM5-vasta-aineen avulla. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. e, f IHC sellaisten hiirten sarjamuotoisten kasvainkudososioiden määrä, joihin on lisätty bc3_a2 (e)-tai PIM001-P (f) – entsyymiä ja jotka on värjätty CEACAM5: lle (yläpaneeli) tai vimentinille spesifisillä vasta-aineilla. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. g ilmentymä CEACAM5 (yläpaneeli) tai vimentin (alapaneeli) määritettiin paneeli rintasyövän solulinjat. Virhetangot edustavat teknisten kolmikappaleiden SEM: ää. h IHC suoritettiin fosforyloituneen p38: n seuraamiseksi BC3_A2-hiirten MFP-kasvaimissa ja keuhkometastaaseissa. Asteikkotangot osoittavat 100 µm
toisen sarjan TNBC: n (PIM001) PDX-malleja arvioitiin sen määrittämiseksi, oliko ceacam5: n lisääntyminen metastaattisissa leesioissa yleinen metastaasin ominaisuus. PIM001-P määritettiin metastasoitunutta TNBC: tä sairastavan potilaan aiemmin hoitamattomasta primaarikasvaimesta, kun taas PIM001-M määritettiin saman potilaan ihometastaasista. PIM001 – P: n kasvainsolut suunniteltiin ilmaisemaan sekä CBR-Luc että mCherry, minkä jälkeen ne yhdistettiin vastaanottajahiirien monitoimilaitteisiin. Ruumiinavauksen aikaan eristettiin MFP-kasvaimia ja keuhkometastaaseja. CEACAM5-ilmaisua lisättiin molemmilla mRNA-tasoilla (Kuva. 3c)ja proteiinipitoisuudet (Kuva. 3d) PIM001-P: n keuhkometastaaseissa verrattuna vastaaviin MFP-kasvaimiin. Mielenkiintoista, CEACAM5 proteiini tasot olivat korkeammat PDX MFP kasvaimia perustettu potilaan ihon etäpesäke (PIM001-M) verrattuna PDX MFP kasvaimia perustettu hänen ensisijainen rintojen kasvain (PIM001-P) (täydentävä Kuva. 7d). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ceacam5: n nousu on yhteinen ominaisuus etäpesäkkeille TNBC: n PDX-malleissa.
CEACAM5: n ekspressio korreloi kääntäen vimentinin ekspression ja P38: n fosforylaation
kanssa, koska CEACAM5: n ilmentyminen PDX-malleissa korreloi kääntäen vimentiinin (Figs. 1D, 3a; täydentäviä viikunoita. 2A ja 7A, b), immunohistokemiaa (IHC) käytettiin keuhkoetäpesäkkeiden ja MFP-kasvainten seurantaan vimentiinin ja CEACAM5: n suhteellisten pitoisuuksien osalta. Proteiinitasot korreloivat mRNA-tasojen kanssa molemmissa PDX-malleissa (Kuva. 3 e, f). Vimentinin ilmentymä korreloi myös käänteisesti ceacam5: n ilmentymisen kanssa rintasyöpäsolulinjojen paneelissa (Kuva. 3g). Seriini / treoniinispesifinen proteiinikinaasi p38alpha (tunnetaan myös nimellä MAPK14, jäljempänä p38) fosforyloituu EMT: n aikana.31 mielenkiintoista, fosforyloitu (aktiivinen) p38 korreloi vimentiinin korkeisiin ilmentymistasoihin MFP-kasvaimissa ja P38 fosforylaatio väheni keuhkojen etäpesäkkeissä, joissa vimentiinipitoisuudet olivat alhaiset (Kuva. 3T). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että CEACAM5: n ilmentyminen korreloi käänteisesti EMT-merkkiaineiden ilmentymisen kanssa keuhkoetäpesäkkeissä.
Ceacam5: n kohdunulkoinen ylituotanto estää TGF-β-signalointia ja EMT-merkkiaineiden ilmentymistä
ottaen huomioon, että CEACAM5: n ilmentyminen korreloi kääntäen mesenkymaalisen tilan kanssa, arvioimme, oliko CEACAM5: llä suora rooli mesenkymaalisten markkereiden ilmentymisen säätelyssä. Bc3_a2 soluja suunniteltu ylituotantoon ihmisen CEACAM5 tai GFP negatiivisena kontrollina(täydentävä Kuva. 8a, b) tutkittiin vimentiinin ja CDH2/n-cadherinin (mesenkymaalimerkkiaineet) ja CDH1/E-cadherinin (epiteelimarkkeri) ilmentymisen varalta. CEACAM5: n yliekspressio johti CDH1: n lisääntyneeseen ilmentymiseen (Supplementary Fig. 8c)ja cdh2: n vähentynyt ilmentymä (täydentävä Kuva. 8d) ja vimentinin (Supplementary Fig. 8 e). Lisäksi CEACAM5: n ylituotanto vähensi ja viivästytti TGF-β-välitteistä Smadien fosforylaatiota bc3_a2-soluissa (Kuva. 4a, c, täydentävä Kuva. 9a)ja P38 fosforylaatio molemmissa bc3_a2 soluissa (Kuva. 4a, b, täydentävä Kuva. 9a) ja MDA-MB-231-kennot (täydentävä Kuva. 8f, täydentävä Kuva. 2 artikla Lopuksi, CEACAM5: n viivästyneen TGF-β-indusoidun EMT: n ylituotanto e-cadherinin ja vimentinin ilmaisun arvioimana (Kuva. 4D, täydentävä Kuva. 9c). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CEACAM5 säätelee negatiivisesti EMT: tä ja tunnistaa CEACAM5: lle tehtävän rintasyövän etäpesäkkeissä.
CEACAM5 ylituotanto heikentää mesenkymaalisten markkereiden ilmentymistä ja heikentää TGF-β-signalointia ja heikentää TGF-β-signalointia. BC3_A2-soluja, jotka oli suunniteltu tuottamaan liikaa CEACAM5: tä tai GFP: tä, viljeltiin 1 ng/ml TGF-β: n läsnä ollessa tai ilman sitä ilmoitettujen ajanjaksojen ajan. Solujen lysaateille tehtiin Western blottaus merkittyjen proteiinien osalta. B, c-Histogrammi näyttää P38 (b): n tai Smad2/3 (c): n fosforylaatiotilassa tapahtunutta kertamuutosta (log-asteikko) verrattuna GFP: tä ilmentävien solujen osalta aikaan 0. Virhepalkit edustavat SEM: ää vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. d BC3_A2 soluja, jotka ilmentävät GFP: tä tai CEACAM5: tä, viljeltiin 1 ng/ml TGF-β: n läsnä ollessa tai ilman sitä ilmoitettujen ajanjaksojen ajan. Solujen lysaateille tehtiin Western blottaus merkittyjen proteiinien osalta. Kaikki tulokset edustavat vähintään kolmea riippumatonta koetta. Katso myös Lisäviikunat. 8 ja 9
CEACAM5: n ylituotanto edistää metastasoitunutta kasvua ja vähentää EMT: tä in vivo
EMT: hen liittyy solujen proliferaation väheneminen.19 niinpä CEACAM5: n kyky estää EMT: tä ehdotti, että se voi toimia kasvaimen kasvun edistämiseksi metastaattisissa paikoissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi vastaanottajahiirien häntäsuoniin ruiskutettiin CEACAM5: n tai GFP: n (kontrollin) ylituotantoon suunniteltuja bc3_a2-soluja, joiden avulla seurattiin CEACAM5: n ylituotannon vaikutuksia keuhkojen kasvaimen kasvuun. CEACAM5: n yliekspressio johti kasvainkasvun lisääntymiseen keuhkoissa (Kuva. 5a ja täydentävä Kuva. 10a), vimentiinin vähentynyt ilmentyminen proteiinitasolla (täydentävä Kuva. 10b), ja P38: n fosforylaation väheneminen (Kuva. 5d, e). Ceacam5-tason vähentäminen bc3_a2: ssa kahdella eri shrnalla (Kuva. 5b) oli päinvastainen vaikutus, että transduced solut kasvoivat hitaammin keuhkoissa kuin verrokkisolut jälkeen hännän laskimoon injektion (Kuva. 5c ja täydentävä Kuva. 10 C). Lisäksi CEACAM5: n tyrmäys lisäsi leesion määrää, mutta pienensi leesion kokoa(täydentävä Kuva. 10d, e). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CEACAM5-äänenvaimennus edistää EMT: n ja kasvainsolujen ekstravasaatiota estäen samalla metastasoitunutta kasvua.
CEACAM5: n ilmentyminen edistää keuhkometastaasien kasvua. hiirten häntäsuoniin ruiskutettiin BC3_A2-soluja, jotka tuottivat liikaa CEACAM5: tä tai GFP: tä. BLI: tä käytettiin hiirten keuhkojen fotonivuon kvantifioimiseen ilmoitettuina ajankohtina. Pari t-testi, p = 0, 03. Virhetangot edustavat biologisten rinnakkaisnäytteiden SEM: ää (N = 5 hiirtä ryhmää kohti). b bc3_a2 cells expressing control shRNA (shLuc) or two different shrna (#3 ja #5) specific for CEACAM5 was subject to QRT-PCR to monitoring CEACAM5 expression. Virhetangot edustavat teknisten kolmikappaleiden SEM: ää. KS.myös täydentävä Kuva. 10. hiirten häntäsuoniin ruiskutettiin C bc3_a2-soluja, jotka ilmentivät shLuc: ta tai kahta eri CEACAM5-shrnaa. BLI: tä käytettiin hiirten keuhkojen fotonivuon kvantifioimiseen ilmoitettuina ajankohtina. Parilliset t-testit, p=0, 01 Sh#3: lle ja p < 0, 001 Sh#5: lle. Tiedot normalisoitiin alkuperäiseen aikapisteeseen, ja ne esitetään loki-asteikolla. Virhetangot edustavat biologisten rinnakkaisnäytteiden SEM: ää (N = 5 hiirtä ryhmää kohti). d bc3_a2-soluja, jotka tuottavat liikaa CEACAM5: tä, ruiskutettiin hiirten pyrstösuoniin, ja keuhkot eristettiin ja niille altistettiin IHC: tä osoitetuilla vasta-aineilla. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. e solut, jotka värjäytyivät positiivisiksi ceacam5: n, vimentinin tai p-p38: n suhteen paneelissa d esitetyissä kudosjaksoissa, kvantitoitiin Vectra 3.0-kuvausjärjestelmän avulla. Pariksi t-testit, P = 0, 0008 ceacam5, p = 0, 03 vimentin, ja p = 0, 03 P-p38. Virhetangot edustavat vähintään kolmen itsenäisen biologisen toisinnon SEM: ää. F-RNA eristettiin BC3_A2-soluista, jotka tuottivat liikaa CEACAM5: tä tai GFP: tä ja viljeltiin joko in vitro tai eristettiin keuhkoista häntälaskimoon injisoinnin jälkeen (In vivo, A, d), ja sille tehtiin GSEA-reittianalyysi (kaksi vasenta saraketta). Top 5 down-regulated (sininen) ja top 5 up-regulated (punainen) prosessit on esitetty. Ruuduissa FDR <0.1 tilastolliselle merkitsevyydelle. NES (normalized enricasting score). Näiden reittien merkitys P0-ja P2-MFP-kasvaimissa vs. vastaavat keuhkojen etäpesäkkeet on esitetty vertailua varten (kaksi oikein saraketta). Tiedot esitetään biologisista kolminaisuuksista. KS.myös täydentävä Kuva. 11
seurataan, miten CEACAM5-impaktigeenin ekspressiota, BC3_A2-soluja, jotka on suunniteltu tuottamaan liikaa CEACAM5: tä tai GFP: tä, viljeltiin in vitro tai eristettiin keuhkoista pyrstölaskimoruiskutuksen jälkeen (In vivo). RNA eristettiin ja sille tehtiin rnaseq. Differentiaaligeenin ekspressioanalyysi tehtiin, ja GSEA tunnisti EMT: n ainoaksi syövän tunnusmerkiksi reitiksi, jota CEACAM5: n ylituotanto vähensi merkittävästi sekä in vitro että In vivo (Kuva. 5f, täydentävä Kuva. 11). Tämä tulos on samanlainen kuin P0-ja P2-keuhkometastaaseissa (viikunat. 1c, 5f). Kollektiivisesti nämä tiedot osoittivat, että ceacam5: n ilmentymisen säätely metastaattisissa leesioissa indusoi ja parantaa metastaattisen kasvainsolujen kasvua sekundaarisissa sivustoissa.
CEACAM5: n ilmentymistä on lisätty rintasyöpäpotilaiden metastasoituneissa leesioissa
seuraavaksi CEACAM5: n ilmentymistä arvioitiin rintasyöpäpotilaiden metastasoituneissa leesioissa ja rintojen kasvainkudoksessa. IHC värjäys hyväksytty kudos joukko koostuu primaarikasvaimen ja keuhkojen etäpesäke potilaan rintasyöpä (täydentävä Taulukko 3) paljasti korkeampi CEACAM5 tasot keuhkojen etäpesäke suhteessa ensisijainen rintasyöpä (Kuva. 6a ja täydentävä Kuva. 12 A). Näiden analyysien laajentamiseksi kudosmikroarray (TMA) koostuu 25 rintasyöpäpotilaan keuhkometastaaseista (täydentäviä viikunoita. 12B, c ja täydentävä Taulukko 3) värjättiin CEACAM5: lle (täydentävä Kuva. 12b), ja värjäysvoimakkuudelle annettiin pisteet (Kuva. 6b). Tätä pisteytysmenetelmää sovellettiin myös TMA: han Human Protein Atlas: sta, joka koostuu ihmisen rintakasvaimista, jotka värjätään CEACAM5: lle. 32 suurin osa keuhkometastaaseista ilmaisi korkeita CEACAM5-pitoisuuksia (Kuva. 6c) verrattuna rintakasvaimiin (Kuva. 6d), mikä osoittaa, että CEACAM5 oli suurempi metastaattisissa leesioissa verrattuna ensisijaisiin rintakasvaimiin.
CEACAM5-proteiinipitoisuudet ovat koholla rintasyöpäpotilaiden metastasoituneissa leesioissa, ja ne korreloivat kääntäen vimentiinin ilmentymisen kanssa. a rintasyöpäpotilaan primäärikasvain ja vastaava keuhkojen etäpesäke altistettiin IHC: lle CEACAM5-pitoisuuden seuraamiseksi. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. b 25 rintasyöpäpotilaan keuhkometastaaseista koostuvalle tuumorikudosmikroarraylle (TMA) tehtiin IHC: lle CEACAM5-spesifinen vasta-aine, ja värjäysintensiteetti mitattiin. Edustavia kuvia näytetään. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. c kohdan b pisteytysjärjestelmää sovellettiin TMA: han, joka koostui 25 rintasyöpäpotilaan keuhkometastaaseista, suhteellisten CEACAM5-pitoisuuksien arvioimiseksi. d pisteytysjärjestelmä B sovellettiin TMA alkaen Human Protein Atlas koostuu 25 ensisijainen rintojen kasvaimia arvioida suhteellinen CEACAM5 tasot. e rintasyöpäpotilaan (A: sta) primaarikasvain ja vastaava keuhkojen etäpesäke värjättiin yhdessä CEACAM5: lle ja vimentinille ja analysoitiin immunofluoresenssimikroskopialla. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. F solut, jotka värjäytyivät positiivisiksi CEACAM5: n, vimentinin tai molempien osalta E: ssä esitetyissä kudososissa, kvantitoitiin Vectra 3.0-kuvausjärjestelmän avulla. g TMA, joka koostui 25 rintasyöpäpotilaan keuhkometastaaseista, värjättiin samanaikaisesti CEACAM5: n ja vimentiinin osalta ja analysoitiin immunofluoresenssimikroskopialla. Edustavia kuvia näytetään. Asteikkotangot osoittavat 100 µm. h-solut, jotka värjäytyivät positiivisiksi CEACAM5: n, vimentinin tai molempien osalta G: ssä esitetyissä kudosjaksoissa, kvantitoitiin Vectra 3.0-kuvausjärjestelmän avulla. KS.myös täydentävä Kuva. 12
seuraavaksi arvioimme sopivan kudossarjan CEACAM5: n ja vimentinin yhteisekspressioon. Ceacam5: n ja vimentinin samanaikainen värjäys paljasti korkeammat CEACAM5: n tasot keuhkojen etäpesäkkeessä verrattuna vastaavaan rintakasvaimeen, ja vimentin kohdalla havaittiin Käänteinen värjäyskuvio (Kuva. 6 e, f). Lisäksi pienessä kasvainsolupopulaatiossa esiintyi sekä CEACAM5: n että vimentinin (Kuva. 6 f). Molempien proteiinien osalta positiivisiksi värjäytyneet solut voivat edustaa EMT/MET-hybriditilassa olevia soluja.TMA, joka koostui 25 rintasyöpäpotilaan keuhkometastaaseista, osoitti myös käänteisen korrelaation CEACAM5: n ja vimentiinin värjäyksen välillä (Kuva. 6g, h; täydentäviä viikunoita. 12a-e). Nämä tulokset vahvistivat TNBC: n PDX-malleilla tehdyt johtopäätökset ja osoittivat, että CEACAM5: n ilmentyminen korreloi kääntäen vimentinin ilmentymisen kanssa ensisijaisissa rintakasvaimissa ja metastaattisissa leesioissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CEACAM5 edistää met: tä kasvaimen kasvun helpottamiseksi metastaattisissa paikoissa (täydentävä Kuva 12a, b).
